全 文 ：川西獐牙菜单体齐墩果酸对胆道结扎所致大鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用
张樑君、李绍雪、封欣婵、高 宇、程 英、陈文生、柴 进 （400038，重庆，第三军医大学西南医院全军消化
病研究所）

[摘要] 目的 建立胆道结扎的大鼠模型，观察川西獐牙菜活性单体齐墩果酸对胆道结扎所致的肝外胆汁淤积的保护作用，
及其对肝细胞膜转运蛋白 Mrp3、核受体 Lrh-1的调控作用。 方法 随机将 15只 SD大鼠分为 3组：假结扎组、胆道结扎组、齐
墩果酸组，每组 5 只。分别用生理盐水、齐墩果酸处理 7d 后，收集组织标本， HE 染色检测肝脏损伤程度， Western blot 及
RT-PCR检测胆汁酸转运蛋白 Mrp3和核转录因子 Lrh-1在蛋白及 mRNA水平的变化。 结果 HE染色结果显示齐墩果酸组肝脏损伤
程度较胆道结扎组明显减轻；在蛋白水平，Western blot 结果表明 BDL+齐墩果酸组肝脏胆汁酸转运蛋白 Mrp3表达较 Sham 组增
加 2.4 倍，同时，核转录因子 Lrh-1 表达增高 1.8 倍；而在 mRNA 水平，RT-PCR 结果显示 BDL+齐墩果酸组肝脏胆汁酸转运蛋白
Mrp3表达较 Sham组增加 3.2倍，同时，核转录因子 Lrh-1表达增高 2.2倍。结论 川西獐牙菜单体齐墩果酸对胆道结扎所致大
鼠胆汁淤积性肝损伤具有保护作用，而这种保护作用可能与核转录因子 Lrh-1及胆汁酸转运蛋白 Mrp3有关。
[关键词] 胆汁淤积；齐墩果酸；多要耐药相关蛋白 3；转录因子
[中图法分类号] R34；R575.5； Q291

Protective Effect of Oleanolic Acid on Common Bile Duct Ligated Induced
Cholestatic Liver Damge in Rats
Zhang Liangjun, Li Shaoxue, Feng Xinchan, Gao Yu, Cheng Ying, Chen Wensheng, Chai Jin（Department of Gastroenterology, Southwest
Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China）

[Abstract] Objective To investigate the hepatic protective effect of Oleanolic acid on common bile duct
ligated induced cholestatic liver damage in rats, and the influence on Mrp3 and Lrh-1. Methoes Randomly divided
15 rats into 3 groups: Sham group, bile duct ligated group and bile duct ligated rats + oleanolic acid and each group
have 5 rats. Treated them with saline and oleanolic for 7 days then collected the liver samples. The degree of liver
injury were tested by HE anlysis and the expression of Mrp3 and Lrh-1 were detected by Western Blot and RT-PCR.
Results HE anlysis showed that the levels of liver injury in bile duct ligated rats + oleanolic acid is loweer than the
other groups. The expression of Mrp3 both in protein and mRNA levels were increased. In the same time, the
expression of Lrh-1was also increased. Conclusion Oleanolic acid protect liver injury from common bile duct
ligated induced cholestatic, which may involves the up-regulation of Mrp3 and Lrh-1.
[Key words] Cholestasis; Oleanolic acid; Mrp3; Lrh-1

Supported by the National Science Foundation of China for the Youth(81100280) and the Key Program of Natural Science Foundation of
Chongqing (CSTC 2012jjB0079). Co-Corresponding author: Chen Wensheng,E-mail:wenshengchen@hotmail.com; Chai Jin, E-mail:
janhic11@163.com

[基金项目] 国家自然科学基金青年基金（81100280); 重庆市科委自然基金重点项目(CSTC2012jjB0079)
[通信作者] 陈文生，E-mail: wenshengchen@hotmail.com
柴 进，E-mail: janhic11@163.com

