全 文 ：海洋科学/2008年/第 32卷/第 1 期
螺旋藻多糖对肿瘤细胞生长及 Hela细胞早期凋亡作用的实验
研究
于　红1 , 吕　锐1 , 张学成2
(1.青岛大学 医学院 , 山东 青岛 266012;2.中国海洋大学 生命学院 ,山东 青岛 266003)
摘要:采用 M TT 法(四甲基偶氮唑盐比色法)研究了钝顶螺旋藻多糖(PS P)对 Hela细胞及 HepG2 细胞生长
的抑制作用。结果表明 ,随 PSP 浓度及培养时间的增加 , 肿瘤细胞存活率逐渐降低 , 抑制率逐渐增加 , 以
PSP40 mg/ L 作用 72 h 最为显著。应用 Annexin V/P I双染色流式细胞仪检测了早期 Hela细胞凋亡 , 未经
PSP处理的正常 Hela细胞凋亡细胞极少 , 经 PSP 处理的细胞 , 凋亡细胞的百分比明显高于正常对照组 , 其
作用随着剂量的增加和时间的延长而增强 ,具有量效关系和时效关系。结果说明 PSP的抗肿瘤机制 ,除了诱
导肿瘤细胞凋亡 ,还存在细胞毒性等其他机制 , 是多种机制共同作用的结果。
关键词:钝顶螺旋藻多糖;抗肿瘤作用;细胞凋亡;Annexin V/ PI
中图分类号:R979　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1000-3096(2008)01-0038-03
　　钝顶螺旋藻多糖(polysaccharides f rom S pirul-
ina p latensis , PSP)是从螺旋藻中提取的一种水溶
性多糖类化合物 ,近几年研究表明:螺旋藻多糖是螺
旋藻中具有抗肿瘤 、抗辐射 、抗病毒和免疫调节作用
的重要生物活性物质[ 1 , 2] 。由于它对细胞无毒 ,明显
不同于常用细胞毒类抗癌药 ,在发展新型药物中具
有十分重要的意义 , 也是合成药所不具有的优
点[ 3 , 4] 。因此 ,有必要系统地研究其抗肿瘤作用及机
制。作者研究了钝顶螺旋藻多糖体外抗肿瘤作用及
其诱导的 Hela细胞早期凋亡 ,为深入研究 PSP 抗肿
瘤作用的机制奠定实验基础。
1　材料与方法
1.1　钝顶螺旋藻多糖
钝顶螺旋藻多糖由中国海洋大学生命学院提
供 ,纯度达 92%以上。以双蒸水配成 10 g/L 母液 ,
过滤除菌 ,分装保存于 4℃。
1.2　细胞株
肿瘤细胞 Hela 细胞株购自山东省医学科学院
药物研究所 ,人肝癌细胞 HepG2 细胞与人二倍体成
纤维细胞均购自中国科学院上海细胞生物研究所 ,
于 RPM I-1640基础培养液中加入 10%的新生牛血
清 、100 U/mL 青霉素 、100 mg/L 链霉素 ,置 37℃、
5%CO 2孵箱中培养 , 3 ～ 4 d传代 1次。
1.3　主要试剂与仪器
细胞培养所用的 RPM I-1640干粉培养基为美
国 GIBCO公司产品 ,新生牛血清为杭州四季青公司
产品;四甲基偶氮唑盐(MT T)为 Sigma 公司产品 ,
配制质量浓度为 5 g/L;Annexin V-FITC 细胞凋亡
检测试剂盒为 Counte r 公司产品;酶联免疫检测仪
为 BIO-RAD公司产品;流式细胞仪(EPICS XL)为
Beckman公司产品 。
1.4　PSP 对肿瘤细胞的抑制试验[ 5]
分别取对数生长期的 Hela 细胞和 HepG2细胞
(5×104/mL),加入 96 孔培养板中 , 24 ～ 48 h 后加
入不同稀释度的 PSP(2.5 ,5 , 10 ,20 ,40 mg/L),并以
正常人二倍体成纤维细胞作对照 ,每个浓度设 6 个
复孔 ,置 37℃、5%CO2孵箱中连续培养48 ～ 72 h , 培
养结束前 4 h ,每孔加入 MT T 20 μL ,37℃培养箱中
培养 4 h ,离心弃上清后每孔加二甲基亚砜 200 μL ,
微量振荡器振荡 5 min ,自动酶标读数仪比色(波长
570 nm),以 MT T 比色法测吸光度并计算药物对肿
瘤细胞的抑制率 。细胞存活率(%)=药物组吸光度
值∕细胞对照组吸光度值×100%,抑制率(%)=
100%-存活率。
收稿日期:2005-12-20;修回日期:2006-02-10
作者简介:于红(1965-),山东青岛人 ,博士 ,教授 ,研究方向:分子生物
学与分子病毒学 , 电话:0532-83780025 , E-mai l:yuhong0532@126.
