全 文 ：收稿日期:2008-01-28;修回日期:2008-02-25
作者简介:胡晓倩(1972-),女 , 副教授 ,硕士 ,研究方向为生物化学和微生物生理 , E-mail:ysxyxq72@tahoo.com.cn;
通讯作者:唐欣昀 ,教授 ,硕导 , E-mail:tangxinyun@21cn.com。
基金项目:安徽省教育厅基金项目(2006KJ173B, 2007jq1052)
doi:10.3969/j.issn.1008-9632.2009.01.019
3种钝顶螺旋藻株胞内核酸酶活性效果研究
胡晓倩 1, 2 ,唐欣昀 1 ,甘旭华1 ,曹媛媛1 ,叶　霁 1
(1.安徽农业大学生命科学学院 ,合肥　230036;2.黄山学院生命与环境科学学院 ,黄山　245041)
摘　要:取钝顶螺旋藻 A9、抗刀豆氨酸(CS)突变株 A9c、藻体长直型 A9L的无菌纯藻藻株胞内核酸酶粗提取液 ,分
别对 λ-DNA或 p8760进行酶切消化后研究酶活。对于 A9藻株 , p8760更适于作为酶切底物进行酶活研究;酶切最
适反应温度为 37 ～ 45℃, 酶切最适反应时间为 3h, 50℃开始酶活被抑制;A9c藻株酶切最适反应温度为 37℃, 酶切
最适反应时间为 3 ～ 4h, 45℃开始酶活被抑制;A9L藻株 , λ-DNA更适于作为酶切底物进行酶活研究 , 酶切最适反应
温度为 37 ～ 55℃,酶切最适反应时间为 2 ～ 3h, 60℃开始酶活被抑制。对此 3种无菌藻株胞内核酸酶活性效果的初
步研究表明 , 藻株形态的变异或抗氨基酸类似物突变 , 都会影响和改变其胞内核酸酶的活性 ,这些可为控制胞内核
酸酶对螺旋藻转基因操作的影响和选择合适的藻株用于螺旋藻的遗传转化奠定一定的基础。
关键词:钝顶螺旋藻;胞内核酸酶;酶活;效果
中图分类号:Q933 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2009)01-0019-04
　　螺旋藻基因工程研究 ,目的之一是为了通过重组
DNA技术构建螺旋藻新品种 ,实现螺旋藻天然产物基
因工程生产。围绕基因工程开展基因克隆 、定位 、功能
分析和表达调控研究是螺旋藻遗传基因工程的研究热
点 [ 1] 。目前已有一些学者陆续开展对其遗传规律的研
究 [ 2、3、4] ,但进展十分缓慢 ,一方面是因为很多实验室使
用的藻株可能不是无菌藻株 ,制约着研究的进展 [ 5] ;另
一方面是螺旋藻具有较强的胞外和胞内核酸酶 ,相对
于胞外核酸酶 ,胞内核酸酶活性很强。活性强的胞内
核酸酶能迅速降解外源 DNA[ 6] ,使得螺旋藻基因工程
研究和应用受到很大的阻碍。因此 ,在获得无菌钝顶
螺旋藻纯藻的基础上来研究螺旋藻胞内核酸酶的活
性 ,可为螺旋藻的遗传重组研究提供参考数据 ,对通过
重组 DNA技术构建螺旋藻新品种和实现螺旋藻天然
产物基因工程生产等具有重要意义。
1　材料与方法
1.1　材料
钝顶螺旋藻 (Spirulinaplatensis)品系 A9藻株 、突
变型抗刀豆氨酸(L-canavaninesulphate, CS)A9c藻株 、
A9L(藻体长直型)藻株的无菌纯藻 [ 5 , 7] ,接种培养至对
数生长中期时用于实验。培养条件:(28 ±2)℃,
3000lux。Zarouk培养基溶液所需试剂 [ 8]及电泳缓冲
液所需试剂 [ 9] 均为国产分析纯;λ-DNA、λ-DNA的
Marker、琼脂糖均为大连宝生物工程有限公司产品;质
粒 8760(p8760)由吴龙飞博士惠赠。
1.2　实验藻株胞内核酸酶粗提液的提取
参考王高歌 [ 6]等和柯珍恋 [ 10]等人的方法:取各藻
株对数生长期的藻液 1.5mL, 6000r/min离心 5min,再
重复一次后收集藻丝;用不含 EDTA的 Zarouk培养基
