全 文 ：三叶青乙酸乙酯提取物对结肠癌 HT29 细胞
皮下移植瘤的诱导凋亡作用
林 霜1，钟良瑞1，魏克民2
(1 浙江省立同德医院·浙江 杭州 310012;2 浙江省中医药研究院·浙江 杭州 310007)
摘 要 目的:观察三叶青乙酸乙酯提取物对结肠癌 HT29 细胞皮下移植瘤的诱导凋亡作用，探讨其可
能的作用机制，为三叶青在临床上应用于结肠癌的治疗提供实验依据。方法:以 HT － 29 结肠癌细胞荷
瘤裸鼠为模型。实验分 5 组，模型组、阳性对照组及三叶青提取物低、中、高剂量组，各组裸鼠给予相应药
物或生理盐水灌胃 14 d。观察各组裸鼠的一般情况，以及对 HT29 细胞皮下移植瘤的抑瘤率;HE染色后
观察肿瘤组织细胞形态学改变，免疫组织化学方法检测瘤组织内 Caspase － 3 的蛋白表达水平。结果:三
叶青提取物中、高剂量组及阳性组瘤重较模型组减轻(P ＜ 0. 05) ，阳性组瘤重最轻;中药各组随着剂量的
增加，抑瘤率上升。与模型对照组比较，各给药组荷瘤鼠瘤细胞凋亡程度增强;三叶青提取物中、高剂量
组瘤组织 Caspase － 3 蛋白表达水平显著上调。结论:三叶青乙酸乙酯提取物可抑制结肠癌 HT29 细胞皮
下移植瘤的生长，作用机制之一为上调 Caspase － 3 蛋白的表达，诱导结肠癌 HT29 细胞皮下移植瘤凋亡。
关键词 结肠肿瘤;@三叶青提取物;细胞凋亡;Balh /c － nu裸鼠
Apoptosis － inducing Effect of Ethylacetate Extracts of Sanyeqing (Tetrastigma Hemsleyanum )
on Colorectal Cancer Cell HT29 Subcutaneous Transplanted Tumor
LIN Shuang1，ZHONG Liangrui1，WEI Kemin2
(1Tongde Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou，Zhejiang 310012;
2 Zhejiang Academy of Chinese Medicine，Hangzhou，Zhejiang 210007)
ABSTＲACT Objective:To study the apoptosis － inducing effect of Ethylacetate extracts of Tetrastigma hems-
leyanum on colorectal cancer cell HT29 subcutaneous transplanted tumor and then to explore the possible mecha-
nism and provide the experimental basis for tumor therapy with Tetrastigma hemsleyanum. Methods:Nude mice
bearing colorectal cancer with HT29 cells were selected as models. Experiment was divided into 5 groups，mod-
el，positive(5 － Fu)and low，middle ，high dose Tetrastigma hemsleyanum extract groups，nude mice in each
group were given the corresponding medicine or saline for 14 days，then the general situation of each groups，was
observed and the tumor inhibition rate on HT29 cells subcutaneous transplantation tumor was calculated;morpho-
logic changes of tumor tissue cells in each groups were observed by HE stained，Caspase － 3 protein expression
in tumor tissue was determined by immunohistochemical method. Ｒesults:The tumor weight of middle ，high dose
