全 文 ：书收稿日期:2012-09-13; 修订日期:2012-11-20
基金项目:泸州医学院青年基金( No． 12067)
作者简介:冯 健( 1982-) ，男( 汉族) ，重庆人，现任泸州医学院附属医院
住院医师，博士学位，主要从事心血管疾病基础与临床研究工作．
齐墩果酸抑制血管紧张素Ⅱ诱导的
心肌成纤维细胞转化生长因子 β1 分泌的实验研究
冯 健，李家富，范忠才，王帅奇
(泸州医学院附属医院，四川 泸州 646000)
摘要:目的 探讨齐墩果酸( OA) 对血管紧张素Ⅱ( Ang Ⅱ) 诱导心肌成纤维细胞( CFs) 分泌转化生长因子 β1 ( TGF － β1 )
的影响。方法 采用胰酶消化法及差速贴壁法培养大鼠 CFs，建立 Ang Ⅱ诱导的大鼠心肌间质纤维化体外模型，采用MTT
法检测各组 CFs增殖活性，酶联免疫吸附法( ELISA) 检测各组 CFs上清液中 TGF － β1 水平。结果 与对照组比较，Ang Ⅱ
组 CFs增殖活性及分泌 TGF － β1 水平明显增加( P ＜ 0． 05) ; 60，100 μmol /L OA组 CFs增殖活性及分泌 TGF － β1 水平较
Ang Ⅱ组明显降低( P ＜ 0． 05) 。结论 OA能抑制 Ang Ⅱ诱导的 CFs增殖，其机制可能与抑制 TGF － β1 分泌有关。
关键词:齐墩果酸; 血管紧张素Ⅱ; 转化生长因子 β1 ; 心肌成纤维细胞
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 01． 066
中图分类号:Ｒ962 文献标识码:B 文章编号:1008-0805( 2013) 01-0151-01
齐墩果酸(Oleanolic acid，OA)是从天然植物中提取出来的
五环三萜类化合物，在我国，齐墩果酸主要被用于急慢性肝炎的
治疗。目前，研究表明，OA除对肝脏有保护作用外，在心血管系
统也发挥着广泛的生物学效应，如降低血脂，延缓动脉粥样硬化，
降血糖等作用［1］。本实验以体外培养的乳大鼠心肌成纤维细胞
(Cardiac fibroblasts，CFs)为研究对象，观察 OA和(或)血管紧张
素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)干预下 CFs 增殖活性及 TGF － β1
分泌变化，为 OA防治心肌间质纤维化提供实验依据。
1 材料与方法
1． 1 动物及试剂 清洁级 1 ～ 3 天 Sprague － Dawley(SD)大鼠(雌
雄不拘)由第三军医大学实验动物中心提供。OA及 Ang Ⅱ购自
美国 Sigma公司;DMEM培养基、胎牛血清购自美国 Gibco公司;
四甲基偶氮唑盐(MTT)、胰蛋白酶购自碧云天生物有限公司;大
鼠转化生长因子 β1ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限
公司;余试剂为进口分装或国产分析纯。
1． 2 心肌成纤维细胞原代培养与鉴定 无菌条件下在超净台内
将 SD乳大鼠，开胸取出心脏，经 PBS冲洗去掉残血后剪成 1 mm3
小块，采用差速贴壁法分离培养出 CFs，经倒置相差显微镜形态
学观察和免疫组化波形蛋白染色鉴定为 CFs，3 ～ 4 代细胞用于后
续实验。
1． 3 分组 ①对照组:不加特殊处理因素;② Ang Ⅱ组:Ang Ⅱ
10 －7mol /L培养;③ 60 μmol /L OA组:60 μmol /L OA + 10 －7mol /
L Ang Ⅱ;④80 μmol /L OA组:80 μmol /L OA + 10 －7 mol /L Ang
Ⅱ;⑤ 100 μmol /L OA组:100 μmol /L OA + 10 －7mol /L Ang Ⅱ。
1． 4 MTT法检测细胞增殖活性 将干预后的 CFs 制成细胞悬
液，接种于 96 孔板内，每孔加入 20 μl MTT 溶液，在 37℃，5%
CO2 孵箱内继续孵育 4 h，取出细胞并小心吸掉各孔上清液，然后
加入 150 μl DMSO，避光振荡 10 min，让结晶物质充分溶解。在
酶标仪 490 nm处测定各孔吸光度值(A值)。
1． 5 ELISA法检测 TGF － β1 表达 将细胞干预后，吸取细胞上
清液按照试剂盒说明进行，在酶标仪 450nm 波长处检测吸光度
值，绘制标准曲线，测出 TGF － β1 浓度。
1． 6 统计学处理 所有数据用均采用 SPSS13． 0 软件进行分析，
实验数据以 珋x ± s表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，两
两比较用 LSD法，以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 OA对 Ang Ⅱ诱导的 CFs增殖活性的影响 与对照组比较，
10 －7 mol /L Ang Ⅱ明显促进 CFs增殖(P ＜ 0． 05) ;与 Ang Ⅱ组比
较，60 μmol /L OA 组 CFs 增殖活性无明显差异，但有下降趋势。