洗涤藻丝 2次 (以排除胞外酶活性的影响 ),再用含
1.5mol/LNaCl的 Zarouk培养基清洗一次 ,最后用无
菌蒸馏水清洗一次;将藻丝体置于超低温冷藏柜中反
复冻融 ,镜检确定细胞破裂率达 98%以上 , 6000r/min
离心 30s,取上清液的无细胞溶液作为螺旋藻胞内核酸
酶的粗提液 ,冷藏备用。
1.3　琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖浓度 0.9%,电泳缓冲液 TAE,处理点样量
为 8μL,作为对照的 λ-DNA点样量为 1μL,作为对照的
p8760点样量为 2μL, λ-DNA的 Marker点样量为 5μL。
每次点样前将 λ-DNA的 Marker在 60℃水浴中处理
5min,确保标记电泳条带清晰。电泳条件:电压 80V,
电泳 70 ～ 80min[ 9] 。
1.4　A9藻株 、A9c藻株 、A9L藻株胞内核酸酶活性
研究
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提取 3种藻株的胞内核酸酶粗提液 ,制备 3种藻
株酶切 p8760或 λ-DNA的体系 ,分别在 37℃、45℃、
50℃、55℃、60℃、65℃水浴中酶切消化 3h, 0.9%琼脂
糖凝胶电泳拍照记录结果;提取 3种藻株的胞内核酸
酶粗提液 ,制备 3种藻株酶切 p8760或 λ-DNA的体系 ,
在 37℃水浴中酶切消化 2 ～ 8h,在 2、3、4、6、8h时分别
取样 , 0.9%琼脂糖凝胶电泳拍照记录结果。
2　结果与分析
2.1　A9藻株胞内核酸酶酶切最适反应温度
图 1A9藻株胞内核酸酶酶切最适反应温度
Fig1 TheoptimaldigestiontemperatureforenzymeactivitiesofA9strain
(1:Marker;2:p8760;3:37℃酶切 p8760 3h;4:45℃酶切 p8760
3h;5:50℃酶切 p8760 3h;6:55℃酶切 p8760 3h;7:60℃酶切
p8760 3h)
电泳结果显示:在 37、45、50℃时其胞内核酸酶都
有酶切活性 ,且 45℃这一温度能促进 A9藻株胞内核
酸酶的活性 ,能将 p8760全部降解;从 55℃开始 A9藻
株胞内核酸酶的活性被抑制 ,活性逐渐减弱 ,在 60℃
时几乎不能降解 p8760,在此温度下 A9藻株胞内核酸
酶的活性失活 ,说明 A9藻株胞内核酸酶中没有耐高温
的酶类。 37 ～ 50℃是 A9藻株胞内核酸酶酶切反应的
最适温度。
2.2　A9c藻株胞内核酸酶酶切最适反应温度
图 2　A9c藻株胞内核酸酶酶切最适反应温度
Fig2TheoptimaldigestiontemperatureforenzymeactivitiesofA9cstrain
(1:Marker;2:p8760;3:37℃酶切 p8760 3h;4:45℃酶切
p8760 3h;5:50℃酶切 p8760 3h;6:55℃酶切 p8760 3h;7:60℃酶
切 p8760 3h;8:65℃酶切 p8760 3h)
电泳结果显示:在 37℃时其胞内核酸酶降解
p8760;从 45℃到 65℃, A9c藻株基本没有胞内核酸酶
的活性 ,对 p8760没有降解作用 , 45℃开始其胞内核酸
酶的活性就被抑制。 37℃是 A9c藻株胞内核酸酶酶切
反应的最适温度。
2.3　A9L藻株胞内核酸酶酶切最适反应温度
图 3　A9L藻株胞内核酸酶酶切最适反应温度
Fig3 TheoptimaldigestiontemperatureforenzymeactivitiesofA9Lstrain
(1:λ-DNA;2:Marker;3:37℃酶切 λ-DNA3h;4:45℃酶切λ-