Tetrastigma hemsleyanum groups and 5 － Fu group was lighter than that in model group mice(P ＜ 0. 05) ，the
tumor weight of positive group was the lightest;the tumor inhibition rate of the three Tetrastigma hemsleyanum ex-
tract groups was raised with increasing of dosage. The apoptosis degree in each medicine group was obvious to
compare with model group by observing the morphologic changes of tumor cells. The Caspase － 3 expression of HT
－ 29 tumor － bearing nude mice in middle and high dose Tetrastigma hemsleyanum extract groups was signifi-
cantly up － regulated to compare with model group. Conclusion:Tetrastigma hemsleyanum ethylacetate extract
can inhibit the growth of colon cancer HT29 cells subcutaneously transplanted tumor;up － regulating Caspase －
3 protein expression and inducing HT29 cells appoptosis was one of the mechanism．
Key words:colonic cancer;Tetrastigma Hemsleyanum Extract;apoptosis of cell;Balh /c － nu nude mouse
基金项目:浙江省自然科学基金项目(LQ15H290006) ;浙江省名老中
医传承工作室建设计划项目(GZS2012004)
通讯作者:魏克民，E － mail:wkm Cyzy@ 163． com
三叶青为葡萄科崖爬藤属植物，以块根或全草入药，性
凉，叶微苦辛，具有清热解毒、祛风化痰、活血镇痛等功效。
(功效、性味等说明)用于治疗高热惊厥、肺炎、咽痛、哮喘、
风湿、肝炎、月经不调、痈疔疮疖、瘰疬及恶性肿瘤，均具有很
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好的疗效［1］。有研究证实三叶青提取物具有增强细胞免疫
和体液免疫［2］、抑制肿瘤细胞生长［3］及激活机体的抗氧化
活性等作用［3］。结肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，其
发病率逐年上升，严重威胁着人类的健康。近年来中医药抗
肿瘤作用越来越受到关注和重视，许多学者在中医药抑制肿
瘤生长、提高机体免疫功能、防止肿瘤转移等方面进行了一
定探讨，取得了一定研究成果。本实验通过对不同剂量的三
叶青乙酸乙酯提取物对 HT － 29 细胞皮下移植瘤诱导凋亡
作用的研究，为三叶青用于结肠癌的治疗提供一定的实验
依据。
1 材料
1. 1 药物
三叶青饮片:购自浙江省中医药研究院;三叶青乙酸乙
酯提取物:将三叶青饮片，添加乙酸乙酯，提取 3 次;合并提
取液，回收乙酸乙酯后(50 g /mL) ，放置于冰箱中保存备
用［4］;临用时将三叶青乙酸乙酯提取物用无菌蒸馏水按 0. 2
mL /20 g等容量不等浓度配制成为三叶青低、中、高剂量 3
个相应浓度［5 － 6］;药物由浙江省中医药研究院中药新药研发
重点实验室提取制备。5 －氟脲嘧啶(5 － Fu) :天津金耀氨
基酸有限公司产品。
1. 2 动物
Balb /c － nu裸鼠，4 ～ 6 周龄，50 只，体质量(20 ± 2)g，
购自上海斯莱克动物公司，许可证号:SCXK(沪)2012 －
0002。裸鼠在浙江省中医药研究院实验室，无特定病原体
SPF级动物房饲养，温度 21 ～ 25℃，湿度 45% ～ 55%。HT －
29 结肠癌荷瘤裸鼠 3 只，由浙江中医药大学动物实验室
提供。
1. 3 主要试剂
5 －氟脲嘧啶(5 － Fu) :天津金耀氨基酸有限公司产品;
