全 文 ：摇
第 34 卷 第 4 期
2016 年 7 月
食 品 科 学 技 术 学 报
Journal of Food Science and Technology
Vol郾 34 No郾 4
Jul. 2016
摇
doi:10. 3969 / j. issn. 2095鄄6002. 2016. 04. 000 文章编号:2095鄄6002(2016)04鄄0000鄄00
引用格式:马艳芳,李玉洋,刘金龙,等. 碱性蛋白酶水解螺旋藻制备抗氧化活性肽的工艺优化[J]. 食品科学技术学报,2016,
34(4): - .
MA Yanfang,LI Yuyang,LIU Jinlong, et al. Optimization of hydrolysis conditions for antioxidative peptides from spirulina
using alcalase[J]. Journal of Food Science and Technology, 2016,34(4): - .
碱性蛋白酶水解螺旋藻制备抗氧化活性肽的工艺优化
马艳芳1,摇 李玉洋1,摇 刘金龙1,摇 郑明刚2,摇 孙中涛1,*
(1.山东农业大学 生命科学学院, 山东 泰安摇 271018;
2.国家海洋局 海洋生物活性物质与现代分析技术重点实验室, 山东 青岛摇 26600)
摘摇 要: 为了提高螺旋藻肽的抗氧化能力与收率,采用单因素实验和响应面法对碱性蛋白酶水解
螺旋藻粉制备抗氧化活性肽的工艺条件进行优化。 实验结果表明,与木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味
蛋白酶相比,碱性蛋白酶对螺旋藻粉的水解能力最强,其最适水解条件为 55郾 46 益、pH 值为 6郾 71、
固液比为 1颐 10郾 83。 在此条件下,酶解 240 min,螺旋藻肽的得率为 58郾 500% ,与优化前相比,提高
了 15郾 61% 。 所制备的螺旋藻肽具有较强的抗氧化能力,在质量浓度为 0郾 860 g / L 时,其 DPPH 自
由基清除能力为 77郾 597% ,与优化前相比,提高了 7郾 62% 。
关键词: 螺旋藻; 碱性蛋白酶; 抗氧化活性肽; DPPH自由基清除能力
中图分类号: TS201郾 4; Q556摇 摇 摇 摇 摇 文献标志码: A
收稿日期: 2015 11 26
基金项目: 国家海洋局海洋生物活性物质与现代分析技术重点实验室开放基金(MBSMAT-2014-05)。
作者简介: 马艳芳,女,硕士研究生,研究方向为发酵工程与酶工程;
*孙中涛,男,副教授,博士,主要从事发酵工程与酶工程方面的研究。 通信作者。
摇 摇 螺旋藻(Spirulina platensis Geitl)是一种由单细
胞或者多细胞组成的丝状低等原核生物,藻胆蛋白
含量高达 50% ~70% [1],且氨基酸组成比例非常理
想[2],被联合国粮农组织认定为“人类 21 世纪最佳
保健品冶和“未来超级营养食品冶 [3 - 4],但螺旋藻溶
解性差、腥味浓重[5]的缺点使其在食品行业中的应
用受到限制。
经蛋白酶适度水解后的螺旋藻粉,物化特性和
生物效价改善的同时还提高了营养价值。 与螺旋藻
蛋白相比,其水解产物螺旋藻肽不仅具有较低的分
子量和良好的物化特性,更容易被人体消化和吸收,
而且还具有抗氧化能力,可消除并防止机体受到自
由基的破坏等生理功能[6 - 8]。
目前,对螺旋藻肽生产工艺的优化多以提高水
解度为目标,但这种单纯的追求高水解度的生产方
式是不科学的,其原因是水解度与抗氧化能力之间
并不是单纯的线性关系[9]。 本研究以螺旋藻粉为
原料,采用单因素实验和响应面法来探究蛋白酶种
类、水解温度、pH 值、固液比、酶底比(E / S)及水解
时间等生产条件[10]对螺旋藻水解过程的影响,以提
高螺旋藻肽的抗氧化能力与收率。
1摇 材料与方法
1郾 1摇 材料与试剂
螺旋藻粉购于山东省滨州市天健生物科技有限
公司,蛋白质质量分数为 59郾 875% 。 胰蛋白酶(2 伊
105 U / g)、碱性蛋白酶(2 伊 105 U / mL)、木瓜蛋白酶
(2 伊 105 U / g)和风味蛋白酶(2 伊 105 U / g)分别由济
南亚康力诺生物工程有限公司、南宁东恒华道生物
科技有限责任公司与南宁庞博生物工程有限公司提
供。 1,1鄄二苯基鄄2鄄苦肼基自由基(DPPH)由 Sigma
公司生产,其他试剂均为国产分析纯试剂。
1
网络出版时间：2016-07-15 18:54:24
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4644.N.20160715.1854.042.html
1郾 2摇 仪器与设备
电子天平,上海恒平科技仪器有限公司;pHS -
3C 型数字酸度计,上海雷磁仪器厂;恒温振荡器,太
