全 文 ：254
生长因子对螺旋藻混合营养生长
及藻胆蛋白含量影响的研究
谯顺彬1，董汝晶1，田 辉2，张义明1，3，罗 芳1，陶希芹1
(1.贵州工业职业技术学院，贵州贵阳 550008;
2.贵州茅台酒厂(集团)习酒有限责任公司，贵州习水 564622;
3.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳 550003)
摘 要:本文考察了维生素 B12(VB12)、精氨酸(Arg)和萘乙酸(NAA)三个生长因子对螺旋藻混合营养培养的影响，并对
藻体干重(DW)及藻胆蛋白(PCP)的含量进行检测。实验结果表明:VB12对螺旋藻生长以及藻胆蛋白的积累均有较大影
响，NAA对螺旋藻生长影响较大，而 Arg 对螺旋藻中藻胆蛋白含量影响较大;在单因素实验的基础上，利用响应面法
(RSM)确定三个生长因子的最佳水平:VB12、Arg和 NAA水平配比为 0.08、45、0.3mg /L，此时藻体干重与藻胆蛋白含量分
别增加了 20.2%和 31.9%;以 VB12、Arg和 NAA为自变量，建立了藻体干重和藻胆蛋白为响应值的二次多项式数学模型。
关键词:螺旋藻，混合营养培养，生长因子，藻胆蛋白
The influence of positive growth factor on mixotrophic growth
of S.platensis and the content of phycobiliproteins
QIAO Shun－bin1，DONG Ru－jing1，TIAN Hui2，ZHANG Yi－ming1，3，LUO Fang1，TAO Xi－qin1
(1.Guizhou Industry Polytechnic College，Guiyang 550008，China;
2.Guizhou MouTai (Grounp)Xi Jiu Company Limited，Xishui 564622，China;
3.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，Guiyang 550003，China)
Abstract:In this paper，three critical growth factors were selected to research the influence for the growth of
Spirulina platensis，employing the response surface methodology to optimize the culture conditions of biomass
concentration and phycobiliprotein accumulation.Three critical factors selected for investigation were VB12，Arg and
NAA.Firstly，single － factor experiment was used to determine the range which the biomass concentration of
Spirulina platensis had the obvious improvement. Secondly，the response surface methodology was used to
optimize the three factors，and to build up a quadratic regression equation with dry weight and PCP as the
response，VB12，Arg and NAA as independent，respectively.Finally，after optimization of the experiment showed that，
the best level was VB12，Arg and NAA 0.08，45，0.3mg /L，dry weight and phycobiliprotein content，an increase of
20.2% and 31.9%，respectively.
Key words:Spirulina platensis;mixtrophic growth;positive growth factor;phycobiliproteins
中图分类号:Q939.97 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2012)21－0254－05
收稿日期:2012－05－24
作者简介:谯顺彬(1981－) ，男，硕士研究生，研究方向:光生物反应器
的研究设计。
基金项目:国家自然科学基金项目(39860004) ;贵州省科学技术基金
项目(黔科合 J字［2010］2068 号)。
