全 文 ：齐墩果酸对 3T3-L1脂肪细胞分化及糖脂代谢的影响
赵晶晶1 ,魏　明 1 ,吕艳青 1 ,叶春玲1＊ ,张晓琦 2 ,王　英 2 ,叶文才2
(1.暨南大学药学院药理学教研室 ,广东 广州 510632;2.暨南大学药学院中药及天然药物研究所 /暨南大
学中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室 ,广东 广州 510632)
　　摘要　目的:观察齐墩果酸(oleanolicacid, OA)对脂肪细胞分化和糖脂代谢的影响并探讨其机制。方法:在诱
导脂肪分化时用 OA干预 ,油红 O染色后 ,通过比色法分析脂肪细胞的分化程度。采用葡萄糖氧化酶法检测 OA对
脂肪细胞葡萄糖消耗的影响;采用酶联免疫吸附法检测上清液中的游离脂肪酸浓度;采用 RT-PCR法检测脂肪细胞
PPAR-γ和 GLUT-4 mRNA的表达。结果:与溶媒对照组比较 , OA能显著增加脂肪细胞葡萄糖消耗量(P<0.05或
P<0.01),在 1 ～ 30μmol/L浓度范围时 ,其作用随着剂量增加显著增强;OA能促进前脂肪细胞的分化 , 在 3 ～ 30
μmol/L浓度范围内 , OA组油红 O染液光密度值均显著高于溶媒对照组(P<0.05或 P<0.01)。同时 , OA还能减
少游离脂肪酸的产生 , 其 30 μmol/L剂量时游离脂肪酸的含量只有溶媒对照组的 47.2%,显著低于溶媒对照组(P
<0.01)。与溶媒对照组比较 , 30 μmol/LOA能显著增加脂肪细胞 PPAR-γ及 GLUT-4 mRNA的表达(P<0.05)。
结论:OA能促进脂肪细胞分化和葡萄糖的消耗 , 减少游离脂肪酸的产生 , 其机制可能与上调脂肪细胞 PPAR-γ和
GLUT-4 mRNA的表达 、增加脂肪细胞对胰岛素的敏感性有关。
关键词　齐墩果酸;3T3-L1脂肪细胞;细胞分化;糖脂代谢
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2011)04-0588-05
收稿日期:2010-09-08基金项目:教育部科学技术研究重点项目(209147);广东省科技计划项目(2009B030 801031)作者简介:赵晶晶(1985-),女,在读硕士研究生 ,主要从事内分泌药理学研究;Tel:15802036204, E-mail:zjafuji@gmail.com。＊通讯作者:叶春玲 , Tel:020-85223843, E-mail:yechunling2005@ 163.com。
　　胰岛素的主要靶器官是脂肪组织 、肝脏及骨骼
肌 。在细胞水平 ,胰岛素抵抗的发生主要体现在靶
细胞对胰岛素反应的功能缺陷 〔1〕。脂肪组织对胰
岛素抵抗和糖尿病的发生发展尤为重要 〔2〕 ,第一 ,
脂肪组织作为人体最大的能量储备系统 ,是胰岛素
作用的重要靶点和糖脂代谢的主要场所 ,一旦脂肪
细胞出现胰岛素抵抗 ,就会严重影响周围组织的糖
脂代谢 ,使葡萄糖摄取减少 ,游离脂肪酸(FFA)产生
增多。第二 ,脂肪是人体最大的内分泌器官 ,脂肪细
胞能分泌多种细胞因子 ,如肿瘤坏死因子 -α(TNF-
α)、瘦素 (Leptin)、抵抗素(Resistin)、脂联素(Adi-
ponectin)等 ,这些脂肪细胞因子与胰岛素抵抗密切
相关〔3, 4〕。第三 ,过度分泌的 FFA及某些脂肪细胞
因子可以进一步影响其他组织的胰岛素敏感性 ,也
能对胰岛 β细胞产生毒性 ,影响其胰岛素的合成和
分泌 ,加重糖脂代谢的紊乱 。
齐墩果酸(oleanolicacid, OA)为五环三萜类化
合物 ,以游离体和配糖体的形式存在于多种植物中 。
OA主要具有护肝降酶 、降血糖 、降血脂等作用 〔5〕 ,
但其对脂肪细胞糖脂代谢和分化的影响未见报道 。
