全 文 ：HPLC法测定对坐叶药材中齐墩果酸和熊果酸
徐 君， 吴连花， 徐文芬， 李齐激， 刘亚华* ， 潘炉台
(贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002)
收稿日期:2011-06-21
基金项目:贵州省科技厅(黔科合社字［2008］5035) ;贵阳市科技局(筑科合同［2011201］大-3)
作者简介:徐 君(1985—) ，男，硕士研究生，从事天然药物化学的研究工作。E-mail:xj631@ 163． com
* 通信作者:刘亚华(1978—) ，女，副教授，主要从事天然药物化学的研究工作。E-mail:lyh1123@ yahoo． cn
摘要:目的 建立高效液相色谱法同时测定对坐叶药材中齐墩果酸和熊果酸的方法。方法 色谱柱为 Phenomenex
Hydro-Rp 80A(250 mm ×4. 60 mm，4 μm) ;流动相为甲醇-0. 1%磷酸水溶液(84 ∶ 16) ;体积流量为 1. 0 mL /min;柱温 25
℃;检测波长为 210 nm。结果 齐墩果酸和熊果酸的进样量分别在0. 423 0 ～ 1. 269 μg(r = 0. 999 3)、0. 968 0 ～ 2. 904
μg(r = 0. 999 9)范围内与峰面积呈良好的线性关系;平均回收率分别为 103. 63%、99. 41%(n = 9)。结论 本方法简便、
准确、可靠。
关键词:对坐叶;齐墩果酸;熊果酸;HPLC
中图分类号:R284. 1 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2012)04-0765-03
对坐叶系茜草科耳草属植物长节耳草 Hedyotis uncinella
Hook． et Arn，为《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003 版
收载品种，是贵州常用苗药，其苗药用名为夏加溜［1］，在民
间中主要用于治疗肝炎、肾炎、风湿、痢疾、腹泻、毒蛇咬伤和
癌肿等症［2 ～ 9］。贵州家诚药业有限公司生产的“解毒止泻胶
囊”为对坐叶单方制剂，该药具有清热解毒，调中止泻的功
效，用于腹泻、腹胀、腹痛、里急后重、痢疾、急性胃肠炎，但迄
今未见有关对坐叶化学成分及质量分析的研究报道。为了
弄清对坐叶的有效物质基础，保证用药的安全及可控，本实
验对该药用植物的化学成分进行了研究，从中分离到 2α，
3β-dihydroxy-olean-12-en-28-oic acid、齐墩果酸、熊果酸、β-谷
甾醇等十余个化合物(待发表) ，并在此基础上，建立高效液
相色谱法同时测定对坐叶药材中齐墩果酸和熊果酸的方法，
采用多指标成分控制该药材的质量。该方法测定结果准确
可靠，简便可行，为提高对坐叶药材的质量标准及相关产品
的质量控制提供科学依据。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 Agilent 1100 型高效液相色谱仪(美国安捷伦公
司) ，安捷伦液相色谱系统化学工作站;AG135 型电子天平
(瑞士 Mettler-Toledo 公司) ;CSF-1B 超声波清洗仪(上海超
声波仪器厂)。
1. 2 试剂 齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，供
含量测定，批号:110709 -200304) ，熊果酸对照品(中国药品
生物制品检定所，供含量测定，批号:110742-200415) ，甲醇
为色谱纯，水为重蒸水;其余试剂均为分析纯。
1. 3 样品来源 于 2008 年 11 月至 2010 年 9 月采自贵州省
贵定、安顺、兴仁等地，经贵阳中医学院孙庆文副教授鉴定为
茜草科耳草属植物对坐叶 Hedyotis uncinella Hook． et Arn．的
全草，晒干。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件及系统适应性实验 色谱柱为 Phenomenex
Hydro-Rp 80A(250 mm × 4. 6 mm，4 μm) ;流动相为甲醇-
0. 1%磷酸水溶液(84 ∶ 16) ;检测波长为 210 nm;体积流量 1
