全 文 ：研究论文
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Marine Sciences/ Vol.32 , No.6/ 2008
钝顶螺旋藻基因组质粒文库的构建及其在获得功能基因上的应用
田　李1 , 2 , 张晓雯1 , 2 , 秦　松1
(1.中国科学院 海洋研究所 ,山东 青岛 266071;2.中国科学院 研究生院 ,北京 100039)
摘要:利用改良的 SDS 法提取钝顶螺旋藻基因组 DNA , 经 Sau3AI 酶切 , 回收 1 ～ 2 kb 大小的片段 , 与
B amH I(S au3AI的同尾酶)酶切并去磷酸化后的 pBR322 质粒载体相连接 , 转入大肠杆菌(Escherichia coli)
Top10 细胞 ,构建了螺旋藻基因组质粒文库。根据 pBR322 载体上多克隆位点两侧序列设计锚定引物 , 根据
丝状蓝藻丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)保守序列设计简并引物 , 以螺旋藻质粒文库为模板 ,“ 巢式” 扩增出了
S TK 基因部分序列。螺旋藻基因组质粒文库的构建为功能基因研究提供了极大方便。
关键词:螺旋藻(Sp irulina);质粒文库;STK;克隆
中图分类号:Q959　　　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1000-3096(2008)06-0055-06
　　螺旋藻(S pirul ina)是一类丝状不形成异型胞的
蓝藻 ,因含有藻胆蛋白 、多糖 、胡萝卜素等多种生物
活性物质而受到广泛关注[ 1] 。作者构建了螺旋藻基
因组 DNA 的质粒文库 ,为进行螺旋藻功能基因的克
隆提供了方便。丝氨酸/苏氨酸激酶(Serine/T hreo-
nine Protein Kinases ,STK)系统 ,是一类信号转导系
统。在蓝藻中 ,这一系统通过感知外界信号 ,对外界
环境因子产生应答 ,从而对蓝藻的生存和生长产生
重要影响[ 2] 。张晓雯等[ 3] 对已测序蓝藻中的 S TK
系统进行了详细的分析 ,发现从单细胞蓝藻到丝状
蓝藻的进化历程中 , STK 系统的基因数目出现了快
速增长 ,这有可能和丝状蓝藻较为复杂的生活环境
有关。螺旋藻作为一类丝状蓝藻 ,常分布于湖泊 、池
塘和半咸水中 ,生活环境复杂[ 1] 。研究螺旋藻中的
S TK 系统 ,对螺旋藻培养条件的优化和螺旋藻品种
改良将会产生积极的作用。作者通过构建质粒文库
和基于文库的基因组步移技术 ,得到了螺旋藻 S TK
基因的部分序列。并且通过生物信息学分析 ,研究
了其进化特点。
1　材料与方法
1.1　材料
钝顶螺旋藻由本实验室保存 ,培养光照条件为
2 000 lx , 光暗周期为:12 h/12 h ,培养温度 23℃±
1℃。用 Zarrouk 培养基培养螺旋藻至 A5 60nm为
0.6 ～ 0.8 。筛绢过滤收集藻体 , T-A 克隆载体
pBS-T 为天根公司产品;pBR322 载体 ,为本实验
室保存 。
1.2　方法
1.2.1　螺旋藻 DNA 的提取
按茅云翔等[ 4] 的方法提取 DNA 。
1.2.2　螺旋藻质粒文库的构建
1.2.2.1　最适酶切条件的确定及特定长度基因组
DNA片段的制备
在 20 μL 酶切体系中分别加入酶单位梯度量
0.1 ,0.2 ,0.3 ,0.4 , 0.5 , 0.6 , 0.7 ,0.8 U 的 Sau3AI
切割基因组 , 摸索合适的酶切条件 , 以得到长度
(1 ～ 2 kb)合适的基因组片段。然后 ,以此酶量大量
酶切基因组 DNA 。琼脂糖电泳 ,将酶切产物按分子
质量大小区分开来 ,切下1 ～ 2 kb基因组片段对应的
胶条 ,用小量胶回收试剂盒(Fastag en公司)回收 。
1.2.2.2　pBR322 质粒的 BamHI酶切及去磷酸化
处理
将 pBR322 质粒在 37℃用 BamHI 充分酶切
4 h ,并用 CIAP 去除 5 端磷酸 。
1.2.2.3　连接及 CaCl2法转化大肠杆菌构建基因组
质粒文库
基因组 DNA与质粒的连接采用 10μL 连接体系:
1 ～ 2 kb基因组DNA片段7μL ,酶切并去磷酸化后的质
