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超声集成乙醇 /正丁醇双水相
萃取螺旋藻中的 β-胡萝卜素
张喜峰1，张芬琴1，杨生辉2，罗光宏2，*
(1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖 734000;
2.河西学院凯源生物技术开发中心，甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃张掖 734000)
收稿日期:2014－09－18
作者简介:张喜峰(1982－) ，男，硕士，讲师，主要从事生物质资源开发与利用的研究，E－mail:curiouslysxsd@ 163.com。
* 通讯作者:罗光宏(1966－) ，男，硕士，教授，主要从事食品中营养成分分析方面的研究，E－mail:curiouslysxsd@ 163. com。
基金项目:甘肃省高等教育科研项目(2014A－109;2014B－086);甘肃省中小企业创新基金项目(1047GCCG001);河西学院校长基金项目
(XZ2014－29)。
摘 要:采用响应面优化超声集成双水相体系萃取螺旋藻中的 β－胡萝卜素最佳工艺条件。选取乙醇质量分数、正丁
醇质量分数、料液比和超声时间四个因素，利用 Box－Behnken Design研究各因素交互作用。结果表明优化萃取工艺条
件为:乙醇质量分数 8.2%，正丁醇质量分数 36%，料液比为 1 ∶20(g /mL) ，超声时间 3 min，β－胡萝卜素的得率可达
3.13 mg /g。本实验采用乙醇 /正丁醇双水相萃取螺旋藻中的 β－胡萝卜素将有望开发成为一项廉价高效的螺旋藻 β－胡
萝卜素分离提取技术。
关键词:螺旋藻，β－胡萝卜素，双水相萃取
Ethanol /n－butanol aqueous two－phase coupled with
ultrasound for the extraction of β－carotene from Spirulina platensis
ZHANG Xi－feng1，ZHANG Fen－qin1，YANG Sheng－hui2，LUO Guang－hong2，*
(1.The College of Agriculture and Biotechnology(CAB) ，Hexi University，Zhangye 734000，China;
2.Microalgae Engineering Research Center of Gansu Province，
Kaiyuan Bio－tech Development Center，Hexi University，Zhangye 734000，China)
Abstract:In this study，the potential use of an aqueous two phase system(ATPS)coupled with ultrasound for the
extraction of β － carotene from Spirulina platensis was evaluated and optimized using response surface
methodology(RSM). Box － Behnken Design was applied to evaluate the effects of four independent variables
(ethanol concentration(%，w/w) ，n － butanol concentration(%，w/w) ，ratio of material to solution(g /mL) ，
ultrasonic time(min)on β－carotene extraction yield.The optimal conditions were 8.2%，36%，1∶20 (g /mL)and 3 min
for ethanol concentration，n－ butanol concentration，ratio of material to solution and ultrasonic time respectively.
β－carotene yield was determined to be 3.13 mg /g under the optimal conditions.The results indicated that Spirulina
platensis β－ carotene would be purified by a simple，efficient extraction technology using inexpensive ethanol /
n－butanol ATPS.
