全 文 ：龙牙楤木总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注 CD40L表达的影响＊
崔现军 1　李明 2　鲁卫星 3#
(1北京地坛医院　北京 100015;2河南中医学院第一附属医院心内科;
　崔现军 ,男 ,博士 ,主治医师
#通信作者:鲁卫星 ,男 ,主任医师 ,博士生导师 , E-mail:weixinglu98@sina.com
＊国家自然科学基金资助项目(No.30572461)
3北京中医药大学东直门医院)
摘要:目的　探讨龙牙楤木总皂苷抗心肌缺血机制 ,为其应用于冠心病的防治提供理论基础。方法　
大鼠随机分为对照组(0.9%氯化钠溶液 10mL/kg)、龙牙楤木组(龙牙楤木总皂苷溶液 0.5g/kg)、氯
吡格雷组(氯吡格雷溶液 5mg/kg)。连续灌胃 5d后 ,结扎前降支 ,缺血 45min,再灌注 5min。观察
各组心肌组织病理改变程度 ,免疫组化法检测心内膜 CD40L表达 ,并检测心肌丙二醛(MDA)及谷胱
甘肽过氧化物酶(GSH-PX)水平。结果　与对照组比较 ,龙牙楤木总皂苷组及氯吡格雷组可减少
CD40L表达(P<0.05),提高心肌组织 GSH-PX活力(P<0.05),但无统计学差异(P>0.05);龙牙楤
木总皂苷组并可降低心肌 MDA水平(P<0.05)。结论　龙牙楤木总皂苷可减轻心肌缺血再灌注
CD40L表达 ,提高心肌 GSH-PX活力 ,减少心肌 MDA含量。
关键词:缺血再灌注;心肌;龙牙楤木总皂苷;CD40L;大鼠
中图分类号:R285.5
InfluenceofaralosidesonCD40Lexpressioninratswithmyocardial
ischemiaandreperfusion＊
CUIXian-jun1 , LIMing2 , LUWei-xing3#
(1BeijingDitanHospital, Beijing　100015;2DepartmentofHeartDiseases, FirstAfiliatedHospitalof
HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine;3DongzhimenHospital, BeijingUniversityofChinese
Medicine)
Abstract:Objective　Toinvestigatethemechanismofaralosidesinantagonismofmyocardialischemia,
andprovideatheoreticalbaseforitusedforpreventingandtreatingcoronaryheartdisease(CHD).
Methods　Alratswererandomlydividedintothecontrolgroup(0.9% sodiumchloridesolution, 10
mL/kg), aralosidesgroup(aralosidessolution, 0.5g/kg)andclopidogrelgroup(clopidogrelsolution,
5 mg/kg).Afterintragastricaladministrationofdrugsfor5 daysrespectivelyinalgroups, theanterior
descendingcoronarywasligatedtoinduceischemiafor45minutesandthenreperfusedfor5minutes.The
pathologicalchangesofmyocardialtissuewereobservedinalgroups, theexpresionofendocardial
CD40Lwasdetectedbyusingimmunohistochemistry, andlevelsofmyocardialmalondialdehyde(MDA)
andglutathioneperoxidase(GSH-PX)weredetected.Results　Comparedwiththecontrolgroup, the
expressionofCD40Ldecreased(P<0.05), andvigourofmyocardialGSH-PXincreased(P<0.05)in
aralosidesgroupandclopidogrelgroup, butthediferencewasnotsignificantstatisticaly(P>0.05).
ThelevelofmyocardialMDAdecreasedinthearalosidesgroup(P<0.05).Conclusion　Aralosidescan
decreasetheexpressionofCD40L, improvethevigourofmyocardialGSH-PXandreducethelevelof
myocardialMDAinratswithmyocardialischemiaandreperfusion.