螺旋藻(Spirulina)是一种具有光合作用能力的原
核微生物，因其细胞呈丝状、缠绕成螺旋状而得名，又
称为蓝细菌。螺旋藻属于蓝藻门、蓝藻纲、段殖体目、
颤藻科、螺旋藻属［1］，目前发现有 50 多个种，其中以钝
顶螺旋藻(S.platensis)和极大螺旋藻(S. maixma)研究
应用最为普遍［2］。螺旋藻营养价值高，含有丰富的蛋
白质、碳水化合物、维生素、叶绿素、藻多糖、不饱和脂
肪酸及微量元素等物质，其中蛋白质含量约
60%～70%，含有 8 种必需氨基酸且各氨基酸含量均
衡，易于人体消化和吸收［3］。藻胆蛋白是存在于红藻
和蓝藻中的光合色素，在螺旋藻中主要是藻红蛋白和
藻蓝蛋白。其中，藻蓝蛋白占细胞干重 10%左右，这
是螺旋藻细胞呈蓝绿色或深绿色的原因，而藻红蛋白
的含量很少。螺旋藻藻蓝蛋白安全无毒，着色力强，是
一种理想的天然的食品着色剂。同时，螺旋藻中的藻
多糖具有增强人体免疫力、防癌、防辐射损伤、抗突变、
抑制癌细胞 DNA 的合成和抗衰老等作用［4－7］。因此，
螺旋藻已逐步应用于食品、医疗、保健等行业［8］。目
前，螺旋藻规模化生产都是采用室外大池培养，由于
采用光合自养培养模式对地域和环境条件的依赖性
强，培养产率低，这极大地制约了螺旋藻产业的发
展。为了满足市场需求，提高产率，增加产量，各国
研究人员一直在探索螺旋藻的培养方式。目前，螺
旋藻混合营养培养是解决这一发展瓶颈的主要研究
方向。混合营养培养主要是通过添加合适的营养成
分来降低藻体生长对环境的依赖，促进藻体生长，实
255
现高产［9］。如在螺旋藻培养过程中补加有机碳源葡
萄糖已获得了较好的研究结果。但是在螺旋藻培养
过程中添加生长因子的研究报道还不多。因此，本
研究在进行混合营养培养的基础上，考察生长因子
对藻体细胞生长的影响，旨在为提高螺旋藻品质以
及产量提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
钝顶螺旋藻(S.platensis)fachb－350 中科院武汉
水生生物研究所;采用传统的 Zarrouk 培养基［10］作为
基础培养基，AB medium培养基作为对比实验进行培
养，试剂均为分析纯，蒸馏水配制后直接装罐。
1.2 实验方法
1.2.1 培养方法 在本实验中，分别采用光合自养
和混合营养条件进行螺旋藻培养研究。在光合自养
条件下，主要是对 Zarrouk和 AB medium两种培养基
进行对比实验，旨在筛选出适合钝顶螺旋藻 fachb－
350 生长的培养基。进行对比实验时，在 250mL 三
角瓶中加入 150mL新鲜培养基，接种量为 10%，温度
30.0℃，初始 pH9.5 ± 0.1，连续光照，光照强度 4000lx
左右，摇床培养，转速 120r /min，培养时间 7d。
Zarrouk培养基、AB medium 分别记为 A1、A2。采用
混合营养培养时，根据 Zarrouk和 AB medium两种培
养基对比实验的结果，选择更适合藻体细胞生长的
培养基进行混合营养培养实验。根据前期实验结果，
在所选的培养基中按 1.5g /L 的量添加葡萄糖时能获
得最大的藻体干重，因此，在本实验过程中，保持光合
自养培养条件不变的情况下，葡萄糖添加量为 1.5g /L，
培养时间延长至 10d进行混合营养培养研究。
1.2.2 单因素实验 在混合营养培养条件下，根据
螺旋藻的生长特性，实验选取 VB12、Arg、NAA 三种生
长因子进行螺旋藻培养实验，考察对藻体细胞生长
及藻蓝蛋白含量的影响，实验先进行单因素实验，即
在未添加另外两种生长因子的条件下，研究另外一
种因子对藻体细胞生长及藻蓝蛋白含量的影响。
1.2.2.1 VB12对钝顶螺旋藻生长的影响 本实验主要
是在混合营养培养条件下研究 VB12对藻体细胞生长
的影响，VB12 的添加浓度为 0.01、0.05、0.1、0.15、
0.2mg /L，同时进行对照实验。
1.2.2.2 Arg对钝顶螺旋藻生长的影响 本实验主要
是在混合营养培养条件下研究 Arg 对藻体细胞生长
的影响，Arg 的添加浓度为 10、25、50、75mg /L，同时
进行对照实验。
1.2.2.3 NAA对钝顶螺旋藻生长的影响 本实验主
要是在混合营养培养条件下研究 NAA对藻体细胞生
长的影响，NAA的添加浓度为 0.1、0.2、0.4、0.6mg /L，同
时进行对照实验。
1.2.3 响应面法优化实验 在混合营养培养条件
下，根据单因素实验的结果，以藻体干重及藻胆蛋白
含量为实验指标，考察 VB12、Arg 和 NAA 对藻体细胞
生长及藻胆蛋白合成的综合影响。采用响应面法中
的中心组合旋转设计对 VB12、NAA和 Arg的最佳水平
及其变化范围进行研究，实验由 Design Expert 软件
设计，选取 5 个中心点重复，共 17 组，各因子实验水
平编码分别－1、0、1，见表 1。
表 1 响应面分析法的因素与水平表
Table 1 Response surface analysis of factors and level table
