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螺旋藻 γ-亚麻酸的提取优化
及体外抗氧化活性的研究
王 菲1，2，佘星星1，孙冰洁1，杜嘉琛1，张家玮1，任迪峰1，* ，鲁 军2，*
(1.北京林业大学生物科学与技术学院，北京市林业食品加工与安全重点实验室，北京 100083;
2.中国食品发酵工业研究院，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京 100015)
摘 要:以螺旋藻粉为原料，采用溶剂萃取法提取不饱和脂肪酸 γ－亚麻酸，研究了提取溶剂、提取料溶比、提取温度、
提取时间等工艺条件对提取得率的影响，并优化提取条件。此外对其体外清除自由基、抗脂质过氧化能力及对 H2O2
氧化损伤人正常肝细胞 HL－7702 保护能力进行研究。结果表明:乙醇为溶剂、料溶比 1∶12(w /v)、提取温度 70℃，提取
时间 90min时能够得到最高的 GLA产量(8.3 ± 0.17)g·kg －1(GLA /干量) ，温度对提取率影响最大。GLA 提取物显示
出了较强的脂质抗氧化能力，10mg·L －1 GLA提取物的抑制效果优于 100mg·L －1 VC，但其清除自由基能力较低，表明脂
质环境能够促进其抗氧化效果，且螺旋藻 GLA提取物具有保护 H2O2 所致氧化损伤 HL－7702 细胞的效果。
关键词:γ－亚麻酸，螺旋藻，提取，抗氧化活性
Study on the optimized extraction and in vitro antioxidant activities
of γ－Linolenic acid from Spirulina platensis
WANG Fei1，2，SHE Xing－xing1，SUN Bing－jie1，DU Jia－chen1，ZHANG Jia－wei1，ＲEN Di－feng1，* ，LU Jun2，*
(1.Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，College
of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China;
2.Beijing Engineering Ｒesearch Center of Functional Peptides，
China National Ｒesearch Institute of Food ＆ Fermentation Industries，Beijing 100015，China)
Abstract:Polyunsaturated acid GLA was extracted from Spirulina platensis，and the effects of different solvent，
solid－ liquid ratio，reaction temperature and reaction time on GLA yield and optimal process were also discussed.
Besides，free radical scavenging activity，antioxidant capacity of GLA extract and protective effect on H2O2 －
induced HL－7702 cells were investigated，respectively.The results showed that the ethanol extraction at 70℃ with a
sample－solvent ratio(w/v)of 1 ∶ 12 for 90min achieved the highest GLA yield of(8.3 ± 0.17)g·kg － 1(GLA /dry
biomass).The reaction temperature was the most significant factor among others.GLA extract exhibited strong
inhibition effect on lipid peroxidation，of which the inhibitory effect of 10mg·L － 1 GLA extract was even higher than
that of 100mg·L － 1 Vitamin C，while little activity was detected in the free radical scavenging activity，indicating that
lipid environment might facilitate its antilipid peroxidation function.Moreover，the GLA extract exhibited protection
effects on HL－7702 cells from oxidative damage induced by H2O2.