Keywords:ischemiaandreperfusion;myocardium;aralosides;CD40L;rats
·323·
第 33卷第 5期 2010年 5月
Vol.33 No.5 May 2010　 　
北京中医药大学学报
JournalofBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine
　　龙牙楤木为五加科植物 ,在我国主要分布于东
北地区 ,资源丰富 ,其味辛 、平 ,有小毒 。具有补气安
神 ,强精滋肾 ,祛风除湿 ,活血止痛 ,健胃利水之功
效 。其主要成分为龙牙楤木总皂苷(Aralosides),既
往研究表明 Aralosides具有抗心肌缺血[ 1] 、调血
脂 [ 2]和抗炎 [ 3]等作用。冠状动脉粥样硬化性心脏
病是人类健康的主要杀手 ,研究发现动脉粥样硬化
斑块中的所有细胞几乎都表达 CD40L[ 4] , CD40L与
粥样斑块的发生 、发展及破裂有重要关系 [ 5] 。国外
学者已经提出 CD40L可作为冠心病治疗的靶点 [ 6] 。
通过观察心肌缺血再灌注(MI/R)过程中 CD40L、丙
二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的变
化 ,进一步探讨 Aralosides抗心肌缺血机制 ,为其应
用于冠心病的防治提供理论基础。
1　材料
1.1　实验动物
成年健康雄性 Wistar大鼠 , 动物许可证号:
SCXK(京)2007-0001,体重 250 ～ 300 g,由维通利华
实验动物公司提供。
1.2　药物与试剂
Aralosides由吉林大学基础医学院化学教研室
制备。氯吡格雷(Clopidogrel)由杭州赛诺菲圣德拉
堡民生制药公司生产 ,批号:0704084。多克隆兔抗
大鼠抗体 CD40L,即用型 SABC免疫组化试剂盒 ,
DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。
MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.3　仪器
小动物呼吸机(美国 KentScientific),多导生理
信号记录仪 (美国 BIOPAC), 显微镜 (BH2-Olym-
pus),数码成像 (SPOT-Ⅱ , 美国 Diagnostic公司),
MetaMorph图像分析软件(美国 UniversalImaging
Corporation)。
2　方法
2.1　动物分组与给药
大鼠 30只随机分为 3组 ,每组 10只。对照组给
予 0.9%氯化钠溶液 10mL/kg灌胃 ,龙牙楤木组给予
等体积 Aralosides液 0.5g/kg灌胃 ,氯吡格雷组予等
体积 clopidogrel溶液 5 mg/kg灌胃。连续灌胃 5d, 1
次 /d。末次给药 2h后 ,进行缺血再灌注实验。
2.2　动物模型建立方法
参照文献 [ 7]的大鼠缺血 /再灌注模型建立方
法进行实验 。大鼠进行麻醉后 ,仰卧位固定 。行气
管插管术 ,接呼吸机 ,以潮气量 0.5 mL, 呼吸频率
80次 /min。连多导生理仪记录标准 Ⅱ导联心电图 。
胸骨左缘第 3肋间剪开皮肤及皮下组织 ,钝性分离
肋间肌 ,打开胸腔 ,撑开第 3、4肋骨 ,打开胸膜和心
包。在左心耳与肺动脉圆锥之间 ,找到与心大静脉
走向一致(偶有两者伴行)行于心肌内 、隐约可见
的线状乳白色冠脉 。高位冠脉结扎处放一长约 1.5
mm、直径 0.5 mm软棉线 ,用 6.0丝线结扎 。进针
深度 1 ～ 1.5 mm、宽 2 ～ 3 mm,同时避免过多触及心
肌和刺破左肺叶。密切观察 Ⅱ导心电图变化 ,若结
扎即刻出现 R波振幅陡然升高 ,则为冠脉血流阻断
成功的标志 [ 8] 。再灌注时在棉线处剪断结扎线。
所有大鼠冠脉缺血时间为 45 min, 再灌注时间为
5min。
2.3　心肌组织病理学观察
在结扎线以下 2 ～ 3 mm,沿心脏横径将其一分
为二 ,取心底部分 ,经多聚甲醛固定 、石蜡包埋 、切
片 ,再经脱蜡 、复水 、苏木素-伊红染色(HE),光镜下
观察心肌病理变化 。
2.4　CD40L染色及定量分析
石蜡切片制备方法同上 。石蜡切片依次经常规
脱蜡至水 、热修复抗原 、滴加 5%BSA封闭液 ,采用
SABC法 ,按照试剂盒说明进行 CD40L免疫组织化
学染色。阳性表达于病变区的微血管内皮及心内
膜 ,呈棕黄色或棕褐色。由于各标本之间病变区微
血管的分布变异较大 ,故统一取心内膜阳性颗粒进
行比较。每张切片在 200倍镜下随机取 3个视野 ,
使用 MetaMorph图像分析软件进行定量研究 ,计算
面密度与积分光密度 ,取其均值。
2.5　MDA、GSH-PX含量测定
迅速切取缺血再灌注损伤区(左室游离壁前下