为此 ,本研究拟采用 3T3-L1脂肪细胞模型 ,观察 OA
对脂肪细胞糖脂代谢及细胞分化的影响 ,并探讨其
作用机制。
1　材料
1.1　细胞株　3T3-L1细胞株 ,购自中国医学科学
院细胞中心。
1.2　药物与试剂　齐墩果酸(oleanolicacid, OA),
暨南大学中药与天然药物研究所张晓琦副教授提
供;罗 格列 酮 , 购 自天 津葛 兰素 史 克 , 批 号
08050134;葡萄糖检测试剂盒 ,中德合资北京利德曼
生化技术有限公司 ,批号 80901HO11;DMEM高糖
培养基购自 GIBCO公司 ,批号 8109025;小牛血清购
自 HYCLONE公司 ,批号 DQB0196;油红 O购自 Sig-
ma公司 ,批号 C1101;游离脂肪酸检测试剂盒 ,购自
南京建成生物科技有限公司 , 批号 20090623;PCR
扩增试剂盒 ,购自 TIANGEN公司。
2　方法
2.1　细胞培养及诱导分化　将 3T3-L1前脂肪细
胞接种于细胞培养板 ,用含 10%小牛血清的高糖
DMEM培养基培养 ,待细胞融合 2 d后 ,加入内含
0.5 mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.25
μmol/L地塞米松和 1.67 μmol/L胰岛素的高糖
DMEM培养基培养 , 48 h后改用仅含 1.67 μmol/L
胰岛素的高糖 DMEM培养液 ,每隔 1d换液 ,诱导分
化 2w后 , 90%以上呈脂肪细胞表型 ,此时可用于葡
萄糖消耗实验和游离脂肪酸检测实验 〔6〕。
2.2　油红 O染色鉴定脂肪细胞分化 　将 3T3-Ll
前脂肪细胞转入 6孔板 ,调整细胞浓度为 5×105 /
·588· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 4期 2011年 4月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2011.04.048
mL,进行诱导分化实验 ,分为溶媒对照组 、OA组 、罗
格列酮组 (10 μmol/L)。溶媒对照组诱导分化加
1‰ DMSO, OA组分为 1、3、10、30μmol/L,每组 3个
复孔 ,观察番石榴叶三萜 OA对 3T3-L1前脂肪细胞
细胞分化的影响 ,即用异丙醇充分溶解染色脂肪细
胞内的油红 O,用酶标仪 520 nm波长 ,测油红 O染
液的光密度 D(λ)值 〔7〕。
2.3　脂肪细胞葡萄糖消耗量的测定 　将 3T3-L1
前脂肪细胞转入 96孔板中 ,调整细胞浓度为 5 ×
10
6 /mL,诱导分化后 ,分为 3组 ,即溶媒对照组 、OA
组 、罗格列酮组 ,每组 6个复孔 ,实验重复 3次 。溶
媒对照组诱导分化加 1‰ DMSO干预 , OA组分别给
予 0.3、1、3、10、30 μmol/LOA,罗格列酮组给予罗
格列酮 10 μmol/L。培养 12 h后 ,更换培养基并加
药物进行干预 ,药物作用于 96孔板中的细胞 24 h,
葡萄糖试剂盒 GOD-POD法(葡萄糖氧化酶法)〔6〕检
测上清液中葡萄糖的浓度 ,用对照组的葡萄糖浓度减
去不同给药组葡萄糖的浓度计算出葡萄糖的消耗量。
2.4　脂肪细胞游离脂肪酸的测定　诱导分化后 ,
分为溶媒对照组 、OA组 、罗格列酮组(10 μmol/L)。
OA组分为 1、3、10、30 μmol/L,每组 6个复孔 。每
组均加 20 nmol/L胰岛素 ,药物作用于 3T3-L1脂肪
细胞 24h,酶联免疫吸附法测培养上清液中游离脂
肪酸(FFA)的浓度 。
2.5　脂肪细胞 PPAR-γmRNA和 GLUT-4 mRNA
的表达检测　3T3-L1前脂肪细胞长至融合 2 d后 ,