Key words:γ－Linolenic acid(GLA);Spirulina platensis;extraction;antioxidant activities
中图分类号:TS201.4 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2014)19－0068－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2014． 19． 005
收稿日期:2013－05－14
作者简介:王菲(1988－) ，女，硕士，研究方向:天然产物提取及其应用。
* 通讯作者:任迪峰(1973－) ，女，博士，教授，研究方向:食品营养与
生物技术。
鲁军(1973－)，男，博士，高级工程师，研究方向:功能性食品。
基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET－11－0587);国家自
然科学基金(31201339);国家林业公益性行业科研专项资金
(201304805);国家高技术研究发展计划(863 计划)项目
(2013AA102205);十二五国家科技支撑计划(2012BAD33B04)和
北京市科委领军人才项目(Z131110000513026)支持。
钝顶螺旋藻(Spirulina platensis，SP)属蓝藻门
(Cyanophyta) ，颤藻科(Oscillatoriales) ，螺旋藻属或节
旋藻属(Arthrospira)［1］。螺旋藻富含人体必需氨基
酸、维生素、矿物质、微量元素、不饱和脂肪酸等多种
营养物质，具有抗氧化、抗辐射、抗肿瘤等多种生物
功效［2－3］，被联合国粮农组织及联合国世界食品协会
推荐为“二十一世纪最理想食品”。螺旋藻中 GLA含
量占其总脂肪酸含量 80～250g·kg －1［4］，高于螺旋藻常
见提取来源月见草(80g·kg －1)和琉璃苣(210g·kg －1)。
螺旋藻生产厂家遍布云南、内蒙古等 10 多个省份，
年产量高达 1000t［5］，但目前市场螺旋藻产品多为藻
69
粉和片剂，螺旋藻粉直接应用于食品中因其溶解性
质的局限性，不利于人体吸收，因而螺旋藻应用受到
一定限制。
γ－亚麻酸是人体代谢过程中不可或缺的多不饱
和脂肪酸，是合成前列腺素 E1 的前体物质。GLA 还
能够衍生成如二高－γ－亚麻酸(DHGLA)以及花生四
烯酸(AA)等物质［6］。GLA 及其衍生物具有多种有
益的药理作用。许多研究证明，GLA 具有多种生物
活性，如抗肿瘤，减肥，抗血栓，降低低密度脂蛋白等
活性［7－10］。
目前，有研究采用超临界 CO2 萃取法(SCE)，以
乙醇为夹带剂，从极大螺旋藻中提取 GLA，回收率为
4.4g·kg －1(GLA /干量)［11］。Sajilata 等人［12］优化了
SCE提取方法，从钝顶螺旋藻中提取得到 5.1g·kg －1
GLA。但是 SCE 高成本，产率低的特点限制了其在
大规模工业化提取 GLA 中的应用。此外，对于 GLA
的体外抗氧化活性鲜有报道。因此，本研究目的为
建立一种经济的从螺旋藻中提取 GLA的有机溶剂提
取方案，并对螺旋藻 GLA的抗氧化活性进行研究，为
开发利用我国丰富螺旋藻资源以及开发新型医疗保
健食品提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
螺旋藻粉 内蒙古再回首生物工程限公司(中
国内蒙古，鄂尔多斯);人正常肝细胞 HL－7702 细胞
系 中国科学院上海细胞库，培养于含有 10%胎牛
血清以及 1%青霉素链霉素的 ＲPMI1640 培养基中;
γ－亚麻酸甲酯标准品 美国 AccuStandard 公司;乙
醇、丙酮、石油醚(分析纯)等试剂 北京化学试剂
公司。
7890A气相色谱 安捷伦，配有火焰离子检测器
和 INNOMAX 极性柱(30m × 250μm × 0.25μm);
SHZ－88水浴恒温振荡器 金坛市国旺实验仪器厂;
SHB－ III 真空泵 郑州长城科工贸有限公司;