粒载体 1μL ,T4连接酶1μL ,T4连接buffer 1μL。
收稿日期:2007-09-10;修回日期:2007-12-10
基金项目:国家自然科学基金项目(30671065);中国科学院知识创新
工程项目(KSCX2-YW-G-002 ,KZCX2-YW-209)
作者简介:田李(1984-),男 ,硕士研究生 ,主要从事藻类分子生物学研
究 ,电话:0532-82898863 , E-mail:t ianli@ms.qdio.ac.cn;秦松 ,通讯作
者 ,电话:0532-82898500 , E-mail:sqin@m s.qdio.ac.cn
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大肠杆菌感受态细胞的制备与转化等操作参考
分子克隆实验指南[ 5] ,即用螺旋藻 DNA 部分酶切产
物与 pBR322质粒酶切并脱磷酸化后连接的产物进
行转化大肠杆菌 。
1.2.2.4　阳性转化子的鉴定
将转化后的大肠杆菌涂平板培养过夜后 ,随机
挑取 8个单菌落 ,转接于盛有 1 mL 含氨苄青霉素
LB 液体培养基的 EP 管中 ,37℃摇床培养 6 h 后 ,取
1μL 作 PCR模板 。用根据 pBR322质粒 BamHI酶
切位点两侧序列(并非紧靠 BamHI 酶切位点 ,而是
离它有20 ～ 30 bp的距离 ,这是后面设计“巢式”PCR
引物的需要)设计的引物 AP1 , AP2 ,进行阳性转化
子的 PCR检测。AP1和 AP2的引物序列分别为:
AP1:AGCCACTA TCGACTACGCGA
AP2:A TCGG TGA TGTCGGCGA TAT
PCR反应程序为 94℃预变性 5 min , 94℃变性
1 min ,59℃退火 1 min , 72℃延伸 1 min ,循环次数为
29次 ,72℃再延伸 10 min。
1.2.3　S TK基因部分序列的获得
1.2.3.1　STK 简并引物的设计
根据 NCBI数据库里公布的其他丝状蓝藻泡沫
节球藻(Nod ularia sp umigena)、红海束毛藻(Tri-
chodesm ium erythraeum)、鱼腥藻(Anabaena varia-
bi li s)、念珠藻(Nostoc sp.PCC7120)的 STK 基因序
列 ,利用 ClustalX对上述序列进行比对 ,根据比对出
来的保守序列(对应于 S TK 蛋白的 VIb 保守域)[ 6]
设计一条简并引物 TGG(A/ T)T TAATA TC(T/C)
C(T/G)(A/G)TG 。
1.2.3.2　第一次 PCR
用简并引物和 AP1 ,AP2分别构成一对引物 ,以
质粒文库为模板 ,进行第一次 PCR , PCR 程序为:
94℃预变性 5 min ,94℃变性 1 min ,60℃退火1 min ,
72℃延伸 1 min , 循环次数为 29 次 , 72℃再延伸
10 min。将得到的 PCR产物稀释 50 倍 ,用作巢式
PCR的模板。
1.2.3.3　巢式 PCR
根据 pBR322 的质粒序列 , 分别在 AP1 与
BamHI 和 AP2与 BamHI之间设计两条引物 ,命名
为 AP3 , AP4。用简并引物和 AP3 ,AP4分别构成一
对引物 ,以第一次 PCR产物 50倍稀释物为模板 ,巢
式 PCR得到部分 S TK 序列 。A P3 和 A P4 的序列
分别为:
AP3 :TCA TGGCGACCACACCCG TC
AP4:AGGCGCCAGCAACCGCACCT
PCR程序为:94℃预变性 5 min , 94℃变性
1 min ,62℃退火 1 min ,72℃延伸 1 min ,循环次数为
29次 ,72℃再延伸 10 min 。
1.2.3.4　PCR产物的检测与回收
取 15μLPCR反应产物 ,以 1%琼脂糖凝胶电泳
进行分析和回收;目的 DNA 片段的胶回收参阅
Fastagen公司的小量胶回收试剂盒说明书;凝胶的
制备和操作参考分子克隆实验指南[ 5] 。
1.2.3.5　目的 DNA 片段的连接及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和连接转化等操
作 ,参考分子克隆实验指南[ 5] ;按照天根公司的 T-A