用胰岛素诱导其分化。分化过程中全程给予 OA30
μmol/L和罗格列酮 10 μmol/L。诱导分化第 6天提
取总 RNA,以 RT-PCR法检测细胞 PPAR-γmRNA
的表达量 。
2.6　统计学处理　采用 SPSS13.0统计软件对实
验结果进行统计分析 ,实验数据均用 x±s表示 ,完
全随机设计的方差分析 , P<0.05为有统计学意义。
3　结果
3.1　 3T3-L1前脂肪细胞分化前后形态学的变化和
比较　3T3-L1前脂肪细胞形态呈典型的梭形 ,与成
纤维细胞形态相似 ,胞浆中无脂肪滴 (图 1A)。细
胞诱导分化后逐渐变大 、变圆(图 1B)。大约 2 w后
90%的细胞分化为成熟的脂肪细胞 ,表现为细胞浆
丰富 ,含有大量的脂滴 ,脂滴分布于核周围 , 形成
“戒指样”结构 ,为典型的成熟脂肪细胞形态 ,油红
O染色后脂滴着红色(图 1C、D)。
图 1　不同分化时期的 3T3-L1脂肪细胞(油红 O染色 , ×400)
A.3T3-L1前脂肪细胞　B.诱导分化 3d　C.诱导分化 12 d　D.诱导分化 12d
3.2　OA对 3T3-L1前脂肪细胞分化的影响　结果
如表 1所示 , 3T3-L1前脂肪细胞在无药物干预的情
况下 ,诱导分化 12 d, 90%细胞呈成熟脂肪细胞的表
型。 OA能显著促进 3T3-L1前脂肪细胞的分化 ,利用
油红 O染色可直观地显示 OA组脂滴多于对照组 ,随
着 OA浓度的增加脂滴逐渐增多。诱导分化 12 d,与
溶媒对照组比较 , OA在 3 ～ 30μmol/L剂量范围均能
促进 3T3-L1前脂肪细胞分化;油红 O染色异丙醇洗
脱后 ,其光密度显著增加(P<0.05或 P<0.01);罗
格列酮亦能显著促进 3T3-L1前脂肪细胞的分化。
·589·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 4期 2011年 4月
　表 1　　　齐墩果酸对 3T3-L1前脂肪细胞
分化的影响( x±s, n=6)
组别 剂量 /(μmol/L) D(λ)520
溶媒对照组 - 0.35±0.04
齐墩果酸组 1 0.37±0.03
3 0.44±0.05＊
10 0.53±0.04＊＊
30 0.59±0.04＊＊
罗格列酮组 10 0.76±0.02＊＊
　　注:与溶媒对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
3.3　OA对 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗的影响　
结果如表 2所示 ,与溶媒对照组比较 , OA和罗格列
酮均能显著增加 3T3-L1脂肪细胞 24 h葡萄糖消
耗 。在 1 ～ 30 μmol/L剂量范围 ,随着 OA浓度增
加 , 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量逐渐增加 ,呈一
定的剂量依赖性 。胰岛素能刺激脂肪细胞对葡萄糖
的利用 ,与不含胰岛素各组比较 ,胰岛素刺激组的葡
萄糖消耗量显著增加(P<0.05或 P<0.01)。 OA
在 1 ～ 30 μmol/L剂量范围均能显著增加胰岛素刺
激下脂肪细胞葡萄糖的消耗量 。
　表 2　　　　齐墩果酸对 3T3-L1脂肪细胞葡
萄糖消耗的影响( x±s, n=6)
组别 剂量 /(μmol/L)
葡萄糖消耗量 /(mmol/L)
不含胰岛素 含胰岛素 /(20nmol/L)
溶媒对照组 - 1.10±0.35 2.06±0.32#
齐墩果酸组 0.3 1.59±0.46 2.16±0.51#
1 1.98±0.31＊ 2.89±0.36＊#
3 2.62±0.32＊＊ 3.65±0.22＊＊##
