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人工栽培和野生獐牙菜中齐墩果酸成分分析和比较研究



全 文 :人工栽培和野生獐牙菜中齐墩果酸成分分析和比较研究
周 利1, 王先飞1, 施超欧2, 陈桂琛3, 史 萍1*
(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;2. 华东理工大学分析测试中心,上海
200237;3.中国科学院西北高原生物研究所,青海 西宁 810008)
收稿日期:2010-09-27
基金项目:上海市浦江人才计划(10PJ1402300);上海市教育委员会科研创新项目(11ZZ51)
作者简介:周 利(1958—),女,工程师,从事仪器分析。Tel:(021)64252920,E-mail:lzhou@ ecust. edu. cn
* 通信作者:史 萍,研究员。Tel:(021)64252920,Email:ship723@ Yahoo. com
摘要:目的 检测、定量分析和比较野生及人工栽培川西獐牙菜和抱茎獐牙菜中齐墩果酸在不同部位的质量分数变化。
方法 采用高效液相色谱-质谱(ESI负离子 /MS /MS)测定獐牙菜全株、花、叶、茎和根不同部位齐墩果酸质量分数。结
果 液相色谱条件采用乙腈-水溶液(65 ∶ 35v /v)流动相,体积流量 0. 8 mL /min,210 nm 检测波长,基线平稳、分离度良
好。对川西獐牙菜和抱茎獐牙菜,野生和人工栽培獐牙菜植物全株中齐墩果酸的质量分数差异不大,抱茎獐牙菜中齐墩
果酸质量分数均高于川西獐牙菜中齐墩果酸的质量分数;野生和人工栽培条件下生长的獐牙菜齐墩果酸主要集中在植
物的花和叶中,花和叶中齐墩果酸最高,植物根中齐墩果酸质量分数不到花或叶质量分数的十分之一。结论 结果表明
人工栽培的川西獐牙菜和抱茎獐牙菜药材仍具有优良的品质,与野生獐牙菜相比齐墩果酸质量分数无显著差异。
关键词:獐牙菜;齐墩果酸;高效液相色谱-质谱;人工栽培
中图分类号:R282. 7 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2011)06-1068-03
獐牙菜属龙胆科 Gentianaceae,主要分布于海拔 2 200 ~
3 600 m青藏高原和云贵高原的山坡灌草丛中或山谷溪边,
是用于治疗黄疸性肝胆疾病和病毒性肝炎的珍稀草本植物,
俗称“藏茵陈”[1]。近年来,随着我国民族医药的迅速发展,
獐牙菜的需求量快速增加,特别是在植物生长阶段的花果期
大量采收,导致其资源量锐减和逐渐枯竭,其地域分布亦日
益狭窄,野生资源植物濒临灭绝[2]。因此,进行人工引种和
栽培獐牙菜具有重要意义。经过几年的努力,本课题组已经
成功完成了包括川西獐牙菜 Swertia mussotii 和抱茎獐牙菜
S. franchetiana等野生獐牙菜类植物的人工引种和栽培[3],
也对植物的部分药效成分如当药黄素、龙胆苦苷、芒果苷等
作了较系统的研究[4-5]。但对于齐墩果酸在野生和栽培品种
的积累状况还没有相关的数据。
齐墩果酸是獐牙菜中富含抗肝炎的最主要药效成分,具
有护肝降酶、抗炎、强心利尿、降血糖、抗肿瘤的功效[6-10],分
子式:C30H48O3,分子量:456. 71,分子结构式如图 1 所示。
图 1 齐墩果酸分子结构式
是白色针状结晶,属于三萜类,熔点:308 ~ 310 °C,不溶
于水,可溶于乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷。本实验研究野生
川西獐牙菜和抱茎獐牙菜及人工引种栽培条件下不同部位
齐墩果酸的质量分数和变化,为獐牙菜药材资源的保护和开
发、引种以及合理利用提供依据。
1 实验材料、试剂和方法
1. 1 实验供试样品材料 野生川西獐牙菜和抱茎獐牙菜药
材取自于青海玉树海拔 3 500 m左右山地,由中国科学院西
北高原生物研究所卢学峰研究员鉴定;人工栽培獐牙菜采于
平安县海拔 2 500 m引种栽培基地,为两年生草本植物。
1. 2 实验仪器和试剂
1. 2. 1 实验仪器 高效液相色谱仪 Agilent 1100 Series(Ag-
ilent USA)。包括在线真空脱气系统,四元泵,自动进样器,
柱温箱,二极管阵列检测器;离子阱质谱仪 LCQ Deca XP
