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钝顶螺旋藻单细胞的制备与再生研究



全 文 :!#钝顶螺旋藻单细胞的制备与再生研究 王! 妮,王素英!,师德强 (天津市食品生物技术重点实验室,天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津 !#!
摘% 要:用超声波处理方法制备钝顶螺旋藻单细胞。通过观察藻丝体的破碎程度以及藻丝段的平板再生情况,发现在
冰浴条件下利用 &’(),#*的超声装置,以超声 #+间歇 #+的方式处理螺旋藻 !+,单细胞形成比例达 ,-.!!/,藻丝
段基本控制在 ! 个细胞以内。将处理 !+的藻丝段、单细胞涂布于固体培养基上再生,再生率高达 !-/。因此,!+超
声处理是钝顶螺旋藻单细胞制备的最佳处理时间。用光学显微镜对其平板再生体进行观察,出现螺旋数显著增多,螺
旋变紧密,螺距几乎为零的形态突变株。
关键词:螺旋藻,超声波,单细胞,再生
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中图分类号:1G&#.!% % % % 文献标识码:L% % % % 文 章 编 号:#&0!,(&M)N0#N-0!
收稿日期:&-0##0#N% !通讯联系人
作者简介:王妮(#M-!0),女,研究生,研究方向:微生物资源的前期
开发。
基金项目:天津滨海地区适生螺旋藻选育、中试研究及其生理活性物
质研发(,O?PQRF&)。 % % 钝顶螺旋藻( !#%&#’( &()*’+#+)是一种丝状蓝
藻,它生长快,富含蛋白质、维生素和其它生物活性
物质,是一种极具开发潜力的微藻[#]。我国从“七
五”攻关开始,螺旋藻应用逐步向大规模生产的方向
发展,品种改良也就成为大面积生产的首要问题。
为了扩大养殖的地理范围、延长养殖周期和降低生
产成本,以满足市场对螺旋藻产品的需求,迫切需要
耐低温和耐盐品系的选育。获得不同特性螺旋藻品
系的有效方法是诱变育种,而该技术的使用基础是
能再生形成完整藻丝的单细胞悬液制备。张学成
等[&]用 .NSJ;D T 9 的 R3FD 去除螺旋藻表面的角质鞘
来制备单细胞;秦松等人[!]利用超声波制备钝顶螺旋
藻透性体和单细胞克隆,但未见细胞再生率的报道。
本文研究了超声波处理钝顶螺旋藻制备单细胞的条
件,并观察其平板再生情况,旨在为螺旋藻的诱变选
育提供物质基础和技术支持。
7! 材料与方法
787! 材料与仪器
钝顶螺旋藻(!#%&#’( &()*’+#+ 培养液 J9,在冰浴条件下利用 &’(),#*的超声装置,以处理 #.+间隔 #.+的方 式分别处理 、#、&、!、、S、,、N、-+。
#.&.!% 光学显微镜观察计数% 血球计数板和载玻片
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2009.07.001
!#直接计数法相结合,计数各样品藻丝段平均细胞数、 单细胞数及三细胞以内藻丝段数。 !#% 涂布培养及观察% 将超声波处理藻液按 !& 倍
和 !&& 倍稀释,并涂布于固体培养基平板上,每板涂
&!’(,计算植板率。并用光学显微镜,隔天观察一
次。另将对照藻液同法涂布观察。
! 结果与讨论
!#超声波最佳处理时间的确定 #!!% 超声波对螺旋藻的断裂作用 % 采用 #&)*+, !&&,的超声条件,以处理 !-间隔 !-的方式,对钝顶 螺旋藻进行不同时间的处理,见图 !.图,显微镜直
接计数结果见表 !。
从图 !.图 可以看出,超声波对钝顶螺旋藻的 破碎效果明显,表 ! 的数据表明,超声波处理 #&-后, 藻丝段平均细胞数已在 / 个以内;处理 0&- 时,样品 中观察到单细胞的比率达到 123!4,三细胞以内藻 丝段比率达到 !&&4。之后随着处理时间的延长,处 理样品中的平均细胞数继续下降,单细胞的比率和 三细胞以内藻丝段比率继续增加,藻液中藻丝段的 平均细胞数与超声波处理时间之间的相关性见图 2、 图 0。 表 !% 超声波对螺旋藻藻丝体断裂作用 处理时间 (-) 藻丝段数 (’() 单细胞 比率(4) 三细胞以内 藻丝段比率 (4) 平均细胞数 & #&& 5 !&2 & & !!& !& #/& 5 !&0 /31 0!3/2 #& #!& 5 !&0 23! 123! #2
/& !1& 5 !&0 01// 6/16 #/
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2& 61& 5 !&2 3322 6161 !2 0& 33& 5 !&2 123! !&& !#! 3&1& 5 !&2 6!03 !&& !!/
1& /&& 5 !&2 6/// !&& !&3
注:表中所列数据为 /& 条藻丝的平均值。
藻丝段平均细胞数随超声波作用时间的变化情
况见图 2 和图 0。超声波作用 !&-时,藻丝断裂效果