DNA3h;5:50℃酶切 λ-DNA3h;6:55℃酶切λ-DNA3h;7:60℃酶
切 λ-DNA3h;8:65℃酶切 λ-DNA 3h)
电泳结果显示:A9L藻株胞内核酸酶活性比较强 ,
在 37℃时就能将 λ-DNA降解;45 ～ 55℃之间随酶切反
应温度的升高 ,其胞内核酸酶的活性增强 ,将 λ-DNA
降解得更彻底;60℃开始酶活受到抑制 , 37 ～ 55℃是
A9L藻株胞内核酸酶酶切反应的最适温度。
2.4　A9藻株胞内核酸酶酶切最适反应时间
图 4　 A9藻株胞内核酸酶酶切最适反应时间
Fig4 TheoptimaldigestiontimeforenzymeactivitiesofA9strain
(1:λ-DNA;2:酶粗提液消化 λ-DNA 1h;3:酶粗提液消化 λ-
DNA2h;4:酶粗提液消化 λ-DNA 4h;5:酶粗提液消化 λ-DNA 6h;
6:酶粗提液消化 λ-DNA 8h;7:酶粗提液消化 λ-DNA 24h; 8:
p8760;9:酶粗提液消化 p8760 1h;10:酶粗提液消化 p8760 2h;
11:酶粗提液消化 p8760 4h;12:酶粗提液消化 p8760 6h;13:酶粗
提液消化 p8760 8h;14:酶粗提液消化 p8760 24h)
从图 4可以看出:A9藻株胞内核酸酶活性很强 ,
对底物 λ-DNA和 p8760都有明显的酶切作用 ,把 λ-
DNA的酶切成许多小片段 ,说明其对 λ-DNA的酶切位
点较多;对 p8760的酶切条带很清晰 ,说明其对 p8760
的酶切位点比较少且专一;从酶切 p8760的条带可确
定 A9藻株胞内核酸酶酶切最适反应时间为 2 ～ 3h,超
过 4h以上从 6h开始酶切完全 ,把 p8760完全降解 ,不
利于进行胞内核酸酶活性的研究。
2.5　A9c藻株胞内核酸酶酶切最适反应时间
从图 5可以看出:A9c藻株胞内核酸酶活性比较
弱 ,对 p8760的酶切作用较弱 ,从酶切条带可确定 A9c
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藻株胞内核酸酶酶切最适反应时间为 3 ～ 4h,超过 6h
酶切逐渐完全 ,不利于进行胞内核酸酶活性的研究。
图 5　A9c藻株胞内核酸酶酶切最适反应时间
Fig5TheoptimaldigestiontimeforenzymeactivitiesofA9cstrain
(1:Marker;2:p8760;3:酶粗提液消化 p8760 2h;4:酶粗提液
消化 p8760 3h;5:酶粗提液消化 p8760 4h;6:酶粗提液消化 p8760
6h;7:酶粗提液消化 p8760 8h)
2.6　A9L藻株胞内核酸酶酶切最适反应时间
图 6　A9L藻株胞内核酸酶酶切最适反应时间
Fig6TheoptimaldigestiontimeforenzymeactivitiesofA9Lstrain
(1:Marker;2:p8760;3:酶粗提液消化 p8760 2h;4:酶粗提液
消化 p8760 3h;5:酶粗提液消化 p8760 4h;6:酶粗提液消化 p8760
6h;7:酶粗提液消化 p8760 8h)
从图 6可以看出:A9L藻株胞内核酸酶活性比较
强 ,对 p8760的酶切作用较强 ,从酶切条带可确定 A9L
藻株胞内核酸酶酶切反应研究最适时间为 2 ～ 3h,因
为从 4h以后酶切逐渐完全 ,不利于进行胞内核酸酶活
性的研究。
2.7　A9、A9c、A9L、盐泽藻株胞内核酸酶活性比较
图 7　A9、A9c、A9L、盐泽藻株(未纯化 ,作为对比)
胞内核酸酶活性比较(37℃ 4h)
Fig7Thecomparisonofintracelularnucleaseactivityamong
A9, A9c, A9LandS.subsalsavarstrain.
