全 文 ：!#$
钝顶螺旋藻单细胞的制备与再生研究
王! 妮，王素英!，师德强
（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 !#!$）
摘% 要：用超声波处理方法制备钝顶螺旋藻单细胞。通过观察藻丝体的破碎程度以及藻丝段的平板再生情况，发现在
冰浴条件下利用 &’()，#*的超声装置，以超声 #+间歇 #+的方式处理螺旋藻 !+，单细胞形成比例达 ,-.!!/，藻丝
段基本控制在 ! 个细胞以内。将处理 !+的藻丝段、单细胞涂布于固体培养基上再生，再生率高达 !-/。因此，!+超
声处理是钝顶螺旋藻单细胞制备的最佳处理时间。用光学显微镜对其平板再生体进行观察，出现螺旋数显著增多，螺
旋变紧密，螺距几乎为零的形态突变株。
关键词：螺旋藻，超声波，单细胞，再生
#$%&#&’()* &*+ #$,$*$#&’()* )- .(*,/$ 0$//. -#)1 !#$%&#’( &()*’+#+
!#$ #%，!#$ &’0(%)*!，&+, -.0/%0)*
（1234524 678 93:;<3=;<8 ;> ?;;@ A2;=7BC4;D;E8，F;DD7E7 ;> A2;=7BC4;D;E8 34@
?;;@ GB274B7，1234524 H42I7<+2=8 ;> F;JJ723.’#&0’：!#$%& ’&%%( )*+, !#$%&#’( &()*’+#+ -&*& ,./& 01 2%3*.(+#’. 45*+2$5 /&3&*,##$ 35& /&(3*2’3+# +)
)%.,( 01 2%3*.(+#’ .#/ 35& *&$&#&*.3+# +) )*.$,( (#$%& ’&%%(，35& +63,.% ’+#/3+# )+* !7 (#$%& ’&%%( +)
2%3*.(+#’ -.8&( 3*&.3, -&*& (&%&’3&/ .9&(2%3( (5+-&/：-5&# 35& )%.,( -&*& 3*&.3&/ !( +# &:;<，#=，
#( > #(（+# > +))），35& )%.,( ’+2%/ 0& 0*+:&# #3+ .8&*.$& %&#$35 )*.$,( ’+#3.##$ #K!’&%%(，35& *.3& +) (#$%&
’&%%( -.( 26 3+ ,-.!!?，)*.$,( (#$%& ’&%%( -&*& 6%.3#$ +# (+%/ ,&/2, )+* *&$&#&*.3#$，35& *.3& +)
*&$&#&*.3+# -.( 26 3+ !-? .=5&*&.)3&* -& +0(&*8&/ 35& ,+*65+%+$1 +) 6%.3#$ (#$%& ’&%%(，)+2#/ +23 35.3 35&
6.*.,&3&*( +) ,+*65+%+$1 5./ ($#)’.#3%1 ’5.#$&/，35& #2,0&* +) (6*.% $+3 ,+*& .#/ (6*.% 0&’.,& ’%+(&*，35&
#3&*8.% +) (6*.% - #&.* 3+ <&*+.
4$5 6)#+.：!#$%&#’( &()*’+#+；2%3*.(+#’；(#$%& ’&%%(；*&$&#&*.3+#
中图分类号：1G&#.!% % % % 文献标识码：L% % % % 文 章 编 号：#&0!,（&M）N0#N-0!