10 2.81±0.52＊＊ 4.06±0.23＊＊##
30 3.63±0.43＊＊ 5.38±0.29＊＊##
罗格列酮组 10 4.78±0.56＊＊ 5.96±0.30＊＊##
　　注:与溶媒对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与相应不含胰
岛素组比较 , #P<0.05, ##P<0.01
3.4　OA对 3T3-L1脂肪细胞游离脂肪酸产生的影
响 　OA在 3 ～ 30μmol/L剂量范围干预 24h,能显
著减少脂肪细胞游离脂肪酸的产生 ,与溶媒对照组
比较差异显著(P<0.05或 P<0.01);其中 OA30
μmol/L时其游离脂肪酸的含量仅为溶媒对照组的
47.2%。罗格列酮亦能显著减少脂肪细胞游离脂肪
酸的产生(P<0.01)。见表 3。
　表 3　　　齐墩果酸对 3T3-L1脂肪细胞游离脂肪
酸(FFA)产生的影响( x±s, n=6)
组别 剂量 /(μmol/L) FFA/(mmol/L)
溶媒对照组 - 0.77±0.12
齐墩果酸组 1 0.73±0.07
3 0.61±0.05＊
10 0.59±0.04＊
30 0.41±0.09＊＊
罗格列酮组 10 0.57±0.11＊＊
　　注:与溶媒对照组比较 ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
3.5　 OA对脂肪细胞 PPAR-γmRNA及 GLUT-4
mRNA表达的影响　RNA提取结果:紫外分光光度
计检测总 RNA的 D(λ)260 /280值在 1.8 ～ 2.0之间 ,
电泳条带亮度显示 285∶185比例为 2∶1,故认为所
提取的总 RNA的得率 、完整性与纯度均符合要求 ,
可用于下一步的实验。 RT-PCR结果:3T3-L1脂肪
细胞总 RNA经 RT-PCR后的产物进行电泳 ,与标准
分子量物 Marker比较 , PCR产物片断与预期结果
(220 bp, 225 bp)一致。经灰度值扫描后得出:与溶
媒对照组比较 , OA组脂肪细胞 PPAR-γmRNA、
GLUT-4 mRNA表达增多(P<0.05),罗格列酮组其
表达亦显著(P<0.01)。见图 2、表 4。
　表 4　　　　　齐墩果酸对各组凝胶电泳产物
灰度比值( x±s, n=3)
组别 溶媒对照组 OA30μmol/L 罗格列酮10μmol/L
PPAR-γ 0.19±0.43 0.45±0.32＊ 0.52±0.35＊＊
GLUT-4 0.16±0.33 0.43±0.24＊ 0.55±0.35 ＊＊
　　注:与溶媒对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
图 2　齐墩果酸对脂肪细胞 PPAR-γmRNA、GLUT-4mRNA表达的影响
A.PPAR-γmRNA表达　B.GLUT-4 mRNA表达　C.β-actin表达
M.Marker　1.溶媒对照组　2.罗格列酮 10μmol/L组　3.齐墩果酸 30 μmol/L
·590· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 4期 2011年 4月
4　讨论
脂肪组织作为人体最大的能量储备系统 ,是糖
脂代谢的主要场所 。脂肪酸代谢异常及高 FFA血
症对胰岛素抵抗有重要影响。脂肪组织过度释放
FFA,导致周围循环中的 FFA浓度升高 ,通过抑制胰
岛素刺激下周围组织对葡萄糖的摄取 、增加肝糖异
生及破坏胰岛素介导的对肝糖原生成的抑制等途径
引发或加重胰岛素抵抗 〔8〕。长期 FFA浸润还可通
过氧化应激机制破坏胰岛 β细胞的分泌功能 ,进一
步恶化体内代谢环境 ,此即高 FFA对胰岛 β细胞的
脂毒性作用 。鉴于 FFA产生与胰岛素抵抗的密切