(1:A9酶切 p8760 4h;2:A9c酶切 p8760 4h;3:A9L酶切
p8760 4h;4:盐泽藻株酶切 p8760 4h;5:p8760;6:Marker;7:λ-
DNA;8:A9酶切 λ-DNA 4h;9:A9c酶切 λ-DNA 4h;10:A9L酶切
λ-DNA4h;11:盐泽藻株酶切 λ-DNA4h)
电泳结果显示:A9、A9c、A9L3种藻株对 p8760的
酶切作用都很强 ,几乎都呈小碎段;A9c藻株对 λ-DNA
和 p8760的酶切效果相当;A9L藻株对 λ-DNA的酶切
作用略弱 ,有明显的酶切条带;作为对比的盐泽藻株由
于没有纯化 ,培养液中藻株品系多使得胞内核酸酶种
类杂多 ,因此其胞内核酸酶的活性非常强 ,几乎能把两
种酶切底物都全部降解。
3　讨论
3.1　3种藻株胞内核酸酶活性的比较
钝顶螺旋藻 A9藻株酶切最适反应温度为 37 ～
50℃, 55℃开始酶活被抑制 ,酶切最适反应时间为 2 ～
3h;A9c藻株酶切最适反应温度为 37℃, 45℃开始酶活
被抑制 ,酶切最适反应时间为 3 ～ 4h;A9L藻株酶切最
适反应温度为 37 ～ 55℃, 60℃开始酶活被抑制 ,酶切最
适反应时间为 2 ～ 3h;这说明螺旋藻藻丝体形态的变
异(A9L藻株)和抗氨基酸类似物的突变 (A9c藻株)
会导致某个结构基因的突变 ,从而影响某些胞内核酸
酶的翻译与表达 ,引起不同藻株胞内核酸酶活性的显
著差异。
3.2　藻株突变对胞内核酸酶活性的影响
TragutV[ 11]等人研究发现在钝顶螺旋藻中至少有
4种限制性内切酶 ,它们在 λ-DNA上有多个酶切位点;
从图 4可以看出:A9藻株胞内核酸酶活性很强 ,对底
物 λ-DNA和 p8760都有明显的酶切作用 ,把 λ-DNA的
酶切成许多小片段 ,说明其对 λ-DNA的酶切位点较
多;对 p8760的酶切条带很清晰 ,说明其对 p8760的酶
切位点比较少且专一 ,所以 p8760适合于做 A9藻株胞
内核酸酶的酶切底物;从图 7可以看出:A9c藻株对 λ-
DNA和 p8760的酶切效果相当;而 A9L藻株 ,对 λ-
DNA的酶切位点少 ,酶切专一 ,所以 λ-DNA更适合于
做 A9L藻株胞内核酸酶的酶切底物。这可能是因为
抗氨基酸类似物突变 (A9c藻株)和藻丝体形态变异
(A9L藻株)改变了胞内核酸酶的某些基因序列 ,影响
了某些胞内核酸酶的活性 ,酶切位点数目多少也发生
了变化。所以应选取合适的酶切底物来研究不同藻株
胞内核酸酶的活性。
目前虽然用于螺旋藻基因工程研究的工具酶 、载
体及外源基因的导入已有新的进展 ,但与动植物基因
工程相比 ,差距仍然很大 [ 12] 。许多学者普遍认为 ,螺
旋藻细胞内存在着丰富的高活性核酸酶 ,这是螺旋藻
基因转化的一个巨大障碍 [ 13] 。只有有效克服了螺旋
藻胞内核酸酶对外源基因的降解 ,才能实现外源基因
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在螺旋藻体内的稳定转化和高效表达 ,才能顺利开展
螺旋藻的基因工程。本文实验采用无菌纯藻进行了钝
顶螺旋藻 3种藻株的胞内核酸酶的活性研究 ,了解了
这 3种藻株的酶活反应特点 ,可以为抑制螺旋藻胞内
核酸酶活性的研究提供实验数据;本实验参考测定螺
旋藻酶活的方法 [ 6 , 10] ,提取了钝顶螺旋藻的 A9藻株 、
A9c藻株 、A9L藻株的胞内核酸酶 ,进行酶活的初步研
究 ,实验结果表明 ,藻株形态的变异或抗氨基酸类似物
突变 ,都会影响和改变其胞内核酸酶的活性 ,这些可为
控制胞内核酸酶对螺旋藻转基因操作的影响和选择合
适的藻株用于螺旋藻的遗传转化奠定一定的基础。进
一步的研究需要分离纯化螺旋藻的胞内核酸酶 ,确定
胞内核酸酶酶活和种类 ,克隆胞内核酸酶的基因 ,筛选