收稿日期：&-0##0#N% !通讯联系人
作者简介：王妮（#M-!0），女，研究生，研究方向：微生物资源的前期
开发。
基金项目：天津滨海地区适生螺旋藻选育、中试研究及其生理活性物
质研发（,O?PQRF$&）。
% % 钝顶螺旋藻（ !#$%&#’( &()*’+#+）是一种丝状蓝
藻，它生长快，富含蛋白质、维生素和其它生物活性
物质，是一种极具开发潜力的微藻［#］。我国从“七
五”攻关开始，螺旋藻应用逐步向大规模生产的方向
发展，品种改良也就成为大面积生产的首要问题。
为了扩大养殖的地理范围、延长养殖周期和降低生
产成本，以满足市场对螺旋藻产品的需求，迫切需要
耐低温和耐盐品系的选育。获得不同特性螺旋藻品
系的有效方法是诱变育种，而该技术的使用基础是
能再生形成完整藻丝的单细胞悬液制备。张学成
等［&］用 .NSJ;D T 9 的 R3FD 去除螺旋藻表面的角质鞘
来制备单细胞；秦松等人［!］利用超声波制备钝顶螺旋
藻透性体和单细胞克隆，但未见细胞再生率的报道。
本文研究了超声波处理钝顶螺旋藻制备单细胞的条
件，并观察其平板再生情况，旨在为螺旋藻的诱变选
育提供物质基础和技术支持。
7! 材料与方法
787! 材料与仪器
钝顶螺旋藻（!#$%&#’( &()*’+#+）% 由天津市食品
生物技术重点实验室保存；培养基 % 液体培养基为
改进的 Q3<<;U’ 培养基，固体培养基中加入浓度
#.S/琼脂。
超声波破碎仪 % 美国 G;42B+ 公司；PVQ 型智能
光照培养箱 % 南京同立科学仪器厂；1P#,0* 微量
高速台式离心机 % 长沙湘仪离心机仪器有限公司；
G27J74+（西门子）电脑温控冰箱% 博西华家用电器；
(WXLOLYL高压灭菌锅% 日本 (WXLOLYL公司。
789! 实验方法
#.&.#% 培养条件 % !!Z、,D[、#&C \#&C 光暗周期
培养。
#.&.&% 螺旋藻单细胞的制备 % 取对数生长期的
!#$%&#’( &()*’+#+ 培养液 $J9，在冰浴条件下利用
&’()，#*的超声装置，以处理 #.+间隔 #.+的方
式分别处理 、#、&、!、$、S、,、N、-+。
#.&.!% 光学显微镜观察计数% 血球计数板和载玻片
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2009.07.001
!#$
直接计数法相结合，计数各样品藻丝段平均细胞数、
单细胞数及三细胞以内藻丝段数。
!#$% 涂布培养及观察% 将超声波处理藻液按 !& 倍
和 !&& 倍稀释，并涂布于固体培养基平板上，每板涂
&!’(，计算植板率。并用光学显微镜，隔天观察一
次。另将对照藻液同法涂布观察。
! 结果与讨论
!#$ 超声波最佳处理时间的确定
#!!% 超声波对螺旋藻的断裂作用 % 采用 #&)*+，
!&&,的超声条件，以处理 !-间隔 !-的方式，对钝顶
螺旋藻进行不同时间的处理，见图 !.图 $，显微镜直
接计数结果见表 !。
从图 !.图 $ 可以看出，超声波对钝顶螺旋藻的
破碎效果明显，表 ! 的数据表明，超声波处理 #&-后，
藻丝段平均细胞数已在 / 个以内；处理 0&- 时，样品
中观察到单细胞的比率达到 123!4，三细胞以内藻
丝段比率达到 !&&4。之后随着处理时间的延长，处
理样品中的平均细胞数继续下降，单细胞的比率和
三细胞以内藻丝段比率继续增加，藻液中藻丝段的
平均细胞数与超声波处理时间之间的相关性见图 2、
图 0。
表 !% 超声波对螺旋藻藻丝体断裂作用
处理时间
（-）
藻丝段数
（’(）
单细胞
比率（4）
三细胞以内
藻丝段比率
（4）
平均细胞数
& #&& 5 !&2 & & !!&
!& #/& 5 !&0 /$31 0!3$ /2
#& #!& 5 !&0 23!$ 123! #2
/& !1& 5 !&0 01// 6/16 #/
$& !$$ 5 !&0 06$$ 63## !6$
2& 61& 5 !&2 3322 6161 !$2
0& 33& 5 !&2 123! !&& !#!
3& $1& 5 !&2 6!03 !&& !!/
1& /&& 5 !&2 6/// !&& !&3
注：表中所列数据为 /& 条藻丝的平均值。
藻丝段平均细胞数随超声波作用时间的变化情
况见图 2 和图 0。超声波作用 !&-时，藻丝断裂效果
明显，藻丝段平均细胞数急剧下降，由原来的 !!& 个
细胞骤减为 /2 个细胞，而当作用时间大于 !&-，藻丝
段平均细胞数变化十分缓慢。当处理时间为 1&-时，
藻丝段平均细胞数由 !&- 时的 /2 个细胞缓慢递减
为 !&3 个细胞，其关系符合曲线：7 8 /33/09 :& &!3#;，
如图 0。说明随着作用时间的延长，藻丝段平均细胞
数逐渐减小，直至细胞被完全破碎。当处理时间为