胆汁淤积是常见的临床综合症，能够直接导致肝 细胞损伤、肝功能衰竭[1-3]。研究表明，胆汁淤积的发
网络出版时间：2014-12-08 13:36
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1095.R.20141208.1336.009.html
生与肝细胞和胆管膜表面膜转运蛋的表达及功能异
常相关[4-5]。MRP3（multidrug resistance-asociated
protein 3, MRP3） 位于肝细胞基底侧膜，属于 ABC
超家族（adenosine triphosphate-binding cassette
transporter superfamily, ABC superfamily），主
要排泌胆汁酸、结合胆红素、雌激素、白三烯和各种
药物[6]。正常条件下，MRP3在肝细胞表面不表达或低
表达，而在胆汁淤积患者的肝组织及胆汁淤积的大鼠
模型中显著高表达[7-8]。唯一得到公认且用于临床治疗
胆汁淤积的药物——熊脱氧胆酸便是通过 NRII 核受
体家族的 FXR和 PXR诱导 MRP3高表达[9]，促进胆汁分
泌从而减轻胆汁酸在肝细胞内的淤积，但其效果有
限，且个体差异性较大。而其他临床常用药物，例如：
利福平、苯巴比妥等都具有不同程度的限制性，效果
不理想，而新药 6α-乙基-鹅脱氧胆酸尚处于临床Ⅲ
期实验。因此，临床亟需有效的治疗胆汁淤积的新药
物。川西獐牙菜为我国传统中草药，更是藏药八宝之
一——藏茵陈的主要的原生植物，具有清热、利胆退
黄之功效，能够促进肝细胞再生、降低谷丙转氨酶的
功效。其主要成分为獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、齐墩果
酸、芒果苷等。多种药物成分共同作用于肝脏往往增
加肝脏负荷，加重肝脏损伤，不利于肝脏功能的恢复。
因此，我们对川西獐牙菜进行提纯并用其中的有效成
分——齐墩果酸干预胆道结扎的大鼠胆汁淤积模型，
通过 HE 染色观察其对肝脏组织的保护作用，并通过
Western blot及 RT-PCR检测大鼠肝脏细胞膜转运蛋
白 Mrp3 及相关核受体的表达变化，进一步评价齐墩
果酸对胆汁淤积的肝脏的保护功能，从而为临床治疗
胆汁淤积提供新的线索。
1 材料与方法
1.1 主要材料
15只雄性 SD大鼠，6～7周龄，体质量 200~220g，
购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动
物中心。川西獐牙菜活性单体齐墩果酸由重庆市中药
研究提供，为 75%乙醇提取后的浸膏，有效终浓度为
50%，使用时用灭菌的生理盐水溶解。RIPA Lysis
Buffer购自 Sigma公司；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制
剂购自 Roche 公司； BCA 蛋白定量试剂盒、
Supersingnal West Femto maximum sensitivity
substrate Kit 购自 Pierce Biotechnology 公司；
TRIzol购自 Invitrogen公司；逆转录试剂盒、蛋白
标准品购自 Fermentus公司；PCR试剂盒购自 TaKaRa
公司；Mrp3、Lrh-1 抗体购自 Abcam 公司；GAPDH 购
自 Epitomics 公司；山羊抗兔、兔抗山羊二抗购自
Pierce公司。引物设计、合成、测序有上海吉凯基因
化学技术有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 胆道结扎的大鼠胆汁淤积模型的建立及处理
15只成年雄性 SD大鼠，给每只小鼠预先用贴标签的
方式，编号 1～15号。然后，制作对应的 1～15号纸
片，捏成球，混匀。不同的 3个人分别抽取 5只，产
生 3组大鼠。分别将这 3组大鼠按组放入鼠笼内，给
鼠笼编号 1～3 号，取走老鼠身上标签。重新制作针
对鼠笼的 1～3 号纸球，混匀后，按实验分组顺序抽
取，每抽取 1组，在对应的鼠笼上写上实验分组的名
称。实验分为 Sham组、BDL组、BDL+齐墩果酸组。称
重后，每 100g体质量给予 1.5mL 0.3%戊巴比妥钠进
行麻醉。75%酒精消毒后，沿腹正中线开腹，暴露胆
总管，用 4-0手术线结扎胆总管 3次后关腹。灭菌的
生理盐水溶解齐墩果酸。BDL+齐墩果酸组采用连续灌
胃 7d，sham 组合 BDL 租采用相同剂量的生理盐水连
续灌胃 7d。7d 后处死大鼠，收集血清、肝脏组织、
肾脏组织，-80℃保存，备用。
1.2.2 HE 染色 新鲜肝脏组织置于冰上，剪成黄
豆粒大小后用 4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片。依次
用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇脱蜡 5min。
苏木精染色 5min，1%盐酸酒精分化 20s后稀氨水泛滥
30s。伊红染色 5min。再先后用 95%乙醇、无水乙醇
处理，紧接着用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ分别
处理 2min。切片用中性树胶封片，显微镜下观察并拍
照。
1.2.3 RT-PCR 按 TRIzol 说明书提取肝脏组织
RNA。将其逆转录为 cDNA后进行 RT-PCR扩增。PCR反
应体系：20μL 体系中 5′端和 3′端引物各 0.4μL
（10μmol/L）、dNTPs 1.6μL（2.5μmol/L）、Template
1μL（10ng/μL）、Taq polymerase 0.2μL、5×Taq
Buffer 4μL、ddH2O 12.4μL，反应条件：94℃ 5min，
94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 2min 30 个循环，72℃
10min。引物序列如下。
表 1 PCR引物序列
基因 引物 序列(5′-3′) 长度(bp)
Mrp3
上游 CACCATCATCGTCATTCCTCT
149 下游 TAACTGGCAAACCTGATACGG
Lrh-1
上游 ATGGGAAGGAAGGGACAATC
166 下游 CAAACCTGAAGGGAACGGAGGC
GAPDH
上游 ACCACAGTCCATGCCATCAC
452 下游 TCCACCACCCTGTTGCTGTA