Key words:Spirulina platensis;β－carotene;aqueous two phase extraction
中图分类号:TS201.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2015)17－0187－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 17． 029
螺旋藻(Spirulina platensis)被联合国粮农组织推
荐为“21 世纪最理想的食品”。此类藻富含蛋白质、
多糖、不饱和脂肪酸、核酸、类胡萝卜素和微量元
素［1］。螺旋藻可作为提供高量优质胡萝卜素的重要
来源。β－胡萝卜素属于一种类胡萝卜素。根据多项
国内外研究调查证实，天然 β－胡萝卜素具有抗氧
化、抗肿瘤、防辐射、增强免疫力等功能［2－3］，可作为
添加剂用于食品、工业及农业生产。
近年来，国内外学者在提取、利用 β－胡萝卜素
的研究方面做出了大量的工作［4－8］，目前，关于螺旋
藻 β －胡萝卜素提取的报道主要集中在以下几个方
面:于平［5］等简要报道了微波辅助溶剂提取钝顶螺旋
藻中 β－胡萝卜素，以 95%乙醇－丙酮混合液作为提
取溶剂，采用先静置 60 min后微波辅助的提取方式，
获得较高的萃取率。朱廷风［8］等探讨了采用超临界
CO2 萃取螺旋藻中 β－胡萝卜素的可行性。但关于螺
188
旋藻 β－胡萝卜素的双水相萃取工艺研究不多。乙
醇－正丁醇双水相体系克服了传统聚合物－盐双水相
中因使用黏度较大的聚合物而出现的成本高、相分
离时间长、易乳化、后续处理困难等不足，具有提取
时间短、反应条件温和、溶剂易回收等众多优点。而
超声波技术用于辅助乙醇－正丁醇双水相提取技术
可以有效提高分离效率。
本实验将超声波辅助和乙醇－正丁醇双水相分
离集成用于提取螺旋藻中 β－胡萝卜素，确定其最佳
工艺条件，获得更高产量的 β－胡萝卜素，以此作为
从螺旋藻获取优质 β－胡萝卜素的重要来源和为相
关保健品的研发提供支持。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
螺旋藻 甘肃微藻工程中心;β－胡萝卜素标准
品 上海纯优生物科技有限公司，纯度(98%;乙醇、
正丁醇 天津精细化工有限公司。
PL－203 电子天平 梅特勒－托利多仪器有限公
司;XO－SM5O超声波－微波反应系统 南京先欧仪
器制造有限公司;DKB－501 数显超级恒温水浴锅
扬州市三发电子有限公司;722 型分光光度计 上海
光谱仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 双水相萃取螺旋藻 β－胡萝卜素 准确称取
螺旋藻粉末 0.5 g于 50 mL 具塞锥形瓶中，按一定料
液比加入乙醇－正丁醇双水相溶液，超声提取一定时
间，于分液漏斗中静置，取正丁醇相测定 β－胡萝卜
素含量。
1.2.2 β－胡萝卜素含量测定 参考文献［4］的方法，
准确量取已配制好的 12.5 μg /mL β－胡萝卜素标准
储备液 1、2、3、4、5、6 mL，分别置于 25 mL 棕色容量
瓶中，用正丁醇定容，混匀后得到浓度分别为 0.5、
1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg /mL的 β－胡萝卜素标准使用
溶液，在 450 nm 处测定其吸光度值，同时以试剂空
白作为参比，绘制标准曲线方程。
1.2.3 β－胡萝卜素得率计算 取萃取后正丁醇相
β－胡萝卜素测定吸光度，将吸光度代入回归方程计
算 β－胡萝卜素浓度，按下式计算 β－胡萝卜素得率。
β－胡萝卜素得率(mg /g)=萃取液中 β－胡萝卜
素质量(mg)/螺旋藻粉末的质量(g)
1.2.4 超声集成双水相萃取单因素实验
1.2.4.1 无水乙醇质量分数对螺旋藻 β－胡萝卜素萃
取效果的影响 分别选取质量分数为 4%、6%、8%、
10%、12%、14%无水乙醇、36%正丁醇组成双水相
体系，按照 1∶20 g /mL 加入螺旋藻粉末，在超声波功
率 325 W超声处理 5 min，静置后使两相完全分离，
取正丁醇相测定 β－胡萝卜素含量。
1.2.4.2 正丁醇质量分数对螺旋藻 β－胡萝卜素萃取
效果的影响 分别选取质量分数为 34%、36%、