80、100 μmol /L OA组 CFs增殖活性均较 Ang Ⅱ组明显降低(P ＜
0． 05)。结果见表 1。
2． 2 OA对 Ang Ⅱ诱导的 CFs 分泌 TGF － β1 的影响 与对照组
相比，Ang Ⅱ干预后，CFs分泌 TGF － β1 显著增加(P ＜ 0． 05) ;与
Ang Ⅱ组相比，60 μmol /L OA组 TGF － β1 水平无明显差异，但呈
下降趋势;80、100 μmol /L OA 组 CFs 分泌 TGF － β1 水平均较
Ang Ⅱ组明显降低(P ＜ 0． 05)。结果见表 1。
表 1 OA对 Ang Ⅱ诱导的 CFs增殖活性及 TGF － β1 分泌的影响
(珋x ± s)
组别 A值 TGF － β1 /pg·ml －1
对照 0． 226 ± 0． 011 208． 17 ± 15． 98
Ang Ⅱ 0． 355 ± 0． 014* 379． 00 ± 8． 83*
60 μmol /L OA 0． 342 ± 0． 013 359． 83 ± 27． 68
80 μmol /L OA 0． 307 ± 0． 010# 280． 67 ± 19． 24#
100 μmol /L OA 0． 266 ± 0． 015# 227． 50 ± 18． 89#
与对照组比较，* P ＜ 0． 05;与 Ang Ⅱ组比较，#P ＜ 0． 05;n = 6
3 讨论
CFs是心肌间质的重要细胞成分，其分泌的 TGF － β 及受
TGF － β调节的细胞外基质参与了心肌间质纤维化。肾素 －血
管紧张素系统(Ｒenin － angiotensin，ＲAS)参与了心肌纤维化的应
答，在心肌重塑过程中起着重要的调控作用［2］。Ang Ⅱ是 ＲAS
的主要活性物质，Ang Ⅱ致心肌纤维化是通过其 I 型受体刺激
CFs中 TGF － β表达，TGF － β通过旁分泌和自分泌形式刺激 CFs
增殖，从而导致心肌间质纤维化［3］。大量研究表明，TGF － β 是
目前最强的致纤维化因子，其过度表达在纤维化机制中起关键作
用［4］，因此，抑制心肌中 TGF － β 可能是抗心肌间质纤维化的重
要靶点［5］。
本实验以 SD大鼠 CFs为研究对象，给予 10 －7 mol /L AngⅡ能
诱导 CFs分泌 TGF － β1，同时 CFs增殖活性增加。提示 AngⅡ可能
通过 TGF － β1 上调表达，促进 CFs 增殖，这与既往的研究结果相
符合。OA是属于齐墩果烷型五环三萜类化合物，以游离糖苷或酸
的形式存在于天然产物中。国内外研究显示，OA具有降低血压、
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 1 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 1 期
书抗动脉粥样硬化、改善胰岛素抵抗等多种心血管药理作用。本研
究结果表明，不同浓度 OA预处理后，AngⅡ诱导 CFs分泌 TGF － β1
水平明显下降，同时 CFs增殖活性显著降低。提示 OA能抑制 Ang
Ⅱ诱导的 CFs增殖，其机制可能与抑制 TGF － β1 表达有关。在 60
～100 μmol /L浓度范围内，CFs增殖活性及 TGF － β1 分泌呈下降
趋势，说明 OA的抑制作用具有浓度依赖性。
综上所述，OA 可以通过抑制 CFs 增殖及 TGF － β1 分泌，提
示 OA抑制 CFs增殖可能与其抑制促纤维化因子的分泌，如 TGF
－ β1 有关，但其具体的机制如何有待进一步研究。
参考文献:
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杂志，2008，28(23) :2031．
［2］ Lijnen PJ，Petrov VV． Ｒole of intracardiac renin － angiotensin － aldo －
sterone system in extracellular matrix remodeling［J］． Methods Find
Exp Clin Pharmacol，2003，25(7) :541．
［3］ 张新金，马业新，文 渊，等． 促红细胞生成素抑制血管紧张素 II
诱导的大鼠心脏成纤维细胞中转化生长因子 β1 和胶原的表达
［J］． 中华心血管病杂志，2008，36(7) :636．
［4］ 冯 健，李 丽，李家富． 血管紧张素 －(1 － 7)对 TGF － β1 诱导
的大鼠心肌成纤维细胞 Smad3、Smad7mＲNA表达的影响［J］． 泸州
医学院学报，2009，32(4) :344．
［5］ Bujak M，Frangogiannis NG． The role of TGF － β signaling in myocar-
dial infarction and cardiac remodeling［J］． Cardiovasc Ｒes，2007，74
(2) :184．
收稿日期:2012-05-14; 修订日期:2012-10-15