Caspase － 3 抗人单克隆抗体及相应二抗:美国 CST 公司;
TUNEL试剂盒:Ｒoche公司。
1. 4 主要仪器
H4 － 2000 倒置荧光显微镜:日本 Olympus 公司;光学显
微镜:日本 Olympus公司;HEPA CLASS100 型细胞 CO2 培养
箱:美国 Thermo公司;KX －21 血细胞自动分析仪:日本西森
美康公司。
2 方法
2. 1 模型制备
取接种 HT － 29 结肠癌细胞 10 ～ 14 d的荷瘤裸鼠 3 只，
予颈椎脱臼处死，在无菌条件下剥取瘤组织，剥离血管及黏
附的其他组织，在无菌平皿中剪碎，放置于组织研磨器中加
4℃生理盐水，轻轻研磨经 200 目筛网过滤，制成瘤细胞悬
液，0. 4%台盼蓝计数，细胞活性大于 95%，并调整细胞浓度
为 1 × 107·mL －1［7］。取 0. 2 mL 制备的瘤细胞混悬液接种
于裸鼠右前肢腋窝皮下，操作在 1 h内完成。
2. 2 动物分组及给药
裸鼠皮下接种 24 h 后，将裸鼠根据随机数字表进行完
全随机分组，分为模型对照组、阳性对照组及三叶青低剂量
组、三叶青中剂量组、三叶青高剂量组，每组 10 只。阳性组:
5 － FU(20 mg /kg 体质量)腹腔注射给药，连续 5 d 后停
药［8 － 9］;三叶青 3 剂量组:用配制好的三叶青提取物，按 5、
15、25 g /kg 剂量，每 d灌胃给药，每只 0. 2 mL，连续给药 14
d;模型对照组每 d灌服相同体积的生理盐水，连续 14 d。
2. 3 观察指标及检测
2. 3. 1 一般情况 造模后、实验过程中以及处死前均定期
测量实验裸鼠的体质量，记录差值，并观察裸鼠每 d 的生存
状态、摄食情况、活动情况、大便及皮肤情况。
2. 3. 2 瘤重及抑瘤率 末次给药 24 h 后，裸鼠颈椎脱臼处
死，剥离出瘤体，称量瘤重(g) ，并计算抑瘤率。抑瘤率 =(C
－ T)/C × 80%，T为各处理组平均瘤重，C 为模型对照组平
均瘤重。
2. 3. 3 瘤组织病理学观察 瘤体经 10%甲醛固定后，脱
水，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜下观察。
2. 3. 4 瘤组织 Caspase － 3 蛋白表达的测定 免疫组化方法
检测。瘤体经包埋、切片后，分别行免疫组化 Caspase － 3 染
色，具体步骤按试剂盒说明进行。
2. 4 统计学处理
采用 SPSS16. 0 软件包进行数据的统计学处理，计量资
料用均数 ±标准差(x ± s)表示，样本符合正态分布且方差齐
性时，组间比较采用单因素方差分析，LSD － t 检验，两两比
较采用 S － N － K q检验法;不符合正态分布和方差齐性时，
组间比较采用 Kruskal － Wallis 秩和检验。以 P ＜ 0. 05 为差
异有统计学意义。
3 结果
3. 1 各组裸鼠一般情况及体质量的变化
各组裸鼠造模均成功。在接种瘤细胞悬液后前 3 d，各
组裸鼠一般状况无明显差异，均反应灵敏，进食良好，皮肤
亮泽。自接种第 4 d开始，裸鼠右腋下接种部位可触及米粒
大小的硬结，肿块生长较迅速，裸鼠逐渐出现懒动，进食减
少，反应迟滞，肤色黯淡;以模型组最早触及瘤块且生长最
快，上述反应最明显。三叶青各治疗组裸鼠瘤块生长的情
况均不及模型对照组。5 － Fu组裸鼠在腹腔注射 5 － Fu 后，
状况明显不及模型对照组，裸鼠出现肤色黯淡，少动，食少，
并见稀便。
表 1 各组裸鼠体质量变化(x ± s，g)
组别
动物数
(只)
体质量
处理前 处理后
体质量变化
模型对照组 10 18. 04 ±0. 22 22. 40 ±0. 90 4. 36 ±0. 94△
5 － Fu组 9 18. 02 ±0. 23 19. 34 ±0. 67 1. 32 ±0. 76*
三叶青低剂量组 10 18. 05 ±0. 38 22. 83 ±0. 99 4. 65 ±0. 81△
三叶青中剂量组 10 18. 12 ±0. 78 22. 25 ±0. 98 4. 03 ±0. 42△
三叶青高剂量组 10 17. 92 ±0. 64 22. 10 ±0. 54 4. 18 ±0. 75△
与模型对照组比较* P ＜ 0. 05;与 5 － Fu组比较△P ＜ 0. 05
3. 2 各组裸鼠 HT29 瘤重及抑瘤率的比较
与模型对照组比较，三叶青中、高剂量组和 5 － Fu 组均
能显著降低荷瘤裸鼠的瘤重(P ＜ 0. 05) ;三叶青各剂量组随