明显,藻丝段平均细胞数急剧下降,由原来的 !!& 个
细胞骤减为 /2 个细胞,而当作用时间大于 !&-,藻丝
段平均细胞数变化十分缓慢。当处理时间为 1&-时,
藻丝段平均细胞数由 !&- 时的 /2 个细胞缓慢递减
为 !&3 个细胞,其关系符合曲线:7 8 /33/09 :& &!3#;,
如图 0。说明随着作用时间的延长,藻丝段平均细胞
数逐渐减小,直至细胞被完全破碎。当处理时间为
!&-时,最长藻丝段的细胞数为 #1,仍然很长,这种样
品不适合做诱变材料,因此不选 !&-作为超声最佳处
理时间。
图 3 表明:当超声处理 !&- 后,单细胞比例占到
了 /24;处理 /&-后,单细胞比例占到了 01//4,藻
液中三细胞以内藻丝段的比例已达到了 6&4以上;
处理时间达 0&-时,所有藻丝均断裂为三个细胞以内
的藻丝段,其中单细胞占到了 123!4;当处理时间延
长为 1&-时,单细胞比例已达到 6///4。由以上数
据可得出,超声波对藻丝的断裂作用是极为显著的。
!#但处理时间并不是越长越好,随着处理时间的延长, 藻丝段和单细胞数量大幅下降,说明细胞破碎程度 加强,这种经长时间处理的藻丝体极有可能无法 再生。 图 ! 超声波对藻丝体的破碎程度 #%# 超声波处理后藻丝段的再生情况 将超声波 处理后的藻液涂平板,培养 #&’ 后计算植板率,结果 如图 ( 所示。 图 ( 超声波处理后藻丝段的再生情况 由图 ( 可看出,经 (&)处理的螺旋藻样品依然能 够再生,但随着超声波处理时间的增加,藻丝段的再 生率明显下降。 综合分析 #%%# 的实验结果,认为钝顶螺 旋藻单细胞制备的最佳超声波处理时间为 *&),此时 单细胞比例达 +(**,,三细胞以内藻丝段比例达
-*(,./ 个细胞,且再生能力较好。
!!# 超声波处理后藻丝段的再生体形态
对照藻液的平板生长形态如图 - 所示,与液体
培养时形态(图 %)基本一致。而经超声波处理的藻
丝段平板再生后出现了形态突变的藻株,如图 %& 所
示,螺旋藻形态发生了明显的变化:螺旋数明显增
多,由原先的平均每条藻丝体 /(.(!.!0。挑取此形态变化的单藻丝体于液体培养
基中培养发现,此螺旋藻形态未发生回复突变,且极
易成片生长,悬浮性较好,利于采收。
图 - 对照藻液的平板生长形态(+&& 1)
单细胞制备过程中,发生形态突变的可能原因
图 %& 超声波处理的藻丝段平板再生形态(+&& 1)
为:超声波作用时产生空化作用,瞬间产生高温高
压,空穴湮灭时产生大量氧自由基、离子,发生复杂
的声化学反应,能作用于微生物的遗传物质,引起突
变[/,.];超声波作用的不均一性,使藻丝体断裂成长短
不一的片段,除大部分为 %2* 个细胞长度的藻丝体
外,还有部分原生质体产生,而原生质体再生过程
中,存在类似于诱变剂的诱变作用[+],致使螺旋藻形
态发生变化。
# 结论 一般认为,超声波的生物学效应主要是空化作 用引起机械力和热作用。在空泡湮灭的过程中,产 生球形冲击波和高温高压,甚至产生电离效应和放 电[!,(],这可能导致空泡周围细胞的胶质鞘、壁和质膜 的击穿。本文结果显示,超声波对螺旋藻藻丝体的 破碎作用很显著,验证了超声波的击断藻丝段和破 坏细胞壁的生物学效应。 以本文提供的方法制备的单细胞比率高,从单 细胞再生培养中发现:藻丝段平板再生率高达 *(,。 断裂藻丝体以适当密度稀释、涂布,培养后可长成彼 此分开的藻丝体。如果选用适当的培养基,可用于 遗传筛选。作者用此方法处理螺旋藻 *&),作为诱变 材料,目前已获得了两株稳定遗传的耐低温螺旋藻 和一株耐盐螺旋藻。 参考文献 [%]3456 73 08’94 :8; 0<=;854>59 5) ?@056 :88’[7]A6B90CD3E554567F9)34>59 56’ G@056 3::5<;)[H]$D50C;<’>9
I6[#]王高歌,张学成,张宝红,等 7高技术通讯,#&&%:+2-钝顶螺旋藻部分原生质体及单细
胞的制备与培养[7]
[/]7986> N O,P@6> Q M,R86> P SI4K;5)86<= :49T@;54 UV45K9 U W5J9 )96)8; :8; ’9K9=K<6> K?9 =86=96K;5K<86 8: )9KK4<6> ! #% E**%& =944)[7]X88’ P=<96=9 56’ R<8K9=?6848>L,#&&&,-(#):
%#/2%#- [.]袁易全,陈思忠 近代超声原理与应用[H]南京:南京大 学出版社,%--+
[+]孙剑秋,周东坡 微生物原生质体技术[7]微生物学通
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的建立[7]中国农业科学,%--%,#/(#):(*2(-
[(]陆德明,张中南,夏肿 超声波对盐藻的破碎作用[7]
岛海洋大学学报,%--#,##(*):%(2##$

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