关系 ,本实验选取 FFA的产生和葡萄糖消耗量作为
胰岛素敏感性改善的主要指标 。结果表明 , OA能
显著增加脂肪细胞葡萄糖消耗 、减少游离脂肪酸的
产生 ,提示 OA具有一定的改善脂肪细胞糖脂代谢
作用 ,有利于对抗胰岛素抵抗。
脂肪细胞主要依赖 GLUT-4进行转运葡萄
糖 〔9〕 ,胰岛素促进葡萄糖摄取是通过对 GLUT-4的
调控来实现的。首先 ,胰岛素可以刺激 GLUT-4迅
速转位至胞膜 ,介导葡萄糖的跨膜转运。其次 ,胰岛
素能增加 GLUT-4在细胞表面的糖转运活性或调控
GLUT-4与其他调控因子的关系 。胰岛素还能增加
GLUT-4合成 、减少 GLUT-4的降解。本实验发现 ,
OA对 3T3-L1脂肪细胞无论胰岛素存在与否 ,均有
促进葡萄糖消耗的作用 ,尤其在胰岛素存在时 ,葡萄
糖消耗量显著增加;此结果与过氧化物酶体增殖物
激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂罗格列酮一致 。笔者
推测 OA的作用可能为激活 PPAR-γ信号转导通路 ,
引发下游 GLUT-4表达增加产生作用;也可能同时
作用于胰岛素信号转导通路 ,发挥胰岛素增敏作
用 〔10〕。本次实验结果亦证实了此推测 ,即 OA使脂
肪细胞 PPAR-γ和 GLUT-4 mRNA表达水平明显上
调 。
脂肪细胞的分化失常常导致脂肪的过度堆积 ,
继而引起肥胖和胰岛素抵抗的发生。脂肪细胞的分
化还影响糖脂代谢 ,二者相互作用 ,可造成糖脂代谢
紊乱的恶性循环 ,进而影响代谢性疾病的发生发展 。
本实验发现 , OA与 PPAR-γ激动剂罗格列酮均能显
著促进前脂肪细胞分化 ,该结果亦与文献报道一
致 〔11〕。Okuno等 〔12〕观察到噻唑烷二酮类 (TZDs)
药物可通过激活 PPAR-γ,促使前脂细胞分化 ,使小
脂肪细胞数目增加 ,大脂肪细胞因凋亡而减少 ,前者
对胰岛素更敏感 ,促使依赖胰岛素的糖摄取增加而
脂肪水解减少 ,改善胰岛素抵抗 。
已有动物实验发现 OA具有降低血糖 、改善高
脂饮食大鼠内脏肥胖等作用 〔13, 14〕。本实验发现 OA
显著增强脂肪细胞对葡萄糖消耗利用的能力 、促进
前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化 、减少脂肪细胞
游离脂肪酸的产生。上述结果有利于 OA发挥抗糖
尿病作用 。同时 , OA能显著上调脂肪细胞 PPAR-γ
mRNA和 GLUT-4 mRNA表达水平 。笔者推测 OA
可能通过激活 PPAR-γ,增强 PI3K信号通路传导 ,从
而增强胰岛素敏感性 、产生抗糖尿病作用。
参 考 文 献
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苦豆草中槐定碱在大鼠体内的浓度及药动学研究
刘晓峰 1 ,黄文华1 ,王惠成 1 ,杨宁莲 1 ,陶丽君1 ,杨凤琴 2
(1.宁夏回族自治区人民医院药剂科 ,宁夏 银川 750021;2.宁夏医科大学检验系 ,宁夏 银川 750004)
　　摘要　目的:研究苦豆草中槐定碱在大鼠血浆中的浓度及药动学。方法:给大鼠灌胃苦豆草水溶液 ,用 HPLC
法测定血浆中槐定碱的浓度 , 估算相应的药动学参数。结果:在本实验所建立的方法中 , 槐定碱的回收率达到
89.09%, 准确度高于 94.90%;大鼠灌胃苦豆草水溶液含 40 mg/kg槐定碱后的 t
1/2(α)、t1/2(β), Tmax、Cmax、CL/F、
AUC0～ t分别为(0.28 ±1.70)h、(3.66±1.23)h、(0.75 ±8.66 )h、(1.62±0.13)mg/L、(0.10±0.02)L/(h· kg)、