1.2.4 蛋白免疫印迹 按照 RIPA Lysis Buffer
说明书提取大鼠肝脏蛋白，BCA 法进行蛋白定量，在
5%的浓缩胶和 10%的分离胶 SDS-PAGE电泳，每孔上样
量为 80μg总蛋白。浓缩胶 60V电泳 1h，分离胶 100V
电泳 2h，常规湿法转膜 80min，含 5%脱脂奶粉的 TBST
室温封闭 2h，加一抗（Lrh-1 1︰1 000，Mrp3 1︰1 000，
GAPDH 1︰50 000）4℃孵育过夜，用 TBST 洗去一抗
后加入相应的二抗（1︰50 000），室温孵育 1h。ECL
化学发光，凝胶成像系统显影。
1.2.5 免疫荧光反应 新鲜肝脏组织样品进行石
蜡包埋切片，脱蜡后进行抗原修复。PBS液漂洗 3次，
5min/次。10% BSA封闭 30min后，1︰100 Mrp3抗体
染片，37℃孵育 30min。PBS液洗片 3次，5min/次，
洗去多余的抗体。甘油封片后进行镜检。
1.3 统计学方法
应用 SPSS 17.0软件进行统计学分析。单因素方
差分析，计量资料采用χ±s表示。
2 结果
2.1 齐墩果酸对胆道结扎的大鼠胆汁淤积模型具有
保护作用
Sham 组与 BDL+齐墩果酸组大鼠肝脏组织切片可
看到清晰的小叶结构及排列较为整齐的细胞索，无明
显坏死。而 BDL组小叶结构尚清晰，但可见部分坏死
病灶(图 1)。


A：Sham组；B：BDL组；C：BDL+齐墩果酸组；箭头示坏死病灶
图 1 各组大鼠肝脏组织病理变化（HE×100）

2.2 齐墩果酸促进转录因子 Lrh-1、膜转运蛋白Mrp3
在胆汁淤积的大鼠肝细胞表达上调
为了证明齐墩果酸对肝细胞的保护作用是否与
Mrp3有关，我们提取了 Sham组、BDL组和 BDL+OA组
大鼠肝脏组织蛋白及 mRNA，在蛋白水平和 RNA水平对
其进行检测，结果发现：不管在 RNA水平还是蛋白水
平，BDL+齐墩果酸组和 BDL组 Mrp3表达均较 Sham组
升高，且 BDL+齐墩果酸组较 BDL组差异明显，具有统
计学意义（P<0.05，图 2）。而免疫荧光染色则进一
步证实了齐墩果酸能过促进膜转运蛋白 Mrp3 在肝细
胞表面的表达（图 3）。UDCA、利福平等治疗胆汁淤
积的药物，均是通过核受体或转录因子对肝细胞表面
哦转运蛋白进行调节，因此，我们推测齐墩果酸也可
能是通过某一核受体或转录因子调控 Mrp3 使其在胆
汁淤积的大鼠肝细胞表面表达上调。因此，我们在蛋
白水平集 mRNA 水平等会 Lrh-1、Sp1 以及 Fxr、Pxr
进行检测，结果发现：Lrh-1在蛋白水平及 mRNA水平
表达均增高，且具有统计学意义（P<0.05，图 2）。