ＲE－5203旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;752 紫
外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 提取方案设计 采用单因素实验方法对螺旋
藻中 GLA 进行提取，探讨提取溶剂、提取料溶比、提
取温度、提取时间对提取得率的影响。
将 60g螺旋藻粉放入避光烧瓶中，加入 60mL 提
取溶剂，于 60℃恒温水浴 120min 后，转移到旋转蒸
发仪。在压力 175MPa 温度 40℃条件下蒸去大部分
溶剂后，产物冷冻干燥并进行 GLA 定量。将螺旋藻
粉与提取效果最好溶剂乙醇分别以不同料溶比
(w /v):1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶18 混合，其余操作步
骤同上所述。将螺旋藻粉与乙醇以从上步实验获得
最佳料溶比混合，分别在 60℃水浴加热 30、60、90、
120、150min，其余步骤如上所述。按照之前实验所
得最佳料溶比、最佳提取时间，分别在 30～80℃水浴
温度条件下，每 10℃一组，进行提取实验，后续步骤
如前所述。
1.2.2 GLA含量测定 将真空冷冻干燥后的提取物
用正己烷溶于 10mL 的烧瓶中，加入 1mL H2SO4 －
CH3OH(1∶9，v /v)混合液后在 70℃条件下恒温水浴
10min进行甲酯化。甲酯化后样品置于室温下冷却
后加入 1mL 正己烷后，再加入去离子水定容至
10mL。取上层液体 1μL用于气相色谱定量。定量时
流速 30mL·min －1，程序升温，190℃保持 3min 进而以
8℃·min －1速度升高至 230℃并保持 8min。注射器和
检测器的温度分别是 220℃和 250℃。
将 γ－亚麻酸甲酯标准品溶于正己烷配制不同浓
度 0.025、0.050、0.075、0.100、0.125g·L －1的溶液，GC
定量分析后，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制
标准曲线。标准曲线显示良好线性关系(Ｒ2 =
0.9941)。将提取得到螺旋藻 GLA样品甲酯化后，GC
色谱进样定量，得到峰面积带入公式(1)纵坐标，得
到 γ－亚麻酸甲酯浓度后换算为 GLA浓度。
y = 1153.2x－11.743 (1)
最终螺旋藻 GLA提取产量由下式计算:
GLA产量 =(提取所得 GLA 浓度 × 1mL × 10)/
藻粉质量 × 100
1.2.3 实验参数正交优化及螺旋藻 GLA纯化 基于
料溶比(1 ∶ 10、1 ∶ 12、1 ∶ 15)、提取时间(60、90、
120min)、提取温度(60、70、80℃)三个单因素实验结
果，进行了 L9(3
4)三因素三水平正交实验优化实验
参数，实验设计如表 1 所示。采用文献［12］方法对
螺旋藻 GLA进行纯化，纯化后螺旋藻 GLA提取物纯
度由 58.9%提高到 90%，进一步应用于抗氧化活性
分析。
表 1 L9(3
4)正交实验的各个因素和水平
Table 1 Factors and levels of the L9(3
4)orthogonal test
水平
因素
A料溶比
(W/V)
B提取时间
(min)
C提取温度
(℃)
1 1∶10 60 60
2 1∶12 90 70
3 1∶15 120 80
1.2.4 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基清除能
力采用 Burits等人［13］的方法进行测定。
1.2.5 羟自由基清除能力 参照周波等人［14］方法进
行测定。
1.2.6 脂质抗氧化能力 脂质过氧化抑制能力评价
采用文献［15］的方法，利用不饱和脂肪酸氧化产物
与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成有色化合物在
535nm有最大吸收值。此法基于卵磷脂能够创造一
层脂质层用于反应并且 Fe2 +能够诱导氧化反应。