(4.84±0.20)mg/(μL· h),其在大鼠体内的分布符合二室模型。结论:本实验所建立的方法适合大批量的血样
分析 , 该方法能够满足药动学研究的需要。
关键词　苦豆草;槐定碱;药动学
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2011)04-0592-03
收稿日期:2010-06-22作者简介:刘晓峰(1979-),男,硕士 ,药师 ,主要从事体内药物分析研究;Tel:0951-2063154, E-mail:liuxf6789@ 126.com。
　　苦豆草为豆科植物苦豆子 (Sophoraalopecu-
roidesL.)的干燥地上部分 ,味苦性寒 ,有清热解毒 、
祛风燥湿 、止痛杀虫等功效 ,是宁夏的重要药用植物
资源和自然植被组成部分 ,野生资源分布面积广 ,蕴
藏量大 ,种群优势突出 。由于其较高的药用价值和
生态功能 ,苦豆草资源的合理保护与开发利用越来
越引起人们的重视 ,宁夏回族自治区已将苦豆草列
入重点保护的六大道地药材之一 ,纳入国家中药现
代化科技产业行动计划中。苦豆草所含生物碱较
多 ,如:苦参碱 、苦豆碱 、槐果碱 、槐定碱等 ,其中槐定
碱(SophoridinaSR)具有广泛的药理作用 ,包括:抗
心率失常 、抗肿瘤免疫增强等〔1〕 ,为此本文将以口
服苦豆草煎液中 SR为基础 ,建立一种简单 、灵敏 、
专一的 SR测定方法 ,测定大鼠体内 SR的浓度 ,并
对其药动学参数进行估算 。
1　材料与仪器
1.1　实验动物　雄性 SD大鼠 ,体质量 190 ～ 220
g,购于宁夏医科大学动物实验中心 , 合格证号:
SCXK(宁)2005-0001。给药前禁食 12 h,实验期间
自由饮水。
1.2　药物与试剂 　槐定碱 (SophoridinaSR)对照
品 (中国生物药品制品检定所 , 批号 110784-
200303);冰乙醇(分析纯);甲醇和乙腈均为色谱醇
(山东禹王化工厂);苦豆草药材由宁夏医科大学任
力教授提供并鉴定 ,为宁夏盐池产苦豆草(Sophora
alopecuroidesL.)。
1.3　主要仪器　LC-20AT高效液相色谱仪(岛津 ,
日本), SPD-M20A二极管阵列检测器 , SIL-20A自动
进样器 , DGU-20A3在线脱气机 , Lc-solution数据采
集处理系统;LDZ4-0.8自动平衡微型离心机(北京
医用离心机厂);MA110-型电子分析天平(上海第二
天平仪器厂)。
2　方法
2.1　供试药品制备　苦豆草煎液制备:取苦豆草
药材 300g,加适量的乙醇浸没药材 30 min,采用索
氏提取 ,提取 1 h后分别回收乙醇 ,残渣用 200 mL
水溶解用 。采用本文所建立 SR的 HPLC法测定苦
豆草水提取物中 SR的浓度分别为 4.5 mg/mL。
2.2　色谱条件 　色谱柱:Cosmosil-C18 (150 ×4.6
mm, 5 μm);检测波长:220 nm;流动相:甲醇 ∶乙
醇∶0.02 mol/L乙酸胺缓冲液 (含三乙胺 0.03%)
(5∶16∶79, V/V/V);流速:1.0 mL/min;柱温:室温;
进样量:20μL。
2.3　动物实验 〔2〕　大鼠实验前禁食 12 h,水自由
饮取 。在乙醚麻醉下 ,将聚乙烯管(内径:0.28 mm,
外径:0.61mm)插入其右股动脉 ,待其苏醒 1h后给
药。苦豆草提取物以相当于 40 mg/kgSR的剂量给
大鼠灌胃。灌胃给药前及给药后 0、10、20、30、45、
60、75、90、120、180、240、360通过动脉插管分别抽
取 0.25 mL血样 ,立即离心。每次取样后为了补充
·592· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 4期 2011年 4月