全 文 ： 2010, Vol. 31, No. 10 食品科学 ※工艺技术146
超声波协同等电点沉淀法提取螺旋藻
藻胆蛋白工艺的优化
朱 劼 1，董文杰 1，刘 佳 2
(1.江苏工业学院化学化工学院，江苏 常州 213164；2.江苏工业学院数理学院，江苏 常州 213164)
摘 要：以螺旋藻粉为原料，通过正交试验，对超声波细胞破碎及等电点沉淀提取藻胆蛋白进行研究，并优化
其工艺条件。结果表明，在藻液质量分数 5%、630W(额定功率为 900W)条件下超声 20min，效果最佳；而采用
冰醋酸作为等电点沉淀介质，在 pH4.0的条件下，从提取液中低温沉淀藻蛋白，其操作较为简便。由于冰醋酸溶
液易挥发分离，简化了生产工艺。最后通过冷冻干燥，得到粗蛋白粉末。利用本法优化工艺后，提取液中藻蓝
蛋白的含量高达 4.36%；而经沉淀干燥得到的粗蛋白粉末得率为 52.5%，其中藻蓝蛋白含量为 7.7%、别藻蓝蛋白
含量为 7.9%、藻红蛋白含量为 0.8%。
关键词：螺旋藻；藻胆蛋白；超声波细胞破碎；等电点沉淀
Ultrasonic Cell Disruption Followed by Isoelectric Point Precipitation for Extraction of Phycobiliprotein
from Spirulina platensis
ZHU Jie1，DONG Wen-jie1，LIU Jia2
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Jiangsu Polytechnic University, Changzhou 213164, China；
2. School of Mathematics and Physics, Jiangsu Polytechnic University, Changzhou 213164, China)
Abstract ：A procedure based on ultrasonic cell disruption followed by isoelectric point precipitation was considered for the
extraction of phycobiliprotein from Spirulina platensis powder. The respective optimal conditions for ultrasonic cell disruption
and isoelectric point precipitation were determined. Results showed that an optimal ultrasonic cell disruption was obtained
through 630 W ultrasonic treatment for 20 min of 5% aqueous suspension of Spirulina platensis powder. The optimal medium
was glacial acetic acid for the isoelectric point precipitation of phycobiliprotein, which was a simple and convenient operation
to obtain phycobiliprotein at pH 4.0 and 4 ℃. Glacial acetic acid is easy to volatilize so that the extraction procedure is simplified.
Finally, lyophilization was performed to obtain a crude protein powder. The content of phycocyanin was as high as 4.36% in
the supernatant separated from ultrasonic treated 5% aqueous suspension of Spirulina platensis powder under optimized
conditions, and the yield of crude protein powder from Spirulina platensis powder was 52.5%, in which, the contents of