编码水平
实验因子
A VB12
(mg /L)
B Arg
(mg /L)
C NAA
(mg /L)
－ 1 0.05 25 0.2
0 0.1 50 0.4
1 0.15 75 0.6
1.2.4 藻体生物量测定方法采用干重法［9］(DW)
培养结束后，用吸量管取发酵液 20mL，放于已烘干
至恒重的滤纸进行抽滤，蒸馏水冲洗两次，85℃烘干
至恒重，用精密电子天平称量。
1.2.5 藻胆蛋白测定方法 采用紫外分光光度法［11］。
1.2.6 光照强度的测定 用照度计 LUX－101 直接测
定，单位:klx。
2 结果与分析
2.1 两种培养基的结果比较
按照摇瓶培养方法，采用 Zarrouk、AB培养基进行
光合自养，结果如表 2 所示。A1、A2 培养基的藻体干
重分别为 0.5550、0.7128g /L，A2 比 A1 增加约 28%，表
明经改良的 A2 培养基比 A1 培养基对钝顶螺旋藻的生
长有利。培养结束后对培养液的 pH进行测定发现 A2
培养液中的 pH略低于 A1，主要原因是 A2 培养基中的
碳源为 NaHCO3 和 Na2CO3，这两种成分能形成较好的
缓冲溶液体系。因此，采用 A2 培养基培养螺旋藻能减
少由于 pH的过快上升引起对螺旋藻生长的影响。所
以在接下来的研究过程中采用 A2 培养基为基础培养
基进一步研究螺旋藻混合营养培养的方法。
表 2 不同培养基光合自养培养下的钝顶螺旋藻生长情况
Table 2 Different medium photosynthetic cultured
of Spirulina growth
培养基
类型
螺旋藻生物量
(g /L)
比生长速率
(d －1)
藻胆蛋白
(mg /g) 最终 pH
A1 0.5550 0.156 182.30 11.58
A2 0.7128 0.237 183.99 11.14
2.2 VB12对钝顶螺旋藻生长的影响
在混合营养条件下，VB12对藻体细胞的生长及藻
胆蛋白的含量影响见图 1。由图可知，与对照实验相
比，添加 VB12可以提高藻体干重以及增加藻胆蛋白的
含量。当 VB12添加浓度为 0.01 ～ 0.1mg /L 时，藻体干
重及藻胆蛋白含量均呈上升趋势，当 VB12浓度为
0.1mg /L时，藻体干重达到最大值 1.5171g /L，而 VB12
添加浓度为 0.01 ～ 0.1mg /L时，藻胆蛋白含量有明显
增加。根据四吡咯生物合成途径分析［1］，可能的原因
是 VB12作为螺旋藻中藻胆色素以及叶绿素等生成的
前体物质之一，可以促进螺旋藻生长过程中光能的
转化，达到为螺旋藻生长提供充足的能源。
2.3 Arg对钝顶螺旋藻生长的影响
图 2 表示添加不同浓度的 Arg 对藻体生长及藻
胆蛋白含量的影响。在混合营养条件下，与对照实
验相比，添加一定浓度的 Arg可以提高藻体干重以及
增加藻胆蛋白的含量，但从增加趋势来看，添加 Arg
对藻胆蛋白含量的影响更大，这很可能是在藻体细
胞的生长过程中，Arg作为一种激素或激素前体的形
256
图 1 不同浓度的 VB12对螺旋藻生长的影响
Fig.1 Effect of different concentrations of VB12
on the growth of Spirulina
式进入细胞，通过提高细胞中的色素质量比及酶的
水平而促进细胞的生长，从而能积累更多藻胆蛋白。
同时，Arg 还可以作为螺旋藻生长的备用氮源，保护
合成的藻胆蛋白不会因氮源的缺少而被降解利用。
图 2 不同浓度 Arg对螺旋藻生长的影响
Fig.2 Effect of different concentrations
of Arg on the growth of Spirulina
2.4 NAA对钝顶螺旋藻生长的影响
图 3 表示添加不同浓度的 NAA对藻体细胞生长
及藻胆蛋白含量影响。在混合营养条件下，与对照
实验相比，添加一定浓度的 NAA 可以提高藻体干
重，而藻胆蛋白的含量变化基本不明显。当 NAA 添
加浓度为 0.1 ～ 0.4mg /L 时，藻体干重及藻胆蛋白含
量均呈上升趋势，当 NAA浓度为 0.4mg /L时，藻体干
重达到最大。其原因是 NAA作为一种植物生长促进
剂，作用于细胞时能与细胞受体结合，从而促进质子分
泌到细胞壁，致使细胞延伸快，还能促进 RNA 和蛋白
质的生物合成，为原生质和光合膜的合成提供原料。
然而，当 NAA 浓度超过 0.4mg /L 时，藻体干重随着
NAA增加而降低。同时，从图可知，在整个实验过程
中，添加 NAA对藻胆蛋白含量的影响都不明显。
图 3 不同浓度 NAA对螺旋藻生长的影响
Fig.3 Effect of different concentrations
of NAA on the growth of Spirulina
2.5 生长因子对藻体干重及藻胆蛋白含量的影响
生长因子 VB12、NAA和 Arg对钝顶螺旋藻生长的
实验结果见表 3。