作者简介:常正尧( 1976-) ，男( 汉族) ，山东青岛人，现任泰山医学院生物科
学研究院讲师，硕士学位，主要从事中药抗肿瘤作用分子机制研究工作．
* 通讯作者简介:齐 冰( 1977-) ，女( 汉族) ，山东济宁人，现任泰山医学
院生物科学学院副教授，博士学位，主要从事中药抗瘤作用机制和早期胚
胎发育研究工作．
珊瑚菌抗乳腺癌作用的研究
常正尧，吴亚楠，李永芳，郭 淼，赵 静，刘京昇，李效良，齐 冰*
(泰山医学院，生物科学学院，山东 泰安 271016)
摘要:目的 探讨珊瑚菌对乳腺癌细胞的抑制作用。方法 通过对乳腺癌细胞的培养，确定细胞的生长曲线和最适检测时
间，取对数生长期的细胞，用含有不同浓度珊瑚菌粗提物的细胞培养液来培养细胞，MTT 法检测珊瑚菌对乳腺癌细胞的
抑制率。结果 珊瑚菌的浓度在 0． 010 3 g /ml到 0． 072 1 g /ml之间时，随着珊瑚菌浓度的增大，抑制率逐渐增大。当珊瑚
菌的浓度在 0． 082 4 g /ml时，抑制率下降。当珊瑚菌的浓度在 0． 0721 g /ml 时有最大抑制率。结论 珊瑚菌的水煎剂对
体外培养的乳腺癌细胞株有明显的抑制作用，是抗乳腺癌的良好药物。
关键词:乳腺癌; MCF － 7; 珊瑚菌; MTT法
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 01． 067
中图分类号:Ｒ285 文献标识码:B 文章编号:1008-0805( 2013) 01-0152-03
乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，具有发病率高，颇
具侵袭性，但病程进展缓慢，自然生存期长等特点［1］，属于中医
学乳瘤“化岩”等范畴。
针对乳腺癌的治疗，西医主要用手术、化疗、放疗来治疗。中
医主要是采用一些中药疏肝理气，活血化淤，扶正固本，温阳补
肾，驱毒排毒等方法来进行辅助治疗［2］。虽然目前有报道表明
几类中药(影响免疫功能的中药、抗肿瘤的中药、对放化疗减毒
增效的中药、调节内分泌的中药、调节肿瘤复发和转移的中药)
和一些方剂(调神攻坚汤、加味逍遥散、紫根牡蛎汤、芪苡汤)可
以用于乳腺癌的临床治疗，但是这些抗乳腺癌药物的有效成分以
及中药抗肿瘤的分子作用机制等的研究还鲜有报道［3 ～ 6］。
珊瑚菌又名“扫帚菌”，含有多种对人体有益的碳水化合物
和微量元素。具有和胃现气、祛风、破血缓中等作用，对癌具有抑
制作用，但对乳腺癌的抑制作用没有报道，本实验采用 MTT法检
测珊瑚菌对乳腺癌细胞的抑制率。
1 材料
人乳腺癌细胞株(MCF － 7) ，购于南京凯基生物科技发展
有限公司。珊瑚菌，泰山医学院药学院提供。改良型 ＲPMI －
1640 培养基，赛默飞世尔生化制品(北京)有限公司。胎牛血
清，杭州四季青生物工程材料有限公司。DMSO，天津市东天
精细化学试剂厂。MTT，scientific research special。其它常用
试剂为国产分析纯。
2 方法
2． 1 胰蛋白酶的配制 准确称取胰蛋白酶 0． 25 g，用 100 ml磷酸
缓冲液(PBS)溶解，然后用 0． 22μm 滤膜过滤除菌，－ 20℃保存
备用。
2． 2 MTT溶液的配制方法 称取 MTT 0． 5 g，溶于 100 ml的磷酸
缓冲液(PBS)中，即终浓度为 5mg /ml，0． 22μm 的微孔滤膜过滤
除菌，4℃避光保存。
2． 3 细胞的培养和观察 人乳腺癌细胞株 MCF － 7 在含 10%胎
牛血清，1%双抗的 ＲPMI － 1640 培养液中，置 37℃，5% CO2 的饱
和湿度培养箱中培养。待细胞生长呈单层铺满瓶底时，用0． 25%
胰蛋白酶消化传代，大约 2 到 3 天传代一次，每天在倒置显微镜
下观察细胞生长情况。
2． 4 MTT法测细胞生长曲线
2． 4． 1 接种细胞 用含 10%胎小牛血清的培养液配成单个细
胞悬液，以每孔 1 000 ～ 10 000 个细胞接种到 96 孔板，每孔体
积 200 μl。
2． 4． 2 培养细胞 在含 10%胎牛血清，1%双抗的 ＲPMI － 1640
培养液中，置 37℃，5%CO2 的饱和湿度培养箱中培养。
2． 4． 3 呈色 培养一定时间后后，每孔加 MTT 溶液(5mg /ml
用 PBS配制，pH = 7． 4)20μl，继续孵育 4 h，终止培养，小心吸
弃孔内培养上清液，每孔加 150μl DMSO，振荡 10min，使结晶
物充分融解。
2． 4． 4 比色 选择 490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔
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时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 1 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 1