仓市实验设备厂;UV2800 型紫外可见分光光度计,
上海精密科学仪器有限公司。
1郾 3摇 分析方法
1郾 3郾 1摇 水解度的测定
可用水解后生成的 琢鄄氨基态氮的量占总含氮
量的百分比表示水解度(degree of hydrolysis, DH)
的大小[11]。 生成 琢鄄氨基态氮的量采用茚三酮法测
定[12],样品总含氮量则采用凯氏定氮法测定[13],水
解度按照式(1)计算。
水解度 = (水解后生成的 琢鄄氨基态氮的量 /
样品的总含氮量) 伊 100% 。 (1)
1郾 3郾 2摇 DPPH自由基清除能力的测定
采用 Yama gucet[14]等的方法并稍有改动:将 2
mL一定质量浓度 (0郾 5 ~ 2郾 5 g / L)的螺旋藻肽溶液
与 2 mL 0郾 2 mmol / L DPPH的 95%乙醇溶液充分混
匀后,室温放置 30 min,于 517 nm 处测定吸光值。
DPPH自由基清除能力的计算见式(2)。
DPPH自由基清除率 (= 1 - A1 - A2A )3 伊 100% , (2)
式(2)中:A1为 DPPH 溶液与螺旋藻肽溶液测得的
吸光值;A2为 95%乙醇与螺旋藻肽溶液测得的吸光
值;A3为 DPPH溶液与蒸馏水测得的吸光值。
1郾 3郾 3摇 螺旋藻肽收率的测定
参考刘红梅等[15]的方法并稍有改动:将抽滤酶
解液得到的滤饼于 80 益烘至恒重,称重。 螺旋藻肽
的收率按照式(3)计算。
螺旋藻肽收率
(
=
螺旋藻粉干重 -滤饼的干重 )螺旋藻粉的干重 伊 100% 。 (3)
1郾 3郾 4摇 蛋白酶种类的选择
称取 10 g 螺旋藻粉置于装有 100 mL 去离子水
的 250 mL三角瓶中,混匀后于 90 益保温 10 min,待
温度降到 55 ~ 60 益后,调节其 pH 值,并加入蛋白
酶进行水解。 碱性蛋白酶的水解条件为 pH值 7郾 0、
加酶量 2郾 15% (E / S,以底物质量计)、水解温度 55
益、水解时间 240 min;木瓜蛋白酶的水解条件为 pH
值 6郾 0、加酶量 0郾 6% (E / S,以底物质量计)、水解温
度 60 益、水解时间 210 min;胰蛋白酶的水解条件为
pH值 6郾 0、加酶量 4% (E / S,以底物质量计)、水解
温度 55 益、水解时间 180 min;风味蛋白酶的水解条
件为 pH 值 7郾 0、加酶量 4% (E / S,以底物质量计)、
水解温度为 55 益、水解时间 240 min。 待水解完成
后于沸水浴中灭酶 10 min,冷却至室温、抽滤,计算
酶解液的水解度、DPPH自由基清除率及收率。
1郾 3郾 5摇 单因素实验
参考孙宜君等[16]、武萌萌等[17]酶解螺旋藻粉
的实验并稍有改动,酶解的基本条件为:碱性蛋白酶
的添加量为 4 300 U / g 螺旋藻粉,固( g)液(mL)比
为 1颐 10,酶解温度 55 益,酶解时间 240 min。 选择温
度、pH 值、固液比及酶用量 4 个因素进行单因素实
验。
1郾 3郾 6摇 响应面试验
在单因素实验的基础上,以温度、pH值、固液比
3 个因子为研究对象,DPPH自由基清除能力和收率
为响应值,设计响应面试验,各因素与水平见表 1。
用 Design Expert 8郾 0 软件对实验数据进行多元回归
分析并构建 DPPH自由基清除能力和收率与 3 个因
子的二次多项式数学模型,见式(4)。
Y = 琢琢 + 移 琢ixi + 移 琢ijxix j + 移 琢iix2i 。 (4)
式(4)中,Y为响应值(收率与 DPP4·消除能力;xix j
为自变量偏码值;琢琢 为常系数;琢i 为线性系数;琢ij为
二次项系数;琢ij为交互项系数。
表 1摇 响应面试验因素和水平
Tab. 1摇 Experimental factors and levels of independent
variables in Box鄄Behnken Design
变量 因素
水平
- 1 0 1
X1 t / 益 45 55 65
X2 pH 5 7 9
X3 固液比 5 10 15
2摇 结果与分析
2郾 1摇 水解用酶的确定
蛋白酶种类对螺旋藻肽水解度、DPPH 自由基
清除能力与收率的影响如图 1。 碱性蛋白酶与木瓜
蛋白酶水解物的水解度、DPPH 自由基清除能力与
收率均高于胰蛋白酶和风味蛋白酶。 虽然碱性蛋白
酶与木瓜蛋白酶水解物的水解度、DPPH 自由基清
除能力与收率相差不大,但碱性蛋白酶的成本低于
木瓜蛋白酶。 因此,本研究采用碱性蛋白酶对螺旋
藻粉进行水解。
2 食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2016 年 7 月
图 1摇 蛋白酶种类对螺旋藻肽水解度、DPPH自由基
清除能力与收率的影响