壁部分)心肌组织 0.1 g,按 1∶10的比例加入 0.9%
NaCl溶液 ,采用玻璃研磨器制成匀浆 ,离心取上清
液 -20 ℃保存待检。 MDA含量采用 TBA法测定。
GSH-PX含量采用比色法测定 。
2.6　统计方法
应用 SPSS统计软件包进行统计学分析 ,所测指
标用均值 ±标准差表示。多组间比较采用单因素方
差分析 ,两两比较采用 LSD检验。若组间方差不齐 ,
则采用非参数检验。 P<0.05为有显著性差异 。
3　结果
3.1　各组动物标本数
除去实验中死亡和结扎部位不正确者 ,每组动
物各剩 9只。
3.2　心肌组织病理及 CD40L定位观察
非缺血区心肌组织细胞 ,如右心室及左室后壁 ,
·324· 北京中医药大学学报　 　 　 　　　　　　　　　　　　　　第 33卷
在光镜下可见心肌细胞排列整齐 ,胞质染色均匀 ,核
呈圆形或椭圆形 ,染色质分布均匀。缺血区心肌细
胞(即左室前壁心肌)在光镜下表现为细胞水肿 ,心
肌纤维排列失去正常结构 ,呈明显的波浪状 。多数
心肌细胞核正常 ,胞质染色均匀 ,可见少量细胞核固
缩 ,还可发现白细胞与红细胞在间质中沉积 。以上
观察表明标本符合心肌缺血再灌注损伤的早期病理
变化 ,见图 1A、1B(本文彩图见插页 1)。 CD40L定
位表达于血管内皮及心内膜表面 ,见图 1C、1D。
3.3　各组病变区心内膜 CD40L表达定量的比较
由于组间方差不等 ,采用 Wilcoxon秩和检验分
别进行组间比较。龙牙楤木组与对照组比较 ,
CD40L面密度与积分光密度均明显减少 , 差异显
著 ,有统计学意义(P<0.05)。氯吡格雷组与对照
组比较 , CD40L面密度与积分光密度均明显减少 ,
差异显著 ,有统计学意义(P<0.05)。龙牙楤木组
与氯吡格雷组比较 , CD40L面密度与积分光密度无
显著差异(P>0.05)。结果见表 1。
表 1　各组病变区心内膜 CD40L定量表达( x±s)
Table1　Comparisonofexpressionofendocardial
CD40Linratsofalgroups( x±s)
组别
Groups n
剂量
Dose
面密度
Arealdensity
积分光密度
Integrated
lightdensity
龙牙楤木组
Aralosidesgroup 9 0.5 g/kg 4.32±2.23＊ 0.34±0.24＊
氯吡格雷组
Clopidogrelgroup 9 5 mg/kg 3.49±2.62＊ 0.28±0.22＊
对照组
Controlgroup 9 10 mL/kg 5.80±1.92 0.46±0.10
Hc 6.25 7.30
P <0.05 <0.05
　　注:与对照组比较 ＊P<0.05。 3组比较使用 Kruskal-
WalisH检验。
Note:＊P<0.05 comparedwithcontrolgroup.Kruskal-
WalisHusedincomparisonofthreegroups.
3.4　各组心肌组织中 MDA、GSH-PX水平
心肌组织 MDA水平比较:龙牙楤木组心肌
MDA水平比对照组显著减少 ,有统计学意义(t=
6.83, P<0.05);氯吡格雷组心肌 MDA水平与对照
组比较 ,二者无差异 ,无统计学意义(t=0.06, P>
0.05)。结果见表 2。
心肌组织 GSH-PX水平比较:龙牙楤木组与对
照组比较 ,心肌 GSH-PX水平显著增加 ,有统计学意
义(P<0.05);氯吡格雷组与对照组比较 , 心肌
GSH-PX水平显著增加 ,有统计学意义(P<0.05);
龙牙楤木组与氯吡格雷组比较 ,二者心肌组织 GSH-
PX水平无差异(P>0.05)。结果见表 2。
表 2　各组心肌组织中 MDA、GSH-PX水平的比较( x±s)
Table2　ComparisonoflevelsofmyocardialMDAand
GSH-PXinratofalgroups( x±s)
组别
Groups n
剂量
Dose
MDA
(μmol/L)
GSH-PX
(pU/L)
龙牙楤木组
Aralosidesgroup 9 0.5g/kg 10.51±3.95
＊
162.69±10.05＊
氯吡格雷组
Clopidogrelgroup 9 5mg/kg 19.52±3.53 162.88±11.37
＊
对照组
Controlgroup 9 10 mL/kg19.15±2.58 146.18±15.66
F 27.62 6.95
P <0.05 <0.05
　　注:与对照组比较＊P<0.05。 3组比较使用 One-Way
ANOVA检验。
Note:＊P<0.05 comparedwithcontrolgroup.One-Way
ANOVAusedincomparisonofthreegroups.