克隆载体连接试剂盒的说明书 ,将酶切 DNA 片段与
pBS-T 质粒载体 16℃过夜连接;连接后转化已制备
好的大肠杆菌感受态细胞 , 37℃培养箱中在含有氨
苄的 LB培养基平板上过夜培养 。
1.2.3.6　阳性克隆的筛选与检测
将能在含氨苄 LB 培养基平板上生长的单菌落
挑取到到 1 mL 含有氨苄的 LB液体培养基 EP 管里
摇床培养 6 h ,以此菌液作为 PCR的模板 ,进行阳性
克隆的检测 。PCR检测使用 T3 , T7通用引物 , PCR
程序为 94℃预变性 5 m in , 94℃变性 1 min , 53℃退
火 1 min ,72℃延伸1 min ,循环次数为 29次;检测结
果均用 1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
1.2.3.7　测序
将检测结果为阳性的单菌落用甘油保种后 ,送
至国家人类基因组南方中心测序 。
1.2.4　系统发育分析
从 NCBI 下载部分丝状蓝藻和单细胞蓝藻的
STK序列 ,用 ClustalX[ 7] 进行序列比对 ,用 MEGA[ 8]
进行系统发育分析。
2　结果与分析
2.1　螺旋藻基因组 DNA 的提取
对提取的基因组 DNA 用 0.7%琼脂糖凝胶电
泳进行分析 ,结果如图 1所示。获得的基因组 DNA
大小约为 20 kb ,且条带较集中 , A260/ A280的比值在
1.80 ～ 1.88 之间 ,说明获得了较好质量的基因组
DNA ,可用于质粒文库的构建 。
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图 1　螺旋藻基因组在 0.7%琼脂糖凝胶上的电泳图
Fig.1　Electropho resis pa tte rn of total DNA isolated from
Sp irulina on 0.7% agar ose gel
M .Lambda DNA/ Eco RI+HindIII Marker;1.提取的螺旋藻基因组
M .Lambda DNA/ E coRI +HindIII M ark er;1.DNA isolated from
S piru lina
2.2　螺旋藻质粒文库的构建
2.2.1　基因组 DNA 部分酶切最适 S au3AI 浓度的
确定
图 2　螺旋藻基因组不同酶量 Sau3AI 的酶切电泳图
Fig.2 　Electropho resis pa ttern of to tal DNA digested by
different units o f Sau3AI
M a.Lam bda DNA/ EcoRI+HindIII Marker;Mb.DL2000 Marker;
1～ 8.分别用 0.1 , 0.2 , 0.3 , 0.4, 0.5 , 0.6 , 0.7 , 0.8 U的 Sau3AI 切割
基因组所得到的片段
M a.Lam bda DNA/ EcoRI+HindIII Marker;Mb.DL2000 Marker;
1～ 8.DNA digested by Sau3AI , the amoun ts of enzyme are 0.1 , 0.2 ,
0.3 , 0.4 , 0.5 , 0.6 , 0.7, 0.8 U respectively
从图 2可以看出 ,第 4泳道对应的酶量(0.8 U)
所切基因组大小在 1 ～ 2 kb 之间 ,符合构建基因组
DNA 质粒文库的要求。用此酶量大量酶切相应质
量的基因组 ,并用胶回收试剂盒回收1 ～ 2 kb之间的
DNA 片段 。
2.2.2　克隆载体制备
超螺旋质粒载体 pBR322 的 DNA ,经 BamHI
完全消化处理后于 1%琼脂糖凝胶电泳检测显示为
一条带 ,表明超螺旋质粒的 DNA 经 BamHI 酶切后
变成了线形 DNA 。本实验用牛小肠碱性磷酸酶
(CIAP)去除线状 DNA 两端的 5 磷酸基团 ,防止了
载体的自身连接并环化 ,从而降低了细菌转化时的
背景。
2.2.3　连接与转化
将 1 ～ 2 kb 的螺旋藻 DNA 片段与经 BamHI 酶
切并去磷酸化的质粒相连接 ,转化至大肠杆菌感受
态细胞后 ,在含有氨苄的 LB 平板培养过夜后 ,长出
单斑。