mL /min;柱温 25 ℃;进样量为 20 μL。齐墩果酸、熊果酸与
其它色谱峰完全分离，分离度大于 1. 5。理论塔板数按齐墩
果酸计大于4 000，按熊果酸计大于5 000。供试品溶液，混合
对照品溶液的色谱图见图 1 ～ 2。
图 1 供试品溶液 HPLC色谱图
1. 齐墩果酸 2. 熊果酸
图 2 混合对照品溶液 HPLC色谱图
1. 齐墩果酸 2. 熊果酸
2. 2 对照品溶液的制备 分别精密称取齐墩果酸对照品
4. 23 mg、熊果酸对照品 9. 68 mg，置 10 mL量瓶中，加甲醇溶
解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品贮备液，精密吸取混
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中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
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Vol． 34 No． 4
合对照品 1. 0 mL，置于 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，
摇匀(齐墩果酸为 42. 3 μg /mL，熊果酸为 96. 8 μg /mL)。
2. 3 供试品溶液的制备 取对坐叶药材粉末约 0. 5 g(过四
号筛) ，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇 20 mL，密
塞，称定质量，超声处理(25 kHz，500 W)60 min，放冷，再称
定质量，用甲醇溶液补足损失的质量，摇匀，滤过，弃去初滤
液，取续滤液，即得。(同时照《中国药典》2010 版一部附录
Ⅸ H 第一法测定水分)
2. 4 标准曲线的绘制 精密吸取混合对照品溶液 10、15、
20、25、30 μL，分别重复进样，以齐墩果酸、熊果酸峰面积平
均值为纵坐标，其进样量为横坐标，进行回归计算，得齐墩果
酸的回归方程为 A = 0. 415 3C + 6. 803 5，r = 0. 999 3，齐墩果
酸在0. 423 0 ～ 1. 269 μg 范围内线性良好;熊果酸回归方程
为 A = 0. 372 1 C + 6. 62，r = 0. 999 9，熊果酸在0. 968 0 ～
2. 904 μg范围内线性良好。
2. 5 稳定性实验 取样品粉末 6 份(产地:普安) ，每份约
0. 5 g，精密称定，按 2. 3 项下的方法制备供试品溶液，分别
于 0、2、4、6、8、10、12 h 进行测定，计算齐墩果酸峰面积的
RSD为 2. 41%，熊果酸峰面积的 RSD为 2. 72%，表明供试液
在 12 h内基本稳定。
2. 6 精密度实验 精密吸取上述混合对照品溶液(齐墩果
酸为 42. 3 μg /mL，熊果酸为 96. 8 μg /mL) ，重复进样 5 次，每
次 20 μL，分别计算齐墩果酸峰面积的 RSD 为 2. 97%，熊果
酸峰面积的 RSD为 2. 34%。表明精密度良好。
2. 7 重复性实验 取样品粉末 6 份(产地:普安) ，每份约
0. 5 g，精密称定，分别按 2. 3 项下的方法制备供试品溶液，
依法测定，计算齐墩果酸的 RSD 为 2. 13%，熊果酸的 RSD
为 1. 41%。
2. 8 加样回收率实验 取已知量的同一样品粉末 9 份(产
地:普安) ，每份约 0. 25 g，精密称定，分别精密加入齐墩果酸
对照品溶液(105. 8 μg /mL)2. 0 mL、2. 5 mL、3. 0 mL;再分别
精密加入熊果酸对照品溶液(96. 8 μg /mL)7. 2 mL，9. 0 mL，
10. 8 mL，按 2. 3 项下的方法制备供试品溶液，依法测定，计
算齐墩果酸平均回收率(见表 1)为 103. 63%，RSD 为
3. 20%;熊果酸平均回收率(见表 2)为 99. 41%，RSD
为 2. 67%。
表 1 齐墩果酸加样回收率试验
样品量
/g
原有量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均回收
率 /%
RSD
/%
0． 250 34 0． 255 9 0． 211 6 0． 471 5 100． 79 103． 63 3． 20