4　讨论
在过去 10年里 , CD40与 CD40L作为慢性炎症
参与者引起医学界广泛关注 ,尤其是其与动脉粥样
硬化的关系。 CD40L是由 261个氨基酸组成的 II
型跨膜蛋白 ,属于肿瘤坏死因子家族 。主要表达于
活化的 T细胞 、血小板及内皮细胞 [ 9] 。 CD40L存在
于静息状态的血小板胞浆之中 ,血小板活化时可迅
速易位到膜表面 ,并被剪切脱落到血浆 ,成为可溶性
CD40L(sCD40L),据估计血浆中 sCD40L约 95%来
自血小板 [ 10] 。膜结合的 CD40L和 sCD40L都有生
物活性。 CD40是由 277个氨基酸组成的 I型跨膜
蛋白 ,属于肿瘤坏死因子受体超家族 。表达于 B细
胞 、单核 /巨噬 细胞 、内 皮细 胞及 血小 板[ 11] 。
sCD40L可与血小板表面的 CD40结合 ,促进血小板
聚集 、血小板与白细胞的黏附及血小板释放活性
氧[ 12] ,促进血栓形成和炎症反应。阻断 CD40/
CD40L信号传导 ,可减少再灌注区血小板和白细胞
的募集 ,减少梗死面积[ 13] 。 CD40L在动脉粥样硬化
形成及斑块破裂的病理生理过程中扮演重要角
色[ 4-5] 。急性冠脉综合征(ACS)的发生是由于动脉
粥样硬化斑块破裂 ,继而诱发血小板聚集 ,形成冠脉
内血栓 ,导致冠脉完全或不完全闭塞。固然 ,人为结
扎冠状动脉造成心肌缺血与冠脉内斑块破裂所致
ACS病理生理有很大差别 ,由于活化的血小板及内
皮细胞均表达 CD40L[ 9] ,故以 CD40L作为干预的靶
点可以探讨药物对 MI/R的保护机制。实验结果发
·325·第 5期 崔现军等　龙牙楤木总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注 CD40L表达的影响
现 CD40L仅表达于病变区微血管和心内膜内皮细
胞 。既往研究表明 Clopidogrel通过抑制血小板聚
集 ,可减少血小板表达 CD40L,并减少血小板释放
sCD40L[ 14] 。实验结果发现 Clopidogrel可减少心内
膜 CD40L的表达 ,推测与上述机制有关。 Aralosides
也可减少心内膜 CD40L定量 ,提示其对心肌的保护
作用与此有关 ,并可能有抑制血小板聚集作用 。
MI/R早期伴随氧自由基急剧大量产生 [ 15] ,
MDA水平的高低间接反应出心肌细胞受自由基损
伤的严重程度。而 GSH-PX是体内广泛存在的一种
重要的催化过氧化物分解的酶 ,发挥保护细胞膜和
细胞功能完整性的作用。实验结果表明 Aralosides
提高心肌组织 GSH-PX活力 ,同时也相应地减少心
肌组织 MDA含量 ,其心肌保护作用机制确切。而
Clopidogrel虽能提高心肌组织 GSH-PX活力 ,却不
能降低心肌组织 MDA水平 ,似乎无心肌保护作用 ,
其确切机制有待于进一步研究明确 。实验结果提
示 ,与单一靶点的西药相比 ,中药具有多环节 、多靶
点效应 。另外 ,我们在其他实验中也发现 Aralosides
可明显减低大鼠急性心肌梗死死亡率 [ 16] 。
总之 , Aralosides能够减少实验性大鼠 MI/R过
程中 CD40L的表达 ,减少自由基对心肌细胞的损伤
作用。
参考文献:
[ 1] 邓汉武 , 李元建 , 沈乃 , 等.辽东楤木总苷对大鼠实验性
心肌缺血的保护作用 [ J] .中国药理学与毒理学杂志 ,
1988, 2(1):20-〗22.