Plus(Thermo USA),ESI负离子检测定性;台式离心机 TGL-
16B(上海安亭科学仪器厂);索氏回流提取器(玻璃,自制)。
1. 2. 2 实验药品和试剂 齐墩果酸对照品(购自中国药品
生物制品检定所,批号:110709-200304,供定量测定用);无
水乙醇,分析纯;甲醇,色谱级;乙腈,色谱级;纯水,自制。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 样品溶液的制备 齐墩果酸在水中溶解度小,但易
溶于醇、丙酮、乙酸乙酯等,本实验参考前人的方法[11-13],采
用 75%的乙醇回流提取,具体过程如下:取不同部位根、茎、
叶、花和全枝獐牙菜样品于 60 ℃烘箱干燥 8 h,然后粉碎,精
密称取 1 g样品加入 75%的乙醇 10 mL,索氏回流提取 1 h,
放冷后滤过,残渣再按此方法重复提取 2 次,合并提取液,进
行旋转蒸发浓缩,用 75%的乙醇溶解浓缩的提取物,并定容
至 5 mL 量瓶中,取浓缩液 1 mL 于 15 000 r /min 离心 10
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min,取上清液供分析备用。
1. 3. 2 液相色谱及质谱条件 液相色谱条件:Hypersil
ODS-2 柱 C18色谱柱(4. 6 mm × 250 mm,5 μm),流动相为乙
腈-水溶液(65 ∶ 35v /v),柱温:30 ℃,体积流量:0. 8 mL /min,
检测波长:210 nm,进样量:10 μL,用外标法定量。质谱条
件:ESI负离子 /MS /MS检测,离子源喷射电压 3. 5 kV;毛细
管温度 300 ℃;毛细管电压 15 V;鞘气和辅助气均为氮气,体
积流量分别为 60arb和 15arb;碰撞气为氦气;检测方式采用
1 ~ 2 级全扫描质谱。
1. 3. 3 对照品溶液的制备 精密称取一定量的齐墩果酸对
照品,用甲醇溶解,制成质量浓度为 0. 212 0 mg /mL 的贮备
液,15 000 r /min离心 5 min,上清液作为对照品溶液备用。
1. 3. 4 精密度试验 取齐墩果酸对照品溶液(0. 212 0 mg /
mL),连续重复进样 5 次,计算齐墩果酸的峰面积,获得相对
标准差值(RSD)。
1. 3. 5 重复性试验 精密称取同一批獐牙菜药材 5 份,依
上述方法制备样品溶液,进行重复性的 RSD测定。
1. 3. 6 稳定性试验 取 1. 3. 1 项样品溶液,分别在 0、2、4、
8、16 h进样 20 μL,测定齐墩果酸的稳定性。
1. 3. 7 加样回收率试验 取已知质量分数的药材样品 5
份,分别加入与样品量之比约为 1 ∶ 1 的齐墩果酸对照品,按
样品制备方法和测试条件测定峰面积,计算样品回收率。
2 实验结果与讨论
2. 1 液相色谱条件的优化 因为齐墩果酸和甲醇有相近的
最大紫外吸收波长(λmax),为了降低流动相对齐墩果酸紫外
吸收的干扰,参照李路军等的方法[13],研究不同的液相色谱
条件和洗脱系统,发现在本文的色谱条件下检测,基线平稳,
分离效果好。图 2 为试样品和齐墩果酸对照品的液相色谱
和质谱图谱。由图 2A 和图 2B 可以看出,齐墩果酸对照品
和样品图谱结果一致,样品的分离度好(图 2B)。采用负离
子全扫描模式,均可见齐墩果酸[M-H]- 准分子离子峰
455. 5及 455. 5 的二级质谱中都有相同的 407. 5 的特征子离
子峰(图 2C、D),表明此峰为目标物齐墩果酸单一成分。
2. 2 齐墩果酸成分的测定
2. 2. 1 齐墩果酸标准曲线的制备 分别精密量取上述齐墩
果酸对照品备用液 2、5、10、15、20 μL 进样,以色谱峰面积
(Y)对质量(X)进行回归,齐墩果酸标准曲线的线性回归方
程为 Y = 118. 29X,相关系数为 0. 999 9,说明在 0. 424 ~ 4. 24
μg范围内色谱峰面积与齐墩果酸质量之间具有良好的线性
关系。
2. 2. 2 齐墩果酸方法学考察结果 精密度试验的 RSD 为
0. 95%,表明仪器精密度良好;重复性试验得到 RSD 为
1. 97%,表明该方法的重复性较好。样品稳定性试验的 RSD
为 2. 86%,表明该方法提取获得样品溶液在 16 h内稳定;回