0． 250 25 0． 255 8 0． 211 6 0． 501 1 107． 12
0． 250 33 0． 255 8 0． 211 6 0． 497 6 106． 35
0． 250 28 0． 255 8 0． 264 5 0． 519 3 99． 71
0． 250 30 0． 255 8 0． 264 5 0． 539 9 103． 67
0． 250 38 0． 255 9 0． 264 5 0． 543 0 104． 25
0． 250 41 0． 255 9 0． 317 4 0． 624 4 108． 99
0． 250 43 0． 255 9 0． 317 4 0． 573 7 100． 14
0． 250 27 0． 255 8 0． 317 4 0． 582 2 101． 65
2. 9 样品测定 将不同产地对坐叶药材样品，按 2. 3 项下
的方法制备供试品溶液，注入液相色谱仪测定，依法测定，记
录色谱图，即得。结果见表 3。
表 2 熊果酸加样回收率试验
样品量
/g
原有中量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均回收
率 /%
RSD
/%
0． 2503 4 0． 867 1 0． 697 0 1． 596 102． 04 99． 41 2． 67
0． 2502 5 0． 866 7 0． 697 0 1． 552 99． 24
0． 2503 3 0． 867 1 0． 697 0 1． 520 97． 18
0． 2502 8 0． 866 9 0． 871 2 1． 654 95． 16
0． 2503 0 0． 866 9 0． 871 2 1． 686 97． 04
0． 2503 8 0． 867 2 0． 871 2 1． 767 101． 62
0． 2504 1 0． 867 3 1． 045 4 1． 890 98． 81
0． 2504 3 0． 867 4 1． 045 4 1． 974 103． 21
0． 2502 7 0． 866 8 1． 045 4 1． 920 100． 43
表 3 不同产地对坐叶药材测定结果 (n =3)
编号 产 地
齐墩果酸
/(mg·g － 1)
熊果酸
/(mg·g － 1)
总质量分数
/(mg·g － 1)
1 贵州兴仁 1. 27 4. 78 6. 05
2 贵州龙里 1. 07 3. 80 4. 87
3 贵州安顺 2. 02 6. 43 8. 45
4 贵州贵阳 2. 09 6. 03 8. 12
5 贵州平塘 1. 30 5. 09 6. 39
6 贵州贵定 2. 25 5. 63 7. 88
7 贵州紫云 2. 03 7. 23 9. 26
8 贵州普安 1. 02 3. 46 4. 48
3 讨论
3. 1 由表 3 可知，贵州不同产地对坐叶药材中齐墩果酸和
熊果酸的质量分数差异较大，以紫云产对坐叶中齐墩果酸和
熊果酸的总质量分数较高，龙里和普安产对坐叶中齐墩果酸
和熊果酸的总质量分数较为接近且较低;贵定产对坐叶中齐
墩果酸质量分数较高，龙里和普安产对坐叶中齐墩果酸质量
分数较低;紫云产对坐叶中熊果酸质量分数较高，龙里和普
安产对坐叶药材中熊果酸质量分数较低，其原因可能与采收
期及产地有关。
3. 2 色谱柱的选择，实验中考察了 3 种色谱柱，Agilent SB-
C18(150 mm × 4. 6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX Extend-C18
(150 mm ×4. 6 mm，5 μm)和 Phenomenex Hydro-Rp 80A(250
mm ×4. 60 mm，4 μm) ，结果显示，前两种色谱柱对本样品的
分离效果较差，且峰形展宽，而 Phenomenex Hydro-Rp 80A
(250 mm ×4. 60 mm，4 μm)分离效果较好，故选择之。
3. 3 流动相的选择，本实验分别考察了甲醇-水，乙腈-水，
甲醇-0. 1%磷酸水溶液，乙腈-0. 1%磷酸水溶液，甲醇-0. 1%
醋酸水溶液不同比例的流动相，结果为甲醇-0. 1%磷酸水
(84 ∶ 16)分离效果较好。同时，在实验中考察了甲醇、无水
乙醇的提取效率，结果为甲醇提取效率较高，故选择甲醇为