1.2.7 对双氧水氧化损伤 HL－ 7702 细胞保护作
用 将生长良好的 HL－7702 细胞以 1 × 105mL －1密度
接种于 96 孔板，每孔 100μL，于 37℃ CO2 培养箱中
孵育 24h。细胞贴壁后以含 50μmol·L －1 GLA 提取物
培养基预先孵育 24h，再以不同浓度双氧水染毒
HL－7702细胞 18h，并设置对照组及调零孔，每组三
个复孔。处理后的细胞采用 MTT比色法进行细胞活
率检测，每孔加入 20μL 0.5% MTT(5mg·mL －1)避光
70
表 2 单因素实验结果
Table 2 Ｒesults of single factor test
溶剂
产量
(g·kg －1)
料溶比
产量
(g·kg －1)
提取时间
(min)
产量
(g·kg －1)
提取温度
(℃)
产量
(g·kg －1)
乙醇 6.37 ± 0.15 1∶8 6.23 ± 0.25 30 5.87 ± 0.35 40 3.33 ± 0.38
丙酮 3.73 ± 0.45 1∶10 6.43 ± 0.21 60 6.33 ± 0.59 50 3.67 ± 0.35
石油醚 0.47 ± 0.06 1∶12 6.93 ± 0.06* 90 6.90 ± 0.26* 60 6.67 ± 0.32*
1∶15 6.97 ± 0.29 120 6.98 ± 0.24 70 8.27 ± 0.29*
1∶18 7.07 ± 0.15 150 7.43 ± 0.42 80 4.50 ± 0.40
注:结果表示为 Mean ± SD(n = 3);* :差异显著性(p ＜ 0.05)。
37℃孵育 4h 后吸弃上清液，加入 100μL 的 DMSO，避
光振荡 10min，使结晶物充分溶解后，酶标仪 492nm处
测定吸光值。结果表示为同对照组相比的百分值。
2 结果与分析
2.1 各个提取条件对提取结果影响
本实验分别控制提取溶剂、提取温度、料溶比、
提取时间等因素的变化来研究各个因素对提取结果
的影响，实验结果如表 2 所示。
从表 2 中看出，乙醇提取效果明显优于其它两
种有机溶剂。乙醇溶剂提取产率近于丙酮提取产率
的 2 倍，并且将近石油醚提取产量的 12 倍。此外，由
于丙酮作为提取溶剂时可能会转化为有害的丙
酸［16］，而乙醇常被用于从植物材料中提取天然产
物［17］，因而选用乙醇作为从 SP 中提取 GLA 的提取
溶剂。乙醇在提取 SP 中的油脂时其夹带效果与其
自身氢键和离子力共同作用，从而增加了油脂在乙
醇中的溶解度，因而 GLA产量得到提高［18］。
随着料溶比由 1∶8 降低至 1 ∶12 时，GLA 产量显
著增加，当料溶比继续降低时，产量仍略有升高，但
不显著。此结果与之前研究表现出相同的趋势，表
明了随着料溶比降低，螺旋藻中油脂产量升高［19］。
GLA产量随着时间变化趋势与料溶比相似，提
取时间 90min 及 150min 时均出现增长，从成本节约
角度考虑，90min 为较适宜提取时间。同样随着提取
温度升高，GLA与乙醇的扩散率进一步加剧，GLA产
量大幅度升高。
随着提取温度升高至 60℃时，GLA 产量显著升
高，温度继续上升至 70℃时 GLA 产量达到最大。这
是由于溶剂和溶质(脂质成分)扩散性加剧所致。但
当提取温度高于乙醇沸点 70℃时，大量乙醇溶剂沸
腾而挥发至空气中，提取溶剂急剧减少，导致提取效
率急剧下降［19］。
2.2 正交实验优化
L9(3
4)正交实验结果如表 3 所示，三个因素对
GLA产量的影响顺序从高到低分别为提取温度、料溶
比、提取时间(C ＞ A ＞ B)。最优组合为 A2B2C2 即料溶
比 1∶12，提取时间 90min，提取温度 70℃。采用最优条
件从 SP中提取 GLA得到了(8.3 ± 0.17)g·kg －1，与之前
研究中采用 SCE方法得到的产率4.4g·kg －1和 5.1g·kg －1
相比，产量至少提高了 62.7%［11－12］。
2.3 螺旋藻 GLA抗氧化活性
以广泛公认的抗氧化剂 VC 为阳性对照，螺旋藻
GLA提取物 DPPH 自由基抑制活性结果如表 4