Fig. 1 摇 Effect of different proteases on DH,DPPH radical
scavenging ability and yield of Spirulina peptides
2郾 2摇 温度的确定
酶解温度对螺旋藻肽水解度、DPPH 自由基清
除能力与收率的影响见图 2。 温度较低时,螺旋藻
肽的收率、水解度均随着温度的升高而增大,并在
55 益时达到最大,当温度继续升高时,水解度及收
率均明显下降,而 DPPH 自由基清除能力是随着温
度的升高逐渐增大的,这与水解度的变化规律不同。
水解度对螺旋藻肽的抗氧化能力有显著影响,但并
不是水解度越高,其抗氧化能力越强。 综合考虑温
度对螺旋藻肽水解度、DPPH 自由基清除能力与收
率影响,本研究选择 55 益为酶解反应的较适宜温
度。
图 2摇 温度对螺旋藻肽水解度、DPPH自由基清除能力与
收率的影响
Fig. 2摇 Effect of temperature on DH,DPPH radical scavenging
ability and ield of Spirulina peptides
2郾 3摇 pH值的确定
pH值对螺旋藻肽水解度、DPPH 自由基清除能
力与收率的影响见图 3。 pH值较低时,水解度、DP鄄
PH自由基清除能力与收率均随 pH 值的增大而增
大,并且在 pH值为 7郾 0 时达到最大,随后再增加 pH
值,三者均明显下降。 通常,碱性蛋白酶的最适作用
pH值为 8郾 0 ~ 9郾 0,这与本研究结果不同,原因是酶
促反应的最适 pH 值受其底物种类的影响,与碱性
环境相比,藻胆蛋白在 pH 值为 7郾 0 时的溶解性更
好,更有利于底物与酶接触,因此,pH值 7郾 0 为较佳
酶解温度。
图 3摇 pH值对螺旋藻肽水解度、DPPH自由基清除能力与
收率的影响
Fig. 3摇 Effect of different pH on DH,DPPH radical
scavenging ability and yield of Spirulina peptides
2郾 4摇 固液比的确定
固液比对螺旋藻肽水解度、DPPH 自由基清除
能力与收率的影响如图 4。 固液比从 1 颐 5减小到
1颐 10时,螺旋藻肽的 DPPH自由基清除能力、收率与
水解度均明显增大,随后再减小固液比,三者均明显
下降。 这主要是因为,在固液比较小时,底物质量分
数较小,酶与底物接触的机会少,反应速率慢,导致
了螺旋藻肽的水解度、抗氧化能力与收率较低。 但
当固液比太大时,蛋白之间发生交联聚合,溶解性变
差,黏度增大,酶与底物分子之间接触的机会减少,
水解速度降低,从而使得螺旋藻肽水解度、DPPH 自
由基清除能力与收率降低。
2郾 5摇 酶用量的确定
酶用量对螺旋藻肽水解度、DPPH 自由基清除
能力与收率的影响见图 5。 当蛋白酶量从 1 300 U / g
增加到 4 300 U / g 时,水解度、DPPH 自由基清除能
力与收率增加较快,此后,再增加酶用量,三者上升
缓慢。 其原因是当加酶量较少时,增大加酶量可以
增加酶与底物接触的机会,从而加快水解速度,螺旋
藻肽的水解度、DPPH 自由基清除能力与收率迅速
增大;但当加酶量较高时,酶用量不再是酶解反应的
限制因素,并且,在实际生产过程中,加酶量过大会
3第 34 卷 第 4 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 马艳芳等: 碱性蛋白酶水解螺旋藻制备抗氧化活性肽的工艺优化
图 4摇 固液比对螺旋藻肽水解度、DPPH自由基清除
能力与收率的影响
Fig. 4摇 Effect of solid liquid ratio on DH,DPPH radical
scavenging ability and yield of Spirulina peptides
增大生产成本。 因此,本研究选择 4 300 U / g为最适
加酶量。
图 5摇 酶用量对螺旋藻肽水解度、DPPH自由基清除
能力与收率的影响
Fig. 5 摇 Effect of dosage of proteases on DH,DPPH radical
scavenging ability and yield of Spirulina peptides
2郾 6摇 响应面试验结果
响应面试验结果见表 2。 采用 Desigin Expert
8郾 0 软件对所得实验数据进行回归分析,可得到式
(5)、式(6)两个回归方程。
Y1 =76郾 81 +1郾 01X1 -5郾 05X2 +3郾 05X3 -3郾 22X1X2 +
0郾 34X1X3 +0郾 71X2X3 -5郾 95X21 -8郾 54X22 -11郾 38X23;
(5)
Y2 =58郾 31 -0郾 49X1 -0郾 88X2 +2郾 79X3 -3郾 08X1X2 -