phycocyanin, allophycocyanin and phycoerythrin were 7.7%, 7.9% and 0.8%, respectively.
Key words：Spirulina platensis；phycobiliprotein；ultrasonic cell disruption；isoelectric point precipitation
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)10-0146-05
收稿日期：2009-08-16
基金项目：溧阳市天目湖保健品有限公司合作项目
作者简介：朱劼(1 9 7 7 —)，男，讲师，博士，主要从事生物医药开发及生物活性成分的提取研究。
E-mail：zhujie_bit@yahoo.com.cn
钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)是一种生长在热带及
亚热带碱性湖泊中的微藻类植物，富含各种营养物质及
活性成分，如蛋白质、γ- 亚麻酸、β- 胡萝卜素、维
生素及钙、锌、铁、钾、镁、硒等矿物质和微量元
素，被联合国粮食与农业组织称之为“21 世纪人类最
理想的天然保健食品”[ 1 -3 ]。其中，藻胆蛋白的含量高
达 10%左右，主要有藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)、藻
红蛋白 ( p h y c o e r y t h r i n ，P E ) 及别藻蓝蛋白
(allophycocyanin，APC)等 3类。大量实验表明，螺旋
藻胆蛋白具有提高人体免疫力、促进动物血细胞再生、
抑制癌细胞生长等作用，同时在抗辐射、抗疲劳、清
除自由基等方面也具有一定的生理活性，存在很高的药
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用价值[4 -8 ]。而对于其生物活性蛋白的提取、分离及纯
化，已成为螺旋藻深加工研究和开发的热点[9 -1 0 ]。
超声波细胞破碎具有高提出率、提取时间短、节
约溶剂、低温提取有效成分等优点[1 1]；而蛋白质等电点
法则利用等电点处蛋白质溶解度最小的原理，在低温下
析出大量蛋白质[12 ]。本实验采用超声波协同等电点沉淀
法从螺旋藻粉中提取活性藻胆蛋白，并对其工艺进行优
化，为工业化生产提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
螺旋藻粉 常州溧阳天目湖保健品有限公司；浓硫
酸、冰乙酸、NaH PO 4·12H 2 O、Na H 2PO 4·2H 2O 等
(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
FD-1型冷冻干燥机 巩义市京华仪器有限公司；
JYD-900智能型超声波细胞粉碎机(额定功率900W 上海
之信仪器有限公司；TGL-16G型高速冷冻离心机 上海
安亭科学仪器厂；HHS型电热恒温水浴锅 上海博讯实
业有限公司医疗设备厂；FA1104型分析天平 上海精
密科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
配制藻悬液→超声细胞破碎→分离上清液→等电点
沉淀蛋白→冷冻干燥粗蛋白→粗蛋白成分分析
1.3.2 操作要点
藻悬液的配制：称取一定量的螺旋藻粉，加去离
子水混匀，使藻液质量分数分别达到 5%、10%、15%，
待用；超声细胞破碎：将配制好的藻悬液在 20℃，一
定超声功率下间歇超声一段时间，按正交表(表 1)进行正
交试验；分离上清液：将细胞破碎后的悬浊液在 5000
r/min离心 20min，收集上清液，并分析其中藻蓝蛋白
的含量及其纯度；等电点沉淀藻胆蛋白：将 0.1mol/L的
稀硫酸和 0.1mol/L的冰醋酸分别加入上清液中，边滴加
边搅拌混匀，分别调节 pH 值至 3、3. 5、4、4 .5、5、
6，静置 6h后，在 4℃以 5000r /min离心 25min，收集
蛋白沉淀；然后采用冷冻干燥的方法得到粗蛋白粉末，
计算其得率，并分析其成分。
1.4 正交试验
根据预试验结果[1 3]，以超声功率(额定功率 900W)、
超声时间及藻悬液质量分数 3个因素进行正交试验，综