38%、40%、42%、44%正丁醇、8%无水乙醇组成双
水相体系，按照 1∶20 g /mL 加入螺旋藻粉末，在超声
波功率 325 W超声处理 5 min，静置后使两相完全分
离，取正丁醇相测定 β－胡萝卜素含量。
1.2.4.3 料液比对螺旋藻中 β－胡萝卜素萃取效果的
影响 在 8%无水乙醇－36%正丁醇组成双水相体
系，分别以 1∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50 g /mL 加入螺
旋藻粉末，在超声波功率 325 W 超声处理 5 min，静
置后使两相完全分离，取正丁醇相测定 β－胡萝卜素
含量。
1.2.4.4 超声时间对螺旋藻中 β－胡萝卜素萃取的影
响 在 8%无水乙醇－36%正丁醇组成双水相体系，
按照 1∶20(g /mL)加入螺旋藻粉末，在超声波功率
325 W分别超声 1、3、5、7、9 min，静置后使两相完全
分离，取正丁醇相测定 β－胡萝卜素含量。
1.2.5 超声集成双水相萃取 β－胡萝卜素响应面优
化 在单因素实验基础上，确定响应面设计中每个
因子的适宜范围。选取乙醇质量分数(A)、正丁醇质
量分数(B)、料液比(C)和超声时间(D)为自变量，
β－胡萝卜素萃取率为响应值，采用 Design－Expert7.0
软件进行实验设计和统计分析，因素水平及编码值
见表 1。
表 1 实验因素水平及编码
Table 1 Factors and levels of the test
因素
水平
－ 1 0 1
A乙醇质量分数(%) 6 8 10
B正丁醇质量分数(%) 34 36 38
C料液比(g /mL) 1∶10 1∶20 1∶30
D超声时间(min) 1 3 5
1.2.6 超声集成双水相萃取和传统超声波辅助提取
方法的比较 超声集成双水相萃取:利用响应面优
化最优条件提取测定 β－胡萝卜素含量。
传统超声波辅助提取 β－胡萝卜素:将双水相体
系体积全部折算成正丁醇体积，称取一定量螺旋藻
粉末，按照料液比为 1∶20 g /mL 加入 20 mL 正丁醇，
超声时间 3 min，取正丁醇相测定 β－胡萝卜素含量。
1.3 数据分析
所有 实 验 均 重 复 3 次，取 平 均 值。利 用
Excel2003 和 Design－Expert 7.0 数据处理系统进行统
计分析。
2 结果与分析
2.1 β－胡萝卜素标准曲线绘制
由图 1 可知，β－胡萝卜素含量在 0～3.0 μg /mL
范围内与吸光值线性良好。
2.2 单因素实验
2.2.1 无水乙醇质量分数对螺旋藻 β－胡萝卜素萃
取效果的影响 由图 2 可知，随着无水乙醇质量分
数逐渐增加，β－胡萝卜素萃取率呈上升趋势，当无水
乙醇质量分数为 8%时，β－胡萝卜素的萃取率达到
最大值，此后萃取率逐渐下降。主要原因可能是乙
醇对螺旋藻细胞壁的渗透能力强［9］，能够较好地渗透
入细胞壁，从而使 β－胡萝卜素较好地释放而溶解于
溶剂中。无水乙醇质量分数过大时，螺旋藻中一些
水溶性有机物溶出量也会增加，抑制 β－胡萝卜素的
浸出。因此，选择无水乙醇质量分数为 8%。
189
图 1 β－胡萝卜素标准曲线
Fig.1 β－carotene standard curve
图 2 无水乙醇质量分数对螺旋藻中
β－胡萝卜素萃取效果的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on the
yield of β－carotene extracted from Spirulina platensis
2.2.2 正丁醇质量分数对螺旋藻 β－胡萝卜素萃取
效果的影响 由图 3 可知，在一定范围内，增加正丁
醇质量分数能够提高 β－胡萝卜素的萃取效果。正
丁醇质量分数为 36%时萃取率最高，而正丁醇质量
分数超过 36%后，β－胡萝卜素的萃取率显著下降，
可能是由于正丁醇浓度过高时，一些醇溶性杂质、色
素等溶出量增加，与 β－胡萝卜素竞争与正丁醇结
合，从而导致 β－胡萝卜素萃取率的下降。因此，初
步确定正丁醇的质量分数为 36%。
图 3 正丁醇质量分数对螺旋藻中
β－胡萝卜素萃取效果的影响
Fig.3 Effect of n － butanol on the yield of
β－carotene extracted from Spirulina platensis