着剂量的增加，抑瘤率不断上升;但与 5 － Fu 组比较仍有明
显差异(P ＜ 0. 05)。见表 2
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表 2 各组结肠癌裸鼠瘤重和抑瘤率的比较(x ± s)
组别 动物鼠数(只) 瘤重(g) 抑瘤率(%)
模型对照组 10 2. 09 ± 0. 18
5 － Fu组 9 0. 98 ± 0. 15* 53. 11
三叶青低剂量组 10 1. 92 ± 0. 25△ 8. 13△
三叶青中剂量组 10 1. 64 ± 0. 18＊△ 21. 75△
三叶青高剂量组 10 1. 30 ± 0. 11＊△ 37. 80△
与模型对照组比较* P ＜ 0. 05;与 5 － Fu组比较△P ＜ 0. 05
3. 3 各组裸鼠 HT29 细胞形态学观察 经 HE染色后，显微
镜下见模型对照组移植瘤中心有不同程度的坏死，癌细胞丰
富，中等大小，呈卵圆形、梭形、三角形及不规则形，胞浆较少，
大多数细胞内有一个核，部分细胞内有两个及以上核，核中
等，核膜厚，染色质丰富，染色深，核仁明显且大，有 1 ～ 3 个，
核分裂多见。三叶青组癌组织中心坏死程度减轻，中、高剂量
组更为明显，癌细胞较大，呈圆形、卵圆形，少许呈梭形，胞浆
较丰富，细胞内几乎只有一个核，核偏大，核膜变薄，染色质
少，染色浅，几乎呈空泡状，核仁较明显、较大，大多数只有 1
个核仁，核分裂可见。5 － Fu组癌组织中心坏死程度较重，可
见面积片状坏死，坏死程度较三叶青各组明显。见图 1。
图 1 各组裸鼠瘤组织形态学变化(× 200)
图 2 各组裸鼠瘤组织 Caspase － 3 蛋白表达的免疫组化检测(× 400)
3. 4 各组裸鼠瘤组织 Caspase － 3 蛋白表达水平的免疫组化
检测结果 镜下见阳性细胞呈浅黄色至棕黄色，主要表达在
肿瘤细胞胞浆，棕色的深浅代表 Caspase3 蛋白表达水平，蛋
白表达水平越高，颜色越深。与模型组比较，5 － Fu 组与三
叶青各组 Caspase3 蛋白的表达水平均有明显升高。而 5 －
Fu组棕色浓度最深，Caspase3 蛋白的表达水平最高。三叶
青各组随着剂量的增加，阳性细胞数量越多，棕色浓度加深，
Caspase3 蛋白的表达水平上调。见图 2。
4 讨论
本实验采用了 5 －氟脲嘧啶作为实验的阳性对照，它是
一种结肠癌常用的化疗药物，临床应用时主要毒副反应为消
化道反应、周围血白细胞减少及神经系统毒性等。实验过程
中，观察到模型组及化疗组裸鼠出现进食以及活动减少，皮
肤光泽减弱，精神欠佳，行动迟缓，喜欢聚集。而三叶青各组
状况较好，觅食比较积极，比较活跃，无明显聚集及消瘦等现
象。实验结果示各组裸鼠体质量均有增加，这与自身的生长
和肿瘤生长均有关，模型对照组的肿瘤最重，是其体质量增
加较多的重要原因。实验结果示化疗组的体质量增加最少，
具有统计学意义(P ＜ 0. 05)。表明化疗的不良反应可能引
起裸鼠进食减少、体质量减轻，三叶青可以改善荷瘤裸鼠的
一般状况。
细胞凋亡涉及了细胞形态以及遗传物质和胞内结构等
多方面的改变。细胞凋亡对于多细胞生物的正常发育和维
持是必不可少的，它负责清除生理上不需要的细胞以维持机
体的自我稳定性，并不伤害到整个机体。而且它是在凋亡刺
激信号作用下，激活细胞内部的程序变性和死亡机制，并经
过各种凋亡信号和转导途径协同完成。而肿瘤的发生则是
细胞增殖过度和细胞凋亡相对不足引起的，也可见于细胞增
殖不明显，但细胞凋亡显著减弱时［10］。本实验三叶青中、高
剂量组与模型组比较能显著降低荷瘤裸鼠的瘤重，随着剂量
的增加，抑瘤率不断上升。且 HE 染色结果显示，三叶青各
组凋亡细胞不同程度的增多，三叶青组癌组织中心坏死程度
较模型组减轻，中、高剂量组更为明显，且癌细胞较大。证实
三叶青提取物可以诱导 HT29 细胞凋亡。
Caspase － 3 是调控肿瘤增殖与凋亡的重要调控基因，可
在一定程度上反应抗肿瘤药物的内在机制，有研究证实
Caspase － 3 一旦被激活，细胞的凋亡将不可避免［11］。本研
究发现，经三叶青作用后，裸鼠肿瘤组织的 Caspase － 3 表达
显著高于模型对照组(P ＜ 0. 01) ;提示三叶青的抗癌机制可
能是通过上调 Caspase － 3 蛋白的表达，激活线粒体凋亡途
径来诱导细胞凋亡，但具体通过哪一通路诱导凋亡有待更深
入的研究。
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综上所述，三叶青乙酸乙酯提取物可抑制结肠癌 HT －