合分析提取液中藻蓝蛋白含量及其纯度，确定最佳超声
细胞破碎工艺条件，方案见表 1。
1.5 分析方法
1.5.1 提取液中藻胆蛋白分析方法
螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其鉴定的
标准。藻蓝蛋白(PC)最大光吸收在 620nm波长处，别藻
蓝蛋白(APC)在 650nm波长处，藻红蛋白(PE)最大光吸收
在 490～500nm波长范围内，藻红蓝蛋白(PEC)在 568nm
波长处。提取液中藻蓝蛋白的纯度及各组分质量浓度按
如下公式计算[1 3-1 5 ]：
A620
藻蓝蛋白纯度(P)= ——— (1)
A280
A620－0.474A650
藻蓝蛋白质量浓度(cPC)/(mg/mL)=——————— (2)
5.34
A650－0.208A620
别藻蓝蛋白质量浓度(cAPC)/(mg/mL)=——————— (3)
5.09
A568－2.41(cPC＋cAPC)－0.849cAPC
藻红蛋白质量浓度(c PE ) / ( mg/m L)=————————————— ( 4 )
9.62
c×V
提取液中各种藻胆蛋白的含量(Y)/%= ———×100 (5)
mSP
式中：A 5 6 8、A 6 2 0、A 6 5 0 分别为蛋白溶液在波长
568、620nm和 650nm处的吸光度；c 为提取液中各蛋
白的质量浓度 /(mg/mL)，参照公式(2)～(4)计算；V为提
取液体积 /mL；Y为提取液中各种藻胆蛋白的含量；mS P
为藻粉原料的质量 /mg。
1.5.2 蛋白沉淀的 pH值测定
经等电点沉淀，将离心收集的蛋白沉淀置于通风橱
中敞口干燥，每隔 15min，准确称取 0.02g蛋白质沉淀，
溶于 2.0mL去离子水中，使其质量浓度达到 1g/100mL，
并测其 pH值，用以测试等电点沉淀法中酸性物质稀硫
酸及冰醋酸在蛋白沉淀中的残余情况。
1.5.3 粗蛋白粉末中藻胆蛋白组成及其含量分析方法
冷冻干燥后，准确称取粗蛋白粉末 0.02g，充分溶
解于 2.0mL磷酸缓冲液(pH7.0)，在 4℃、5000r/min离心
25min，吸取上清液，在波长 568、620、650nm 处测
吸光度，分别计算粗蛋白粉中藻红蛋白、藻蓝蛋白及
别藻蓝蛋白的含量。计算公式如下 [9 ]：
水平 A超声功率 /W B超声时间 /min C藻液质量分数 /%
1 540 15 15
2 630 20 10
3 720 30 5
表1 超声波细胞破碎正交试验设计
Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for the
optimization of ultrasonic cell disruption
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m.＇SP
粗蛋白得率(D)/% =——×100 (6)
m＇SP
C＇×V＇
粗蛋白中各种藻胆蛋白的含量(Y＇)/%= ————×100 (7)
mSP
Y＇PC×m＇SP
藻蓝蛋白的提取率(EPC)/%=—————×100 (8)
YPC×mSP
式中：m＇S P 为经冷冻干燥后，得到的粗蛋白粉末
质量 /mg；C＇为粗蛋白粉末溶解于磷酸缓冲液后各蛋白
的质量浓度 / (mg/mL)，参照公式(2)～(4)计算；V＇为
蛋白溶液体积 /mL；Y＇P C为粗蛋白中藻蓝蛋白的含量
1/%，参照公式(7)计算；Y P C为最初提取液中藻蓝蛋白
的含量 1/%，参照公式(5 )计算。
2 结果与分析
2.1 螺旋藻细胞超声破碎工艺条件的确定
根据表 1中三因素三水平的条件，设计 L 9(3 4)正交
试验表，采用极差分析，以确定超声破碎细胞的最佳
工艺条件，试验结果见表 2。
试验号 A B C 空列 YPC/% P
1 1 1 1 1 2.98 1.07
2 1 2 2 2 3.64 1.14
3 1 3 3 3 4.31 1.16
4 2 1 2 3 3.69 1.17
5 2 2 3 1 4.36 1.16
6 2 3 1 2 3.01 1.18
7 3 1 3 2 4.34 1.15
8 3 2 1 3 3.02 1.14
9 3 3 2 1 3.72 1.10
k1 3.64 3.67 3.00
k2 3.69 3.67 3.68
k3 3.70 3.68 4.34
R 0.06 0.01 1.34
k＇1 1.12 1.13 1.13