!&-时，最长藻丝段的细胞数为 #1，仍然很长，这种样
品不适合做诱变材料，因此不选 !&-作为超声最佳处
理时间。
图 3 表明：当超声处理 !&- 后，单细胞比例占到
了 /24；处理 /&-后，单细胞比例占到了 01//4，藻
液中三细胞以内藻丝段的比例已达到了 6&4以上；
处理时间达 0&-时，所有藻丝均断裂为三个细胞以内
的藻丝段，其中单细胞占到了 123!4；当处理时间延
长为 1&-时，单细胞比例已达到 6///4。由以上数
据可得出，超声波对藻丝的断裂作用是极为显著的。
!#$
但处理时间并不是越长越好，随着处理时间的延长，
藻丝段和单细胞数量大幅下降，说明细胞破碎程度
加强，这种经长时间处理的藻丝体极有可能无法
再生。
图 ! 超声波对藻丝体的破碎程度
#$%$# 超声波处理后藻丝段的再生情况 将超声波
处理后的藻液涂平板，培养 #&’ 后计算植板率，结果
如图 ( 所示。
图 ( 超声波处理后藻丝段的再生情况
由图 ( 可看出，经 (&)处理的螺旋藻样品依然能
够再生，但随着超声波处理时间的增加，藻丝段的再
生率明显下降。
综合分析 #$%$% 和 #$%$# 的实验结果，认为钝顶螺
旋藻单细胞制备的最佳超声波处理时间为 *&)，此时
单细胞比例达 +($**,，三细胞以内藻丝段比例达
-*$(-,，藻丝段基本控制在 * 个细胞以内，藻丝段平
均长度是 %$./ 个细胞，且再生能力较好。
!!# 超声波处理后藻丝段的再生体形态
对照藻液的平板生长形态如图 - 所示，与液体
培养时形态（图 %）基本一致。而经超声波处理的藻
丝段平板再生后出现了形态突变的藻株，如图 %& 所
示，螺旋藻形态发生了明显的变化：螺旋数明显增
多，由原先的平均每条藻丝体 /$( 个骤增为几十个，
螺旋变紧密，螺距几乎为零，而对照藻体平均螺距为
.($!.!0。挑取此形态变化的单藻丝体于液体培养
基中培养发现，此螺旋藻形态未发生回复突变，且极
易成片生长，悬浮性较好，利于采收。
图 - 对照藻液的平板生长形态（+&& 1）
单细胞制备过程中，发生形态突变的可能原因
图 %& 超声波处理的藻丝段平板再生形态（+&& 1）
为：超声波作用时产生空化作用，瞬间产生高温高
压，空穴湮灭时产生大量氧自由基、离子，发生复杂
的声化学反应，能作用于微生物的遗传物质，引起突
变［/，.］；超声波作用的不均一性，使藻丝体断裂成长短
不一的片段，除大部分为 %2* 个细胞长度的藻丝体
外，还有部分原生质体产生，而原生质体再生过程
中，存在类似于诱变剂的诱变作用［+］，致使螺旋藻形
态发生变化。
$# 结论
一般认为，超声波的生物学效应主要是空化作
用引起机械力和热作用。在空泡湮灭的过程中，产
生球形冲击波和高温高压，甚至产生电离效应和放
电［!，(］，这可能导致空泡周围细胞的胶质鞘、壁和质膜
的击穿。本文结果显示，超声波对螺旋藻藻丝体的
破碎作用很显著，验证了超声波的击断藻丝段和破
坏细胞壁的生物学效应。
以本文提供的方法制备的单细胞比率高，从单
细胞再生培养中发现：藻丝段平板再生率高达 *(,。
断裂藻丝体以适当密度稀释、涂布，培养后可长成彼
此分开的藻丝体。如果选用适当的培养基，可用于
遗传筛选。作者用此方法处理螺旋藻 *&)，作为诱变
材料，目前已获得了两株稳定遗传的耐低温螺旋藻
和一株耐盐螺旋藻。
参考文献
［%］3456 7$3 08’94 :8; 0<=;854>59 5) ?@056 :88’［7］$ A6：B90C
D 3，E55456’ 7 F 9’)$34>59 56’ G@056 3::5<;)［H］$D50C;<’>9
I6［#］王高歌，张学成，张宝红，等 $无菌钝顶螺旋单细胞的制备
和再生［7］$高技术通讯，#&&%：+2-$
［*］秦松，王希华，童顺，等 $钝顶螺旋藻部分原生质体及单细
胞的制备与培养［7］$海洋与湖泊，%--.，#+（%）：%%&2%%#$
［/］7986> N O，P@6> Q M，R86> P S$I4K;5)86<= :49T@;54 UV45K9 U
W5J9 )96)8; :8; ’9K9=K<6> K?9 =86=96K;5K<86 8: )9KK4<6> !$ #$%
E**%& =944)［7］$X88’ P=<96=9 56’ R<8K9=?6848>L，#&&&，-（#）：
%#/2%#-$
［.］袁易全，陈思忠 $近代超声原理与应用［H］$南京：南京大
学出版社，%--+$
［+］孙剑秋，周东坡 $微生物原生质体技术［7］$微生物学通
报，#&&#，*!（!）：%%$
［!］章力建 $超声波法直接导入外源基因：高效烟草转化系统
的建立［7］$中国农业科学，%--%，#/（#）：(*2(-$
［(］陆德明，张中南，夏肿 $超声波对盐藻的破碎作用［7］$青
岛海洋大学学报，%--#，##（*）：%(2##$