2.2.4　阳性克隆的鉴定
因 pBR322含有氨苄抗性基因 ,故阳性克隆能在
含有氨苄的 LB培养基平板上生长 ,长出的单菌落均
可视为阳性克隆 ,但仍需要进一步做 PCR检测 。如
果 1 ～ 2 kb 的螺旋藻基因组 DNA 片段插入到
pBR322的 BamHI酶切位点 ,那么通过设计的位于
此位点两侧的 A P1 , AP2引物 ,就可以按预期 PCR
得到 1 ～ 2 kb大小不等的片段 。
图 3　重组子质粒的 PC R鉴定(引物根据酶切位点两端的质
粒序列设计)
Fig.3　Amplification of DNA f ragment inse rted into pla smid
pBR322
Ma.Lambda DNA/ EcoRI+HindIII Marker;1 ～ 8.利用 8个单斑做
模板的 PCR扩增条带;9.阴性对照;M b.DL2000 M ark er
Ma.Lambda DNA/ EcoRI+HindIII M ark er;Mb:DL2000 Marker;
1～ 8.Amplif ication of DNA fragm en t u sing 8 dif ferent colonies in th e
plate as PCR template ;9.negat ive con trol
图 3为重组子质粒的 PCR检测结果 ,由图 3 可
见在随机挑选的 8 个单斑中 ,除第 2泳道对应的单
斑为假阳性外 , 其余各单斑均为阳性。阳性率为
87.5%,可满足下一步的实验需要。
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2.3　STK 部分序列的获得
文献认为 , STK 基因在进化过程中经历了广泛
的分化[ 9] ,反映到基因序列 ,表现出序列的保守性较
差。作者对几株丝状蓝藻的 STK 基因序列比对后
发现 ,只有对应于 STK 的第 VIb 保守域[ 6] 的基因组
序列尚比较保守 ,因此设计了一条简并引物。质粒
文库构建成功之后 ,相当于给基因组片段的一端加
上了锚定引物 ,可以和仅能设计出的一条简并引物
作为 PCR 的一对引物 , 以质粒文库为模板 ,进行
PCR扩增获得功能基因 。
用简并引物与 AP1 ,AP3引物 ,经过第一次和巢
式 PCR后得到一条 600 bp左右的主带(图 4),而用
简并引物和 AP2 , AP4经同样的程序 PCR后却没有
明显的主带产生 。这一结果的原因可能是由于基因
组片段正向或反向插入了质粒 ,当简并引物和锚定
引物退火结合同一条 DNA链时 ,就不会有明显条带
出现 ,只有当简并引物与锚定引物退火时结合不同
的 DNA 链时 ,才有可能得到理想的条带。这也是本
文分别设计两对锚定引物的原因。
本实验采用巢式 PCR ,进一步增强了扩增的特
异性 ,尽可能地避免了假阳性条带的出现 。正如图 4
所显示的 ,第一次 PCR仅有微弱的主带 ,并且伴有
smear;而经过巢式 PCR之后 ,主带明显清晰。
图 4　第一次 PCR和巢式 PCR的电泳图
Fig.4 　P rima ry PC R and secondary PCR at wa lking up-
stream of S TK
M.DL2000 Marker;1.第一次 PCR结果;2.巢式 PCR结果
M.DL2000 Marker;1.Primary PCR usin g AP1 , degeneracy primer
as PCR primers;2.nested or secondary PCR u sing AP3 , degen eracy
p rim er as PCR p rim ers
去除载体与 STK5′上游非编码序列后得到的
S TK部分序列(GenBank 注册号为 EU346751)见图
5。
图 5　螺旋藻 S TK5′端 504 bp 基因组序列及其编码的氨基酸序列
Fig.5　Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of 5′S TK in S pirulina
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2.4　系统发育分析
从部分蓝藻的系统发育树(图 6)中可以看到 ,