所示:
表 3 L9(3
4)正交实验结果及方差分析
Table 3 Ｒesults and variance analysis
of the L9(3
4)orthogonal test
实验号 A B C 空
GLA产量
(g·kg －1)
1 1 1 1 1 6.2
2 1 2 2 2 7.5
3 1 3 3 3 4.0
4 2 1 2 3 7.7
5 2 2 3 1 4.5
6 2 3 1 2 7.0
7 3 1 3 2 4.6
8 3 2 1 3 6.8
9 3 3 2 1 7.1
K1 17.7 18.5 20.0 17.8 T = 55.4
K2 19.2 18.8 22.3 19.1
K3 18.5 18.1 13.1 18.5
方差 平方和 自由度 均方 F值
A 0.376 2 0.188 1.331
B 0.082 2 0.041 0.291
C 15.282 2 7.641 54.150*
Error 0.282 2 0.141
注:差异显著性，p ＜ 0.05，F0. 05(2，2)= 19。
表 4 GLA提取物对 DPPH自由基清除效果
Table 4 Inhibitory activity of the γ－linolenic acid extract on
1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl radicals
VC 浓度
(mg·L －1)
抑制百分率
(%)
GLA浓度
(mg·L －1)
抑制百分率
(%)
100 13.18 ± 0.16 0.1 0.22 ± 0.08
200 24.28 ± 0.36 1 1.45 ± 0.16
400 58.96 ± 0.28 10 2.12 ± 0.15
600 72.02 ± 0.41 100 3.45 ± 0.34
800 91.33 ± 0.19 1000 4.46 ± 0.27
随着 VC 浓度升高(100 ～ 800mg·L
－1)，其对
DPPH自由基抑制率呈线性升高(y = 112.59x +
4.6648，Ｒ2 = 0.9735)，展现了良好的 DPPH 自由基清
除效果。但与之相反，尽管 GLA浓度呈指数升高，其
抑制效果仍然较低。
71
同样的，VC 展现出明显的羟基自由基清除效果，
如表 5 所示，尽管随着 GLA提取物浓度升高，抑制百
分率相应小幅度升高，在一定浓度范围内展现出了
羟基自由基清除效果，但不足以充分体现其抗氧化
活性。
表 5 不同浓度 VC /GLA的羟基自由基清除能力
Table 5 Inhibitory activity of the γ－linolenic
acid extract on hydroxyl radicals
VC 浓度
(mg·L －1)
抑制百分率
(%)
GLA浓度
(mg·L －1)
抑制百分率
(%)
50 13.84 ± 0.05 0.001 4.72 ± 0.65
100 23.13 ± 0.40 0.01 6.19 ± 0.65
200 32.90 ± 0.30 0.1 8.47 ± 0.30
400 49.67 ± 0.35 1 9.45 ± 0.65
800 63.68 ± 0.65 10 9.93 ± 0.15
GLA提取物脂质抗氧化能力如表 6 所示，螺旋
藻 GLA与 VC 均展现出良好的脂质抗氧化能力，并呈
浓度依赖性。10mg·L －1的 GLA提取物的自由基抑制
率(47.67% ± 0.40%)甚至高于 100mg·L －1的 VC，展
现出了极强的脂质抗氧化能力。实验证明以大鼠尾
模型，饲喂添加 GLA 饲料后其体内总抗氧化能力及
抗脂质过氧化能力得到增强［20］。
表 6 不同浓度 GLA提取物的脂质抗氧化能力
Table 6 Inhibitory activity of the γ－linolenic
acid extract on Fe2 + induced lipid peroxidation
VC 浓度
(mg·L －1)
抑制百分率
(%)
GLA浓度
(mg·L －1)
抑制百分率