0郾 46X1X3 +3郾 98X2X3 -6郾 07X21 -7郾 36X22 -4郾 81X23。
(6)
式(5)、(6)中,X1、X2、X3分别为自变量的编码;Y1为
DPPH自由基清除能力,% ;Y2为收率,% 。
对两个回归方程进行方差分析,结果见表 3。
表 2摇 响应面试验设计与结果
Tab. 2摇 Designs and results of Box鄄Behnken
experiments
编号 X1 X2 X3
DPPH自由基
清除能力 / %
收率 /
%
1 0 0 0 74郾 92 58郾 6
2 1 1 0 56郾 96 39郾 51
3 - 1 - 1 0 61郾 257 44郾 11
4 0 0 0 75郾 14 60郾 17
5 0 1 - 1 47郾 94 38郾 427
6 1 0 - 1 55郾 36 45郾 6
7 0 0 0 83郾 3 55郾 1
8 - 1 0 - 1 52郾 35 42郾 2
9 0 - 1 - 1 64郾 918 49郾 764
10 1 - 1 0 68郾 03 45郾 82
11 - 1 1 0 63郾 06 50郾 1
12 1 0 1 67郾 3 51郾 75
13 0 0 0 74郾 15 56郾 48
14 0 - 1 1 64郾 441 45郾 89
15 0 1 1 50郾 29 50郾 48
16 0 0 0 76郾 55 61郾 2
17 - 1 0 1 62郾 92 50郾 17
由表 3 可知,DPPH 自由基清除能力回归模型显著
(P < 0郾 05),收率回归模型高度显著 (P < 0郾 01),而
失拟项均不显著 (P > 0郾 05)。 从回归模型系数的
显著性检验结果来看,模型的二次项 X22、X23 对 DP鄄
PH自由基清除能力的影响表现为极显著 ( P <
0郾 01),一次项 X2、二次项 X21 对 DPPH 自由基清除
能力影响显著(P < 0郾 05),二次项 X21、X22 对收率的
影响表现为极显著(P < 0郾 01),一次项 X3、交互项
X2X3、二次项 X23 对收率的影响显著(P < 0郾 05),其
余各项对 DPPH自由基清除能力及收率的影响不显
著(P > 0郾 05)。 使用 Design Expert 8郾 0 软件绘制响
应面图,如图 6。 将两个回归模型同时进行优化求解,
可得到模型预测的 3 个因素的编码值分别为 X1 =
1郾 006,X2 =0郾 959,X3 =1郾 083,解码后得出其真实值,分
别为温度 55郾 46 益、pH值 6郾 71、固液比1颐 10郾 83,在此条
件下,模型预测的 DPPH自由基清除能力与收率的最
大值分别为 77郾 597%和 58郾 500%。 在优化条件下对模
型进行 3次验证实验,DPPH自由基清除能力和收率的
实测值分别为 76郾 15 依0郾 35和60郾 17 依0郾 47,两个值均与
预测值相差不大,这说明实际情况与预测结果想符合,
模型是有效的。
4 食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2016 年 7 月
表 3摇 二次回归方程的方差分析结果
Tab. 3摇 Regression analysis results of quadratic regression models
方差源
DPPH自由基清除能力 收率
平方和 自由度 F值 Probd > F 平方和 自有度 F值 Probd > F
Model 1 438郾 71 9 6郾 42 0郾 011 4* 707郾 05 9 9郾 30 0郾 003 8**
X1 8郾 13 1 0郾 33 0郾 585 6 1郾 90 1 0郾 23 0郾 649 7
X2 203郾 98 1 8郾 19 0郾 024 2* 6郾 24 1 0郾 74 0郾 418 5
X3 74郾 32 1 2郾 99 0郾 127 6 62郾 16 1 7郾 36 0郾 030 1*
X21 149郾 06 1 5郾 99 0郾 044 3* 155郾 02 1 18郾 35 0郾 003 6**
X22 306郾 74 1 12郾 32 0郾 009 9** 227郾 92 1 26郾 98 0郾 001 3**
X23 545郾 23 1 21郾 90 0郾 002 3** 97郾 51 1 11郾 54 0郾 011 5*
X1X2 41郾 43 1 1郾 66 0郾 238 0 37郾 82 1 4郾 48 0郾 072 2
X2X3 2郾 00 1 0郾 080 0郾 785 1 63郾 42 1 7郾 51 0郾 028 9*
X1X3 0郾 47 1 0郾 019 0郾 894 7 0郾 83 1 0郾 098 0郾 763 3
残差 174郾 24 7 59郾 14 7