1:Sham组；2:BDL组；3:BDL+OA组；A：Western blot检测结果；B：半定量分析结果; C: RT-PCR统计分析结果 a：P<0.05，与 Sham组比较
图 2 各组肝脏组织中 Mrp3、Lrh-1的蛋白表达情况


A:Sham组；B:BDL组；C:BDL+齐墩果酸组；绿色荧光表示 Mrp3，箭头示 Mrp3
图 3 免疫荧光染色观察齐墩果酸促进膜转运蛋白 Mrp3在肝细胞表面的表达（×100）

3 讨论
胆汁淤积是各种肝病时常见的一种临床综合症，
目前，临床治疗胆汁淤积缺乏有效的药物，唯一得到
国际认可的 UDCA具有较大的副作用且个体差异显著，
因此，寻找治疗胆汁淤积的有效药物成为临床亟待解
决的问题。川西獐牙菜是我国传统中草药，广泛的用
于“肝胆湿热症”的治疗，而我们的前期研究也表明：
川西獐牙菜对胆汁淤积的肝脏具有保护作用[10-11]。但
是川西獐牙菜成分复杂，多种药物成分作用于已处于
病理状态的肝脏，增加肝脏负荷，不利于肝功能的恢
复。胆道结扎的大鼠是最常用的研究胆汁淤积的模
型，通过此模型，我们能够直观的观察到给药前后大
鼠肝脏损伤的恢复情况。因此，我们建立了胆道结扎
的大鼠胆汁淤积模型，利用此模型对川西獐牙菜单体
齐墩果酸进行研究。
MRP3位于肝细胞基底侧膜，属于 MRPs家族，其
底物范围广，主要包括：胆汁酸、结合胆红素以及各
种药物等。研究表明，生理状态下，MRP3不表达或低
表达，但胆汁淤积时 MRP3表达明显增高[7、12-13]。因此，
研究认为，MRP3在梗阻性黄疸中表达上调是肝脏自我
保护性的增加胆红素清除的代偿机制，能够增加结合
性胆红素及胆汁中的其他成分项血液中排泄，减轻对
肝细胞的损伤[14-15]。而李琼等[16]的研究也表明，在胆
道结扎的大鼠胆汁淤积的大鼠肝脏中，Mrp2的表达明
显下降，Mrp3则显著增高，这可能有利于胆汁酸从肝
细胞的排泄，减轻胆汁酸对肝细胞的损害。由此可见，
Mrp3在胆汁淤积的肝脏中表达增高确为保护性因素，
而齐墩果酸是否也是通过调控 Mrp3 发挥肝脏保护功
能，有待研究。
川西獐牙菜活性单体齐墩果酸干预胆道结扎的
大鼠胆汁淤积模型后，我们通过 HE 染色观察到：齐
墩果酸对胆汁淤积的大鼠肝脏却是有保护作用，提示
齐墩果酸可能能够调控肝细胞表面的胆汁酸转运蛋
白。我们运用免疫荧光反应检测 Sham组、BDL组以及
BDL+齐墩果酸组的大鼠肝脏组织，发现 BDL 和 BDL+
齐墩果酸组的 Mrp3 蛋白在肝细胞膜表面表达增加，
特别是 BDL+齐墩果酸组不仅较 Sham组增高明显，且
与 BDL 组相比也差异显著。同时，Western blot 和
RT-PCR结果也进一步证明了这一结果。所以，我们认
为齐墩果酸能过促进大鼠肝细胞表面 Mrp3的高表达。
而受 UDCA 对胆汁酸转运蛋白调节机制的启发，我们
推测，齐墩果酸对 Mrp3 的调控可能是通过转录因子
或核受体进行。Western blot和 RT-PCR结果表明，
BDL组和 BDL+齐墩果酸组中转录因子 Lrh-1的表达较
Sham组增高，且与 Mrp3的变化相一致。由此，我们
认为：齐墩果酸可能通过转录因子 Lrh-1调控肝细胞
便面膜转运蛋白 Mrp3 的表达上调。此研究结果为临
床治疗胆汁淤积提供新的用药线索，同时对我国传统
中草药的开发与保护具有重要意义。
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（编辑 王 红）