利用 Design Expert 7.0 对表 3 藻体干重 DW数据
进行多元回归拟合，获得以 DW 为响应值，VB12、Arg
和 NAA为自变量的二次多项式回归方程:
DW = 1.66 － 0.067A － 0.04B － 0.011C + 8.250E －
003AB－ 8.500E － 003AC － 1.750E － 003BC － 0.066A2 －
0.042B2－7.909E－003C2 式 (1)
对式(1)进行方差分析，结果见表 4。其中，F =
26.49 ＞ F0. 01(9，10)= 4.94，p ＜ 0.0001，说明该模型的
概率在 α = 0.01 水平上差异显著;模型复相关系数
R2 = 0.9640，说明藻胆蛋白的实验值与预测值之间具有
很好的拟合度;其校正决定系数 R2Adj =0.9178，表明有约
8%的藻体干重总量变异不能由该模型进行解释。
对方程(1)求导，当 VB12、Arg 和 NAA 三个因子
分别达到最佳水平 0.092、61、0.394mg /L 时，藻体干
重最大预测值为 1.6192g /L。
表 3 响应面分析实验方案与实验结果
Table 3 Response surface analysis experiment scheme
and experimental results
实验号 A B C
藻体干重
DW
(g /L)
藻胆蛋白
含量 PCP
(mg /g)
1 － 1 0 － 1 1.3624 153.1
2 0 0 0 1.5853 167.5
3 0 0 0 1.5986 166.9
4 1 1 0 1.4827 156.7
5 － 1 － 1 0 1.3564 155.7
6 － 1 1 0 1.4368 150.8
7 0 0 0 1.5924 167.4
8 0 － 1 1 1.5381 152.4
9 1 0 1 1.4736 154.8
10 1 0 － 1 1.4481 158.6
11 1 － 1 0 1.4574 151.5
12 0 1 － 1 1.4359 162.9
13 0 － 1 － 1 1.4226 156.3
14 － 1 0 1 1.4836 153.1
15 0 0 0 1.5852 166.5
16 0 1 1 1.5154 152.3
17 0 0 0 1.5785 168.1
由表 4 可知，三个因子对藻体生长的影响大小
依次为 NAA ＞ VB12 ＞ Arg，前两个因子极其显著(p ＜
0.01) ，而 Arg影响不大。
其次，从三个因子的交互作用来看，只有 VB12和
NAA对藻体生长影响较显著(p ＜ 0.05) ，见图 4。其
余两两交互均不显著。
同时，利用Design Expert 7.0对表3藻胆蛋白含量
PCP数据进行多元回归拟合，获得以 PCP 为响应值，
VB12、Arg和 NAA为自变量的二次多项式回归方程:
PCP =0.14－5.574E－003A－3.352 E－003B－2.363
E－003C + 3.125E－004AB + 1.238E－003AC－4.8750E
－004BC－ 8.867E－ 003A2 － 5.932E － 003B2 － 6.465E －
003C2 式(2)
对式(2)模型系数和概率进行方差分析，F =38.01
＞ F0. 01(9，10)=4.94，p ＜ 0.0001，说明该模型的概率在
α =0.01水平上差异显著;模型复相关系数 R2 =
257
表 4 DW回归方程系数及其显著性检验
Table 4 Regression coefficient and their significance of the DW model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性
模型 0.096 9 0.011 26.49 0.0001 ＊＊
A 6.194E－003 1 6.194E－003 15.38 0.0057 ＊＊
B 1.159E－003 1 1.159E－003 2.88 0.1335
C 0.015 1 0.015 36.25 0.0005 ＊＊
AB 7.590E－004 1 7.590E－004 1.89 0.2121
AC 2.290E－003 1 2.290E－003 5.69 0.0485 *
BC 3.240E－004 1 3.240E－004 0.80 0.3995
A2 0.038 1 0.038 95.13 ＜ 0.0001 ＊＊
B2 0.015 1 0.015 36.77 0.0005 ＊＊
C2 0.011 1 0.011 26.88 0.0013 ＊＊
残差 2.818E－003 7 4.026E－004
失拟误差 2.581E－003 3 8.604E－004 14.52 0.0129
纯误差 2.371E－004 4 5.927E－005
总和 0.099 16