29 细胞皮下移植瘤的生长;可上调 caspase － 3 蛋白的表达，
从而诱导结肠癌 HT29 细胞皮下移植瘤凋亡，起到抗肿瘤的
作用。
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临床病理意义［J］. 中国自然医学杂志，2008，3(12) :173 －
175． (收稿日期:2015 － 06 － 20)
基金项目:浙江省中医药科技计划项目(2014ZB033)
通讯作者:胡祝红，zjhzhzhly@ 126. com
黄芩素联合亚高温热疗对人肺腺癌
A549 细胞抑制作用的体外研究
徐李香1，叶会玲2，陈晟茜2，胡祝红2
(1 浙江省绍兴市上虞人民医院·浙江 绍兴 312300;2 浙江省中医院·浙江 杭州 310006)
摘 要 目的:观察黄芩素联合亚高温热疗对人肺腺癌 A549 细胞的体外抑制作用并探讨其可能的作用
机制。方法:以体外培养的肺腺癌 A549 细胞为研究对象，CCK － 8 法检测黄芩素联合亚高温热疗对 A549
细胞增殖的抑制作用，流式细胞仪检测黄芩素联合亚高温热疗对 A549 细胞周期的影响，Western blot 法
检测黄芩素联合亚高温热疗对 A549 细胞 HSP70(热休克蛋白 70)蛋白表达的影响。结果:不同浓度的黄
芩素均能有效地抑制 A549 的细胞增殖，黄芩素联合亚高温热疗具有更好的细胞抑制作用;联合亚高温热
疗处理后，G2 /M期细胞含量明显增加。黄芩素联合亚高温热疗组 A549 细胞的 HSP70 蛋白表达明显降
低，与热疗组比较，差异显著(P ＜ 0. 05)。结论:亚高温热疗能增强黄芩素对 A549 细胞的体外抑制作用。
关键词 @ A549 细胞;黄芩素;@亚高温热疗;体外研究
Study on Inhibition Effect of Baicalein Combined with Mild Hyperthermia on
Proliferation of Lung Adenocarcinoma Cell Line A549 in Vitro
XU Lixiang1，YE Huiling1，CHEN Shengxi2，HU Zhuhong2
(1Shangyu People’s Hospital，Shaoxing ，Zhejiang 312300;2Zhejiang Hospital of Chinese Medicine，Hangzhou ，Zhejiang 310006)
ABSTＲACT Objective:To investigate the inhibition effect of Baicalein combined with mild hyperthermia
(MHT)on proliferation of lung adenocarcinoma cell line A549 and explore the possible mechanism. Methods:
Lung adenocarcinoma cell line A549 cultured in vitro were taken as models，the inhibition effect of Baicalein
combined with mild hyperthermia (MHT)on proliferation of lung adenocarcinoma cell line A549 was detected by
CCK － 8 method，changes of A549 cell cycle were determined by FCM.，the expression of HSP70 protein was de-
tected by Western blot. Ｒesults:The growth of A549 cells was inhibited by Baicalein at different concentration，
the inbihition effect of Baicalein combined with mild
hyperthermia was more significant. . A549 cell cycle
trended to be arrested in the G2 /M phase. The expression
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