提取溶剂。
3. 4 供试品溶液提取方法考察，本实验参照文献［10-12］，
进行回流提取法与超声提取法的对比实验，结果两种方法的
提取效率无明显差异，故选择操作简便的超声提取法。
参考文献:
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五味子药材中苹果酸、柠檬酸的测定方法研究
张 韵1， 傅 颖1， 吴霞红2
(1. 上海市中药质量监督检验室，上海 200336;2. 上海体育科学研究所，上海 200030)
收稿日期:2011-04-26
作者简介:张 韵(1962—) ，女，工程师，从事中药检验分析。Tel:(021)64396909
摘要:目的 建立测定五味子药材中苹果酸与柠檬酸的定量分析方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱 likrospher
C18(4. 6 mm × 150 mm，5 μm) ，流动相甲醇 － 0. 1%磷酸梯度洗脱，体积流量 1 mL /min，柱温 15 ～ 23 ℃。结果 在上述色
谱条件下苹果酸和柠檬酸分别在 0. 465 ～ 9. 296 μg和 1. 698 ～ 15. 282 μg范围内与峰面积呈良好线性关系 r = 0. 999 6，Y
= 66. 32X + 1. 49;r = 0. 999 9，Y = 87. 66X + 0. 29。平均加样回收率苹果酸为 95. 98%，RSD 为 1. 01%;柠檬酸为
98. 24%，RSD为 1. 05%。精密度考察的 RSD分别为 1. 63%，1. 49%;重复性试验的 RSD分别为 1. 98%，1. 98%;稳定性
试验的 RSD分别为 2. 0%，1. 41%。结论 该测定方法准确，简便易行，重复性好。
关键词:HPLC;苹果酸;柠檬酸;定量测定
中图分类号:R284. 1 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2012)04-0767-03
五味子是木兰科植物五味子 Schisandra chinensis的干燥
成熟果实，其功效收敛固涩、益气生津、补肾宁心［1］，兼有药
用与营养作用两种属性。近年来，对五味子的研究表明，其
具有增强免疫、提高抗氧化机能以及改善肠道菌群等作
用［2-3］。五味子中有机酸含有量的高低代表着药材的成熟
度，与五味子的有机酸如苹果酸、柠檬酸具有一定的关联，本
实验以研究有机酸为目的，开发新产品，为保证产品质量，把
好原药材质量关，有必要建立五味子中苹果酸、柠檬酸的高
效液相检测方法。
1 仪器、试药与样品
1. 1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪;G1322A 自动进
样器;G1316A柱温箱;DAD G1315B 检测器;超声波清洗机
SK7200LH，功率 350 W，59 kHZ，上海科导超声仪有限公司。
1. 2 试药、试剂 柠檬酸对照品(中国药品生物制品检定
所，批号 111679-200401，供定量测定用) ;L-苹果酸对照品
SIGMA公司，批号 01011AE，供定量测定用) ;甲醇为色谱
纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。五味子药材产自
辽宁，6 个批次(批号见样品检验结果)均按照 2010 版中国
人民共和国药典一部检验结果符合规定。
2 色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇为流动相
A，以 0. 1%磷酸水溶液为流动相 B，按 2010 年版中国药典一
部梯度洗脱方法(按表 1 进行梯度洗脱) ，检测波长为 209
nm;柱温 15 ℃;进样量 10 μL;色谱柱理论塔板数按苹果酸、
柠檬酸色谱峰计算应不低于3 000。
表 1 苹果酸、柠檬酸梯度洗脱顺序
时间 /min A /% B /% 体积流量 /(mL·min －1)
0 ～ 25 0 100 0. 7
25 ～ 50 0 ～ 100 100 ～ 0 1. 0
50 ～ 60 0 100 0. 7
3 方法与结果
3. 1 对照品溶液的制备
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