该基因的缺陷突变株 ,为螺旋藻的遗传转化提供适合
的藻株 ,推进螺旋藻基因工程研究的进展。
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Studyonintracelularnucleaseactivity
ofthreeSpirulinaplatensisstrains
HUXiao-qian1, 2 , TANGXin-yun1 , GANXu-hua1 , CAOYuan-yuan1 , YEJi1
(1.SchoolofLifeSciences, AnhuiAgriculturalUniversity, Hefei230036, China;
2.SchoolofLifeandEnvironmentScience, HuangshanUniversity, Huangshan245041, China)
Abstract:ThecrudeextractsofintracelularnucleasefromthreeSpirulinaplatensisstrainsA9, A9c(mutantanti-L-canava-
ninesulphate), andA9L(elongatedstrain)wereprepared.Thecrudeproductswereusedtodigestλ-DNAandplasmid8760 re-
spectivelyforenzymedeterminination.Theresultsshowedthatplasmid8760 wasmoresuitableenzymolysissubstrateforA9
strain.TheoptimumcondifionforenzymolysisofA9strainwas37 ～ 45℃forthreehoursandtheenzymeactivitieswouldbeinhib-
itedwhenthetemperaturewasover50℃.TheoptimumcondifionforenzymesofA9cstrainwas37℃for3 ～ 4hours, andtheen-
zymeactivitieswouldbeinhibitedwhenthetemperaturewasover45℃.Theλ-DNAwasmoresuitableenzymolysissubstratefor
A9Lstrain.TheoptimumconditionforenzymolysisofA9Lstrainwas37 ～ 55℃for2 ～3 hours, andtheenzymeactivitieswould
beinhibitedwhenthetemperaturewasover60℃.Initialresearchindicatedthatmorphologicalvariationormutantanti-aminoacid
analogwouldinfectorchangeintracelularnucleaseactivities.Althesewouldestablishfoundationforcontrolingintracelularnu-
cleaseinfluenceofSpirulinaplatensistransgeneoperationandselectingappropriatestrainforSpirulinaplatensisgenetictransforma-
tion.
Keywords:Spirulinaplatensis;intracelularnuclease;enzymeactivity;efect
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