失拟项 118郾 62 3 2郾 84 0郾 169 3 33郾 59 3 1郾 75 0郾 294 6
纯误差 55郾 62 4 25郾 55 4
总和 1 612郾 95 16 766郾 19 16
摇 摇 *显著(P < 0郾 05),**极显著(P < 0郾 01)
图 6摇 温度和 pH值对螺旋藻肽 DPPH自由基清除能力与收率影响的响应面图
Fig. 6摇 Response surface analysis of influence of temperature and pH on DPPH radical scavenging ability and yield
3摇 结摇 论
水解温度、pH值、固液比、蛋白酶种类、酶底比
(E / S)以及水解时间等因素均对螺旋藻肽的抗氧化
能力与收率有影响,其抗氧化能力与收率的提高可
通过优化酶解过程的某些条件实现。 以螺旋藻粉为
原料,采用单因素实验法与响应面法对碱性蛋白酶
水解螺旋藻生产螺旋藻肽的工艺条件进行优化,结
果表明,与木瓜蛋白酶、胰蛋白酶与风味蛋白酶相
比,碱性蛋白酶对螺旋藻肽有较强的水解能力,其优
化水解条件为 55郾 46 益、 pH 值 6郾 71、固液比为
1颐 10郾 83,在此条件下酶解 240 min,螺旋藻肽的得率
为 58郾 500% ;螺旋藻肽的质量分数为 0郾 860 g / L时,
其 DPPH自由基清除能力为 77郾 597% ,与优化前相
比,DPPH 自由基清除能力与收率分别提高了
7郾 62%和 15郾 61% 。 水解度对螺旋藻肽的抗氧化能
力有影响,但是水解度与抗氧化能力之间并不是单
纯的线性关系,因此,在实际生产过程中,应合理地
控制水解度,以提高产品的抗氧化能力与收率。
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MA Yanfang1,摇 LI Yuyang1,摇 LIU Jinlong1,摇 ZHENG Minggang2,摇 SUN Zhongtao1,*
(1. College of Life Science, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China;
2. Key Lab of Marine Bioactive Substance and Modern Analytical Technique, Qingdao 266000, China)
Abstract: The hydrolysis conditions of antioxidant peptides from Spirulina powder using Alcalase were
optimized by single factor methods and the Box鄄Behnken experiments, in order to improve the antioxidant
abilities and the yield of Spirulina peptides. The results showed that Alcalase has the highest hydrolysis a鄄
bility compared with other commercial proteases, incluing papain, trypsase and flavourzyme, and it蒺s op鄄
timum hydrolysis conditions were 55郾 46 益, pH 6郾 71 and the solid liquid ratio was 1颐 10郾 83. When the
Spirulina powder were hydrolyzed for 240 min under the optimized conditions, the yield of the Spirulina
peptides was 58郾 500% , increasing by 15郾 61% compared with the control. The DPPH radical scavenging
ability of Spirulina peptides reached 77郾 597% , at the mass fraction of Spirulina peptides was 0郾 860 g / L,
increased by 7郾 62% compared with the control.
Key words: Spirulina; alcalase; antioxidant peptides; DPPH radical scavenging ability
(责任编辑:叶红波)
6 食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2016 年 7 月