k＇2 1.17 1.15 1.14
k＇3 1.13 1.15 1.16
R＇ 0.05 0.02 0.03
注：kn、R分别为藻蓝蛋白的含量及极差；k＇n、R＇分别为藻蓝蛋白的
纯度及极差；n ＝ 1，2，3。
表2 超声细胞破碎工艺正交试验结果
Table 2 Arrangement and experimental results of orthogonal
array design for the optimization of ultrasonic cell disruption
从表 2中藻蓝蛋白含量的极差分析(R)可以看出，对
于提取液中的藻蓝蛋白含量而言，3个影响因素中，藻
液质量分数对其影响最大，超声功率次之，而超声时
间的影响最小。结果表明，藻液的配比浓度对超声波
细胞破碎影响最大，其主要原因有两点：首先，藻粉
在悬浊于水的过程中本身需要吸收一定的水量，故作为
超声波介质的水溶剂量相对减少。由于超声波具有在液
相中吸收大于在固相中吸收的特性，因此，随着藻悬
液浓度的减少，水溶剂量增大，细胞受超声的刺激也
增大，破壁率也随之提高，致使大量胞内蛋白溶出；
其次，由于藻胆蛋白在超过 30℃就开始变性[1 3 ]，故提
取藻胆蛋白应尽可能在低温下进行。超声波会产生很强
的热效应，若藻液浓度较高，超声所产生的热量在局
部不易扩散，部分蛋白可能会受热变性，导致所测蛋
白含量下降。从结果还可以看出，随着藻液质量分数
的降低，经超声后，提取液中藻蓝蛋白的含量也不断
增加。因此，选择藻液质量分数为 5 %。
对于超声功率而言，对细胞破碎具有一定的影响。
超声功率越大，它所产生的超声波越强，对细胞的破
坏性也越大。从结果看，也符合这一规律。随着超声
功率的加强，提取液中藻蓝蛋白的含量也有增加的趋
势；但超声波的热效应亦在不断增强，可能会造成局部
蛋白的变性。从这个角度考虑，超声功率应尽可能小
一些。从表 2 可以看出，超声功率的第二、三水平，
即 630W及 720W的结果较为接近，因此，综合藻蓝蛋
白含量及成本考虑，选择 630 W 超声功率比较合适。
本实验所选择的超声时间对于细胞破碎的影响最
小。这一因素的 3个水平，实验结果较为接近。说明
超声时间超过 15min，细胞的破壁率已经基本稳定，增
加量较少；随着时间的延长，超声波的热效应也会逐渐
增加，因此，从成本角度考虑，可选择第一个水平
15min。
综上分析，对于提取液中藻蓝蛋白的含量，从工
业化角度考虑，最优组合为 A 2 B 1 C 3。
从表2中藻蓝蛋白纯度的极差分析(R＇)可以看出，超
声功率对藻蓝蛋白纯度的影响最大，藻液质量分数次
之，而超声时间影响最小。
超声功率对于藻蓝蛋白纯度的影响较为明显。从实
验结果看，6 3 0 W 超声时，藻蓝蛋白的纯度最大；而
低于或高于 630W时，纯度均出现下降趋势。原因可能
为，细胞破碎过程中，藻红蛋白首先被释放到溶液中，
然后再为藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。因此，当超声功率
较小时，细胞破碎较慢，释放到溶液中的藻蓝蛋白较
少；随着功率逐渐增加，细胞破碎加快，破碎程度也
加大，使得藻蓝蛋白的释放量增加，纯度提高；但功
率继续加强，导致热效应增加，而藻蓝蛋白易发生变
性，纯度再次降低，故超声功率选用 6 3 0 W。
对藻液质量分数而言，随着质量分数的降低，纯
度不断上升，可能是由于破壁率提高和热效应减少共同
影响的结果。因此，藻液质量分数可选择 5 %；对于
超声时间，正如上一节的推测，随着时间的延长，大
149※工艺技术 食品科学 2010, Vol. 31, No. 10
量的藻蓝蛋白被释放到溶液中，纯度提高，而第二、
三水平，即超声 20min及 30min的结果几乎没有差别，
可认为超声 20min后，藻蓝蛋白的释放已相对稳定，故
可选择第二个水平 20min。因此，对于提取液中藻蓝蛋
白的纯度，最优组合为 A 2 B 2 C 3。
通过以上分析，藻蓝蛋白含量及纯度的最优组合出
现差异，主要在超声时间上。由于超声 15min和 20min，
对于藻蓝蛋白的含量几乎没有太大区别，而对于其纯度
存在一定的影响，故综合含量及纯度，最优条件组合
为 A 2 B 2 C 3，即藻液质量分数 5%、超声功率 630W、超
声时间 20min。
2.2 等电点沉淀工艺的确定
2.2.1 pH值对提取藻蓝蛋白的影响
分别以稀硫酸及冰醋酸溶液为等电点介质进行蛋白