(%)
10 23.61 ± 1.05 0.001 7.46 ± 2.80
50 28.36 ± 0.40 0.01 15.13 ± 0.55
100 46.05 ± 0.05 0.1 24.93 ± 0.25
500 68.49 ± 0.55 1 36.11 ± 0.20
1000 81.73 ± 0.25 10 47.67 ± 0.40
2.4 螺旋藻 GLA对双氧水所致 HL－7702 细胞氧化
损伤的保护作用
较早实验结果显示 250μmol·L －1浓度以下的螺
旋藻亚麻酸对 HL－7702 细胞无损伤作用(数据未显
示)。图 1 显示，不同浓度双氧水处理均会对
HL－7702细胞造成损伤，且呈现出浓度依赖性，
700μmol·L －1双氧水处理导致细胞活率下降为对照
组的 60%。50μmol·L －1螺旋藻 GLA 预先孵育处理
能够有效抑制各个浓度双氧水导致的细胞活率下
降，尤其对 700μmol·L －1损伤细胞具有显著保护作
用。这可能与其较强的脂质抗氧化能力有关，通过
自身氧化抑制 HL－7702 细胞膜脂质过氧化发生，避
免细胞因细胞膜受损所致细胞活率下降。
3 讨论
DPPH自由基被广泛用于测定多种天然物质的
体外抗氧化活性，这是因为其能够排除葡萄糖干扰
而具有很好的稳定性［21］。但最近有争论称其不存在
于体内，因而不能反映真实的代谢情况［22］。Fenton
反应是最常见的产生羟基自由基的化学反应，邻菲
图 1 GLA提取物对 H2O2 所致氧化损伤
HL－7702 细胞保护作用
Fig.1 Protective effect of GLA
on H2O2－induced HL－7702 cells
注:n = 3，* :p ＜ 0.05 vs 正常对照组;
#:p ＜ 0.05 vs H202 损伤组。
罗啉－Fe2 +是一种常见的氧化还原指示剂，能够根据
系统的氧化还原状态的变化改变它的颜色。此外，
GLA具有高不饱和度而极易被氧化，DPPH 和羟基自
由基清除法为水相环境，可能会导致水包油型乳状液
的氧化，因而影响 GLA提取物的稳定性以及自由基清
除能力［23］。因此，GLA提取物在水相环境中没有展现
出明显的抗氧化活性，其抗氧化能力受到了限制。
亚铁离子能够诱导脂质产生自由基，并引发链
反应，最终导致脂质过氧化作用。而具有抗氧化能
力的物质能够与脂质过氧化的中间产物发生反应，
例如脂质自由基，终止链反应并最终抑制脂质过氧
化。这种机制可以用来建立一种不饱和脂肪酸
(UFA)的氧化模型，用来评估样品的抗氧化性。螺
旋藻 GLA 清除 DPPH自由基和羟基自由基活性实验
提示虽然螺旋藻 GLA 提取物本身容易被氧化，但难
以在水相环境中发挥其抗氧化活性。与之相反，脂
质抗氧化能力能够成功模拟体内的脂质环境，因而
螺旋藻 GLA提取物表现出较强的脂质抗氧化能力。
H2O2 常用于制造氧化应激引起的细胞损伤模
型，氧化损伤细胞中由 H2O2 介导的自由基 ＲOS大量
产生［24］。在人体内，不饱和脂肪酸是细胞膜的组成成
分，容易受到自由基的攻击，从而导致不可控的链反应
发生脂质过氧化并最终导致生物损伤。GLA 提取物
可能先通过自身被氧化保护细胞或者细胞膜免受自由
基攻击，并保护细胞免受脂质过氧化的威胁，最终降低
由自由基带来的损伤，对氧化损伤 HL－7702 细胞起到
保护作用。关于螺旋藻 GLA 提取物的抗氧化护肝效
果的详细作用机制有待进一步深入研究。
4 结论
4.1 同丙酮和石油醚相比，乙醇更适合作为从 SP中
提取 GLA的提取溶剂。
4.2 以乙醇为溶剂，1∶12(V /V)料溶比 70℃恒温条
件下提取 90min 能够得到最高 GLA 产量 8.3 ±
0.17g·kg －1(GLA /干物质量)。
4.3 螺旋藻 GLA 提取物具有较强的抑制 Fe2 +诱导
的脂质过氧化效果。
4.4 螺旋藻 GLA 提取物能够保护人正常肝细胞免
72
受双氧水所致氧化损伤，其体外抗氧化生物活性具
有潜在功能应用价值。
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