2.2.3 料液比对螺旋藻中 β－胡萝卜素萃取效果的
影响 从图 4 可知，随着料液比增加，β－胡萝卜素萃
取率先增加，而后趋于稳定。双水相体系用量越多，
传质动力越大，进入到双水相中的 β－胡萝卜素就越
多。考虑到料液比太高会增加提取成本，且给后续
的浓缩工作带来不便，因此，本实验选择料液比为
1∶20 g /mL较好。
图 4 料液比对螺旋藻中 β－胡萝卜素萃取效果的影响
Fig.4 Effect of material － liquid ratio on the
extraction of β－carotene from Spirulina
2.2.4 超声时间对螺旋藻中 β－胡萝卜素萃取效果
的影响 图 5 表明，随着超声萃取时间的延长，萃取
率会持续增加，而后趋于稳定。超声提取初期随着
时间的延长，细胞破碎程度增大，细胞内部的 β－胡
萝卜素开始向外扩散，使得双水相体系中 β－胡萝卜
素的含量迅速升高。当超声时间达到 3 min 左右时，
提取液中 β－胡萝卜素的液质传动到平衡值，因而其
含量趋于稳定。
图 5 超声时间对螺旋藻中 β－胡萝卜素萃取效果的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic time on the
yield of β－carotene extracted from Spirulina platensis
2.3 响应曲面优化双水相萃取工艺
2.3.1 Box － Behnken Design 实验结果及方差分
析 由表 2 可知，将所得的实验数据采用 Design－
Expert7.0 软件进行多元回归拟合，得到以 β－胡萝卜
素萃取率对乙醇质量分数(A)、正丁醇质量分数
(B)、料液比(C)和超声时间(D)的二次多项回归
方程:
Y = 3.14 + 0.06A－0.00083B + 0.02C－0.0025D +
0.13AB－0.14AC + 0.16AD + 0.17BC + 0.04BD－0.04CD
－0.41A2－0.31B2－0.30C2－0.06D2
为了检验方程的有效性，对超声集成乙醇 /正丁
醇双水相萃取 β－胡萝卜素的数学模型进行方差分
析。由表 3 可知，p模型 ＜ 0.0001，表明模型极显著;失
拟项 p = 0.8043，表明失拟项不显著，所选的二次回归
模型是适当的;对模型进行回归方程系数显著检验
可知，模型一次项均不显著(p ＞ 0.05)，交互项中，
AB、AC、AD、BC的影响显著(p ＜ 0.05) ，BD、CD 的影
响不显著(p ＞ 0.05)。二次项中，A2、B2、C2 的影响极
190
显著(p ＜ 0.01) ，D2 的影响不显著(p ＞ 0.05)。模型
决定系数为 91.3%，说明模型拟合程度较好。该模
型能较好地描述变量与得率之间的关系。
表 2 Box－Behnken响应曲面法实验设计及结果
Table 2 Design and results of
Box－Behnken experiment
实验号 A B C D
β－胡萝卜素得率
Y(mg /g)
1 － 1 － 1 0 0 2.50
2 1 － 1 0 0 2.41
3 － 1 1 0 0 2.22
4 1 1 0 0 2.65
5 0 0 － 1 － 1 2.87
6 0 0 1 － 1 2.85
7 0 0 － 1 1 2.85
8 0 0 1 1 2.65
9 － 1 0 0 － 1 2.67
10 1 0 0 － 1 2.45
11 － 1 0 0 1 2.55
12 1 0 0 1 2.96
13 0 － 1 － 1 0 2.66
14 0 1 － 1 0 2.34
15 0 － 1 1 0 2.34
16 0 1 1 0 2.69
17 － 1 0 － 1 0 2.14
18 1 0 － 1 0 2.50
19 － 1 0 1 0 2.60
20 1 0 1 0 2.42
21 0 － 1 0 － 1 2.85
22 0 1 0 － 1 2.76
23 0 － 1 0 1 2.66
24 0 1 0 + 1 2.75
25 0 0 0 0 3.20
26 0 0 0 0 3.20
27 0 0 0 0 3.22
28 0 0 0 0 2.88
29 0 0 0 0 3.21
2.3.2 响应面分析与优化 应用 Design－ Expert7.0