收率试验表明,目标物齐墩果酸的回收率可达 98. 60%,RSD
为 2. 22%。因此本实验采用的齐墩果酸测定方法是可靠
的。
2. 2. 3 样品中齐墩果酸的测定 精确取样品溶液 20 μL进
样测定齐墩果酸峰面积,重复 3 次。根据 3 次面积的平均
值,从标准曲线计算样品中齐墩果酸质量分数。结果见表
1。
对两种野生和人工栽培獐牙菜植物的整株以及花、茎、
叶、根不同部位齐墩果酸分析计算结果如表 1 所示。由表 1
结果可以看出,无论是野生的还是人工栽培的獐牙菜,整株
抱茎獐牙菜中齐墩果酸质量分数均高于川西獐牙菜中齐墩
果酸的质量分数,高出 30%以上;川西獐牙菜和抱茎獐牙菜
两个品种,无论是整株还是花、茎、叶和根不同部位,野生品
种和人工栽培品种中齐墩果酸质量分数差异不大。由表 1
的结果还可以看出,獐牙菜植物不同部位花、叶、茎和根其齐
墩果酸质量分数不尽相同,花和叶质量分数最高,植物根中
质量分数最低;花和叶中齐墩果酸质量分数高出植物茎的质
量分数近 5 倍、高出植物根的质量分数 10 倍以上。
A B
C D
图 2 试样和齐墩果酸对照品液相色谱和质谱图谱
A.齐墩果酸对照品色谱图 B.样品色谱图 C.齐墩果酸对照品二级质谱图 D.样品齐墩果酸二级质谱图
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表 1 獐牙菜不同部位中齐墩果酸
部位
齐墩果酸 /%
川西獐牙菜(野生) 川西獐芽菜(栽培) 抱茎獐芽菜(野生) 抱茎獐芽菜(栽培)
花 0. 067 1 ± 0. 001 6 0. 057 1 ± 0. 001 6 0. 059 8 ± 0. 001 1 0. 074 0 ± 0. 002 9
茎 0. 014 0 ± 0. 002 9 0. 010 7 ± 0. 001 9 0. 013 5 ± 0. 001 4 0. 012 9 ± 0. 000 9
叶 0. 061 4 ± 0. 002 1 0. 055 1 ± 0. 002 2 0. 062 9 ± 0. 000 9 0. 061 0 ± 0. 001 4
根 0. 002 8 ± 0. 000 4 0 0. 005 3 ± 0. 001 1 0. 002 3 ± 0. 000 9
整株 0. 013 4 ± 0. 000 9 0. 012 2 ± 0. 000 8 0. 020 4 ± 0. 000 8 0. 021 2 ± 0. 000 9
表中数据为平均值 ±标准误
3 结论
液相色谱条件采用乙腈-水溶液(65 ∶ 35v /v)流动相,体
积流量 0. 8 mL /min,210 nm检测波长,对照品和样品基线平
稳、分离度良好。质谱分析表明为单一目标成分。
引种到低海拔的两种獐牙菜,无论是川西獐牙菜还是抱
茎獐牙菜,野生和人工栽培植物全株中齐墩果酸的质量分数
无显著变化。对野生和人工栽培不同生境条件下生长的獐
牙菜,整株抱茎獐牙菜中齐墩果酸量均高于川西獐牙菜中齐
墩果酸的质量分数,花、叶、茎和根不同部位齐墩果酸质量分
数不尽相同,齐墩果酸主要集中在植物的花和叶中,花和叶
中齐墩果酸最高,植物根中齐墩果酸质量分数最低,不到花
或叶质量分数的十分之一。结果表明人工栽培的川西獐牙
菜和抱茎獐牙菜药材仍具有优良的品质.
参考文献:
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超临界 CO2 萃取秦艽化学成分的气相色谱-质谱分析
王燕萍
(兰州大学第一医院药剂科,甘肃 兰州 730000)
收稿日期:2010-05-18
基金项目:甘肃省中医药科研项目(No. 05-GZK-16)
作者简介:王燕萍(1975—),女,硕士,副主任药师,主要从事药物分析及药物制剂工作。Tel:13088715500,E-mail:Wangyp317@ sina. com
摘要:目的 对超临界萃取的秦艽化学成分进行分析。方法 采用超临界二氧化碳流体萃取法(SFE-CO2)对秦艽进行
提取,利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对提取物的化学成分进行分离分析。结果 从秦艽超临界萃取提取物中分
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