沉淀实验，其结果见表 3、4。
迅速下降。因此，从生产角度考虑，选择 pH 值为 4. 0
时进行操作较为合适。
2.2.2 等电点介质对提取藻蓝蛋白的影响
由于采用等电点沉淀需要引入额外的化学试剂硫酸
及冰醋酸，故在提取蛋白过程中必须考虑其在蛋白中的
残留情况。本实验以蛋白沉淀 pH值的变化为依据，来
说明介质在沉淀中的残留情况。
pH D/% Y＇ PC/% EPC/%
3.0 32.6 2.5 18.5
3.5 40.5 7.7 71.5
4.0 50.5 7.9 91.3
4.5 39.5 8.3 75.4
5.0 28.6 7.6 50.0
6.0 19.3 7.2 31.9
表3 不同pH值的稀硫酸溶液对提取藻蓝蛋白的影响
Table 3 Effect of pH on phycocyanin precipitation by the addition
of dilute sulfuric acid
pH D/% Y＇PC/% EPC/%
3.0 31.6 2.4 17.8
3.5 42.3 7.4 72.3
4.0 52.5 7.7 92.7
4.5 41.5 8.2 77.6
5.0 27.4 7.7 48.2
6.0 20.6 7.0 33.1
表4 不同pH值的冰醋酸溶液对提取藻蓝蛋白的影响
Table 4 Effect of pH on phycocyanin precipitation by the addition
of glacial acetic acid
由表 3、4 可知，采用稀硫酸和冰醋酸作为等电点
沉淀的介质，在蛋白沉淀效果方面基本相似。当 pH值
为 4.0时，粗蛋白得率最大达到 52.5%。其中藻蓝蛋白
的含量为 7.7%，提取率为 92.7%。但在藻蓝蛋白的含
量方面，pH4 .5时最高，占粗蛋白总量的 8.3 % 左右。
由此推测，藻蓝蛋白的等电点可能位于 4.0～4.5之间，
当 pH值从 4.0升至 4.5时，藻蓝蛋白的沉淀量下降较为
缓慢，而其他藻蛋白的等电点偏离 4.5相对较远，沉淀
量下降较快，使得藻蓝蛋白在粗蛋白中的比重有所上
升。当 pH值降至 3.0时，发现蛋白开始变性，部分蛋
白沉淀不能溶于磷酸缓冲液，故藻蓝蛋白含量及提取率
从图 1 可以看出，离心后的蛋白沉淀置于通风橱
中，随着放置时间的延长，使用冰醋酸作为沉淀介质
的样品中，pH值不断上升，45min后，即由酸性转为
中性；而相同时间内，使用稀硫酸作为沉淀介质的样
品，其 p H 值变化不明显。由此可以推断，由于冰醋
酸易挥发的特点，残留于沉淀中的少量冰醋酸溶液，随
着时间延长不断挥发，且溶质冰醋酸的挥发速度高于溶
剂水的速度，使得在较短时间内，便可除去绝大部分
冰醋酸；而硫酸不易挥发的特点，使得其在蛋白沉淀中
不易除去。因此，从操作性及成本考虑，可采用易挥
发的冰醋酸替代硫酸作为等电点沉淀的介质。
综合等电点介质及 pH 值对藻蓝蛋白提取的影响，
采用冰醋酸介质，在 pH值为 4.0的条件下进行藻蛋白提
取，可达到较好的效果。
2.3 粗蛋白中藻胆蛋白成分分析
根据公式(2)～(4)及(7)进行计算，在所提取的粗
蛋白中，藻蓝蛋白含量 Y＇PC为 7.7%；别藻蓝蛋白含量
Y＇AP C为 7.9%；藻红蛋白含量 Y＇PE为 0.8%。
3 结 论
通过正交试验，优化了超声波细胞破碎及等电点沉
淀的工艺条件，实现了在低温下，较为便捷的从螺旋
藻粉中提取活性藻胆蛋白操作。结果表明，超声波细
胞破碎的最优条件为：藻液质量分数 5 %、超声功率
630W、超声时间 20min；而等电点沉淀则采用冰醋酸
为介质，在 pH 值为 4 .0 的条件下提取蛋白。经分析，
图1 放置时间对不同等电点介质提取蛋白质pH值的影响
Fig.1 pH change during standing for phycocyanin precipitation by
the addition of dilute sulfuric acid or glacial acetic acid
8
7
6
5
4
CH3COOH介质
H2SO4介质
pH
放置时间 /min
0 15 20 45 60
2010, Vol. 31, No. 10 食品科学 ※工艺技术150
粗蛋白得率为 52.5%；在粗蛋白中，藻蓝蛋白占 7.7%、
别藻蓝蛋白占 7.9%、藻红蛋白占 0.8%。
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