软件进一步优化，考察回归模型作出相应的响应面
图，考察拟合响应面的形状，分析各因素对 β－胡萝
卜素得率的影响，结果见图 6。
响应曲面图坡度陡峭程度可以反映各因素间交
互作用强弱和影响程度大小。曲面坡度陡峭表示两
因素交互影响大，而坡度平缓则与之相反。图 6 可
以看出，β－胡萝卜素得率随各两因素的增加先上升，
当达到一定水平时，缓慢下降。图 6 的等高线表明，
AB、AC、AD、BC 之间交互作用影响较大，BD、CD 交
互作用影响较小。
通过软件分析得最佳萃取条件为，A = 8.19%，B
=36.06%，C = 1∶20.05(g /mL)，D = 3.22min，在此条
件下 β－胡萝卜素理论得率的为 3.14 mg /g。修正后
得到螺旋藻 β－胡萝卜素的最佳萃取条件为:乙醇质
量分数 8.2%，正丁醇质量分数 36%，料液比为 1 ∶20
g /mL，超声时间3 min，通过实验得到螺旋藻 β－胡萝
卜素的实际得率为 3.13 mg /g。因此利用响应曲面法
优化双水相萃取螺旋藻 β－胡萝卜素的提取工艺是
有效可行的，具有实际应用价值。
表 3 回归方程方差分析
Table 3 Variance analysis of the regression equation
变量 平方和 自由度 均方 F值 p值
模型 2.16 14.00 0.15 10.49 ＜ 0.0001
A 0.04 1.00 0.04 2.83 0.1149
B 0.00 1.00 0.00 0.00 0.9870
C 0.00 1.00 0.00 0.21 0.6517
D 0.00 1.00 0.00 0.01 0.9367
AB 0.07 1.00 0.07 4.60 0.0499
AC 0.07 1.00 0.07 5.04 0.0415
AD 0.10 1.00 0.10 6.54 0.0228
BC 0.11 1.00 0.11 7.57 0.0156
BD 0.01 1.00 0.01 0.47 0.5054
CD 0.01 1.00 0.01 0.50 0.4928
A2 1.09 1.00 1.09 73.80 ＜ 0.0001
B2 0.64 1.00 0.64 43.33 ＜ 0.0001
C2 0.60 1.00 0.60 40.57 ＜ 0.0001
D2 0.02 1.00 0.02 1.57 0.2313
残差 0.21 14.00 0.01
失拟项 0.12 10.00 0.01 0.54 0.8043
纯误差 0.09 4.00 0.02
总和 2.37 28.00
2.4 超声集成双水相萃取和传统超声波辅助提取方
法的比较
处理 1 g等量螺旋藻粉末，分别采用超声集成双
水相萃取和传统超声波辅助提取获得的 β－胡萝卜
素得率分别为 3.13 mg /g 和 3.05 mg /g。但双水相萃
取所用正丁醇的量仅为 8.02 mL，传统超声波辅助提
取则需要正丁醇 20 mL，由此可见，双水相萃取法减
少了正丁醇的用量。
3 结论
通过单因素实验法对超声集成双水相萃取螺旋
藻 β－胡萝卜素主要因素进行分析，初步确定最佳单
因素条件:乙醇质量分数 8%，正丁醇质量分数 36%，
料液比为 1∶20 g /mL，超声时间 3 min。
根据单因素实验结果，选择较优水平按 Box－
Behnken Design 实验，通过响应面法优化螺旋藻
β－胡萝卜素萃取的最佳工艺条件，经回归方程方差
分析及最优条件验证，最终获得:乙醇质量分数
8.2%，正丁醇质量分数 36%，料液比为 1 ∶20 g /mL，
超声时间 3 min，最佳萃取条件下螺旋藻 β－胡萝卜
素得率为 3.13 mg /g。
本实验证明利用超声集成乙醇 /正丁醇双水相
萃取螺旋藻中 β－胡萝卜素，实验优化工艺稳定可
行，操作简单，成本低，实验的重复性好，对应用于批
量生产有一定的指导意义，可为 β－胡萝卜素的工业
化生产提供科学依据。
191
图 6 各因素交互作用的响应面图
Fig.6 Response plots for the pairwise interactive effects
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(上接第 186 页)
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