螺旋藻 STK 基因与丝状蓝藻该基因处于同一分支 ,
亲缘关系最近。丝状蓝藻的 STK 基因自成一个分
支 ,与单细胞蓝藻的 S TK区分开来 ,这提示 STK 序
列的进化有可能推动了蓝藻从单细胞生物进化为多
细胞生物。将 S TK 序列构建的系统发育树的拓扑
结构与用 16S r DNA序列构建的系统发育树(结果
未显示)的拓扑结构比较后发现 ,两者明显不同 ,这
说明 STK 在进化过程中经历了广泛的分化[ 9] ,并造
成了基因树与物种树的不一致。
图 6　不同蓝藻中 STK 基因的系统发育树
Fig.6　Phy logene tic tr ee s inferred f rom STK in diffe rent cyanobacteria using NJ method with Thermosynechococcus e longatus
BP1 as out-g roup
3　讨论
本文构建了螺旋藻的质粒文库 ,这不仅为本实
验室螺旋藻基因组计划打下了基础 ,而且为克隆螺
旋藻基因提供了方便。5′端编码区的测定常规是通
过 5′RACE[ 10] 获得的 ,但由于 RNA 易降解 ,因此存
在一定的技术难度 。通过质粒文库和 PCR手段 ,可
实现在 DNA 水平上对其 5′端的获得。这也是利用
了原核生物不存在内含子 ,所测基因组序列即是其
编码序列的特点 ,所以此方法对原核生物是有效的。
另外 ,获得 5′端的另一种常规方法是用试剂盒进行
GenomeWalke r[ 11] ,但由于试剂盒价格偏高 ,限制了
其应用 ,而本文采用的方法 ,仅使用了分子生物学中
最常规的试剂和仪器就可得到 5′端 ,所以不失为一
种经济的方法。
有关螺旋藻 S TK 基因 3′末端的获得和 STK 蛋
白的表达及功能验证 ,作者正在进行实验研究 ,并将
另文发表 。
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Construction of DNA library of Spirulina and its application in
cloning genes
TIAN Li1 , 2 , ZHANG Xiao-wen1, 2 , QIN Song1
(1.Key Laboratory of Expe rimental Marine Biolog y , Institute of Oceanolo gy , the Chinese Academy of Sci-
ences , Qingdao 266071 , China;2.Graduate U niversi ty o f Chinese Academy o f Sciences , Bei jing 100049 ,
China)
Received:Sep., 10 , 2007
Key words:Sp irulina;genomic librar y;S TK;clone
Abstract:The genomic DNA iso lated f rom S pirulina was digested by S au3AI.The DNA fragments w ith
leng th of 1 ～ 2 kb w ere cloned into plasmid vecto r pBR322 which w as previously digested w ith BamHI and
dephospho ry lated wi th calf alkaline pho sphatase.The recombinant plasmid w as transformed into Escherichia
col i Top10 competent cells and the genomic library w as const ructed.Using the ancho r prime r and degenera-
ted primer , we obtain 5 end of ST K in S pirulina f rom this g enomic library.
(本文编辑:张培新)
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