[ 2] 姜永涛 , 徐绥绪.龙牙楤木化学组成及药理活性 [ J] .沈
阳药学院学报 , 1990, 7(4):290-292.
[ 3] SUHSJ, JINUH, KIMKW, etal.Triterpenoidsaponin,
oleanolicacid3-O-beta-d-glucopyranosyl(1→ 3)-alpha-l-
rhamnopyranosyl(1→ 2)-alpha-l-arabinopyranoside(OA)
fromAraliaelatainhibitsLPS-inducednitricoxideproduc-
tionbydown-regulatedNF-kappaBinraw264.7 cels[ J] .
ArchBiochemBiophys, 2007, 467(2):227-33.
[ 4] SCHONBECKU, LIBBYP.CD40signalingandplaquein-
stability[ J] .CircRes, 2001, 89(12):1092-1103.
[ 5] RIZVIM, PATHAKD, FREEDMANJE, etal.CD40-
CD40 ligandinteractionsinoxidativestress, inflammation
andvasculardisease[ J] .TrendsMolMed, 2008, 4(12):
530-538.
[ 6] VISHNEVTSKYD, KIYANISTAVA, GANDHIPJ.CD40
ligand:anoveltargetinthefightagainst[ J] .AnnPharma-
cother, 2004, 38(9):1500-1508.
[ 7] 张明 ,杨鹏麟 , 唐疾飞 ,等.大鼠缺血 /再灌注心肌顿抑模
型的改进 [ J] .基础医 学与临床 , 2006, 26(11):
1248-1249.
[ 8] 王砚青 , 江时森 , 刘平 ,等.大鼠心肌缺血-再灌注模型心
电图变化分析 [ J] .医学研究生学报 , 2006, 19(8):
701-702.
[ 9] ARRONJR, PEWZNERJY, WALSHMC, etal.Regula-
tionofthesubcelularlocalizationoftumornecrosisfactor
receptor-associatedfactor(TRAF)2 byTRAF1 reveals
mechanismsofTRAF2 signaling[ J] .JExpMed, 2002,
196(7):923-934.
[ 10] ANDRE P, NANNIZZIA L, PRASADSK, etal.
Platelet-derivedCD40L.theswitch-hitingplayerofcar-
diovasculardisease[ J] .Circulation, 2002, 106 (8):
896-899.
[ 11] WISCHHUSENJ, SCHNEIDERD, MITTELBRONNM,
etal.Deathreceptor-mediatedapoptosisinhumanmalig-
nantgliomacells:modulationbytheCD40/CD40Lsys-
tem[ J] .JNeuroimmunol, 2005, 162(1-2):28-42.
[ 12] CHAKRABARTIS, VARGHESES, VITSEVAO, etal.
CD40 ligandinfluencesplateletreleaseofreactiveoxygen
intermediates[ J] .ArteriosclerThrombVascBiol, 2005,
25(11):2428-2434.
[ 13] ISHIKAWAM, VOWINKELT, STOKESKY, etal.
CD40/CD40 ligandsignalinginmousecerebralmicrovas-
culatureafterfocalischemia/reperfusion[ J] .Circula-
tion, 2005, 111(13):1690-1696.
[ 14] XIAOZ, THEROUXP.Clopidogrelinhibitsplatelet-leu-
kocyteinteractionsandthrombinreceptoragonistpeptide-
inducedplateletactivationinpatientswithanacutecoro-
narysyndrome[ J] .JAmColCardiol, 2004, 43(11):
1982-1988.
[ 15] ZWEIERJL, TALUKDERMA.Theroleofoxidantsand
freeradicalsinreperfusioninjury[ J] .CardiovascRes.
2006, 70(2):181-190.
[ 16] 李明 , 崔现军 ,鲁卫星.龙牙楤木对大鼠急性心梗死亡
率的影响 [ J] .辽宁中医杂志 , 2009, 36(5):846-847.
(收稿日期:2010-01-30)
·326· 北京中医药大学学报　 　 　 　　　　　　　　　　　　　　第 33卷