注:* 代表 p ＜ 0.05，显著;＊＊代表 p ＜ 0. 01，极显著。表 5 同。
图 4 VB12和 NAA对螺旋藻 DW交互影响的曲面图
Fig.4 Response surface plot of DW versus VB12 and NAA
0.9716，说明藻胆蛋白的实验值与预测值之间具有很
好的拟合度;其校正决定系数 R2Adj = 0.9640，表明有约
3.36%的藻胆蛋白总量变异不能由该模型进行解释。
对方程(2)求导，当 VB12、Arg 和 NAA 三个因子
分别达到最佳水平 0.0662、25.6、0.2165mg /L时，藻胆
蛋白最大预测值为 168.1mg /g。
由表 5 可知，三个因子对藻体生长的影响大小
依次为 NAA ＞ VB12 ＞ Arg，其中只有 NAA 对藻胆蛋白
含量的积累影响显著(p ＜ 0.05) ，而 VB12和 Arg 影响
均不明显。
表 5 螺旋藻藻胆蛋白含量回归方程系数及其显著性检验
Table 5 Regression coefficient
and their significance of the PCP model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性
模型 653.78 9 72.64 20.85 0.0003 ＊＊
A 9.90 1 9.90 2.84 0.1357
B 5.78 1 5.78 1.66 0.2387
C 41.86 1 41.86 12.02 0.0105 *
AB 25.50 1 25.50 7.32 0.0304 *
AC 3.61 1 3.61 1.04 0.3426
BC 11.22 1 11.22 3.22 0.1158
A2 226.84 1 226.84 65.12 ＜ 0.0001 ＊＊
B2 165.26 1 165.26 47.44 0.0002 ＊＊
C2 106.95 1 106.95 30.70 0.0009 ＊＊
残差 24.39 7 3.48
失拟误差 22.90 3 7.63 20.52 0.0068
纯误差 1.49 4 0.37
总和 978.17 16
从三个因子的交互作用来看，只有 VB12和 Arg 对
藻体生长影响较显著(p ＜ 0.05) ，见图 5。其余两两
交互均不显著。
图 5 VB12和 Arg对 PCP交互影响的曲面图
Fig.5 Response surface plot
of PCP versus VB12 and Arg
2.6 优化实验
本研究不仅仅是为了获得最大的藻体干重，同
时也要积累更多的藻胆蛋白，以期获得较高品质的
螺旋藻产品。因此，根据上述响应面研究结果，在混
合营养培养条件下，对 VB12、Arg 和 NAA 的最佳水平
作进一步优化。实验共 5 组，水平配比与结果如表 6
所示。结果表明，当 VB12、Arg 和 NAA 水平为 0.08、
45、0.3mg /L时，与未添加生长因子时相比，藻体干重
与藻胆蛋白含量分别增加了 20.2%和 31.9%。实验
结果表明，三个生长因子不仅能提高细胞的生长速
率，而且能促进细胞中积累更多的藻胆蛋白。
表 6 优化实验
Table 6 Model validation experiments
实验号
VB12
(mg /L)
Arg
(mgL)
NAA
(mg /L)
藻体干重
(g /L)
藻胆
蛋白含量
(mg /g)
1 0.09 60 0.4 1.5453 167.5
2 0.08 45 0.3 1.6181 166.9
3 0.07 30 0.2 1.5232 167.9
4 0.08 45 0.3 1.6157 166.5
5 0.08 45 0.3 1.6096 166.1
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1033－1038.
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3 结论
在本实验中，分别进行了光合自养和混合营养培
养实验。首先在光合自养条件下，采用 Zarrouk和 AB
两种培养基进行螺旋藻培养对比实验时，结果表明，
在相同培养条件下，AB 培养基比 Zarrouk 培养基更
有利于螺旋藻生长，藻体干重提高了近 28%，故选择
AB培养基进行混合营养实验。其次，在混合营养培
养条件下，选取了 VB12、Arg和 NAA进行研究，考察这
三个因子对细胞生长及藻胆蛋白合成的影响。结果
表明，当 VB12、Arg 和 NAA 添加浓度分别为 0.08、45、
0.3 mg /L时，与对照实验相比，藻体干重与藻胆蛋白
含量分别增加了 20.2%和 31.9%;表明这三种生长因
子不仅能提高细胞的生长速率，而且能促进细胞中积
累更多的藻胆蛋白，但是具体的机理以及在大规模的
培养时的效果有待进一步验证。
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