com
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1.5　Annexin V-FITC 标记检测早期细胞凋
亡[ 6 ,7]
　　培养细胞经胰酶消化 、离心 , PBS 洗涤 ,制成单
细胞悬液 ,细胞数约 1×106个∕ mL ,每 100μL细胞
悬液加入 2.5μL 碘化丙啶(PI)和 5 μL Annex in V-
FITC ,轻轻混匀 , 避光染色 10 min , 加入 150 μL
Binding buffer ,将样品加入流式细胞仪的样品室 ,进
行分析检测 。实验分为不加 PSP 的正常 Hela 细胞
对照组和不同质量浓度 PSP(5 , 10 , 20 ,40 mg/L)作
用的实验组。
1.6　统计学处理
所有数据用 SPSS 11.0统计软件处理 ,多组数
据比较采用方差分析 ,两组间比较采用 q检验 。
2　结果
2.1　PSP 对 Hela 细胞和 HepG2 细胞生长
的抑制作用
　　以质量浓度分别为 2.5 , 5 , 10 , 20 , 40 mg/L 的
PSP 作用 48 h 及72 h。随药物浓度及培养时间的增
加 ,细胞存活率逐渐降低 ,抑制率逐渐增加 ,以 PSP
40 mg/ L 作用 72 h最为显著 。而上述各浓度组 PSP
对人二倍体成纤维细胞无明显作用 ,结果见图 1。
图 1　PSP 对 Hela 细胞和 HepG2 细胞生长的抑制作用(72 h)
Fig.1 　 Effects of PSP on the gr ow th of H ela cells and
HepG2 cells(72 h)
2.2　PSP诱导 Hela细胞早期凋亡的量效关系
如图2所示 ,细胞经 Annexin V /PI 双染色流式
细胞仪检测 ,在双变量 FCM 的散点图上 ,左下象限
(D3)显示正常活细胞 , 为 FITC-/PI-;右下象限
(D4)为晚期凋亡或坏死细胞 ,为FITC-/PI+;右上象限
(D2)为细胞膜破损细胞 ,渗入 PI ,为 FITC+/PI+;而左
上象限(D1)为凋亡细胞 , 为 FITC+/PI- 。未经过
PSP 处理的正常 Hela 细胞多位于左下 象限
(90.7%),凋亡细胞极少(1.39%), 经过 PSP 处理
12 h 的细胞多位于左上象限 ,凋亡细胞的百分比分
别为 30.3%、32.6%、34.8%和38.8%,明显高于正常细
胞对照组(表 1),差异有显著性(P<0.05)。
图 2　Annexin V/P I检测细胞凋亡的 FCM 散点图
Fig.2　Apopto sis o f Hela cells detected by Annex in V/ PI
A:正常 H ela细胞对照;B:5 mg/ LPSP 处理细胞;C:10 mg/ L PSP 处理细胞;D:20 m g/ L PSP 处理细胞;E:40 mg/ L PSP 处理细胞
A:Normal H ela cel ls;B:H ela cel ls t reated by 5 mg/ L PSP;C:Hela cell s treated by 10 mg/ L PSP;D:Hela cell s treated by 20 mg/ L PSP;
E:Hela cell s t reated by 40 mg/ L PSP
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海洋科学/2008年/第 32卷/第 1 期
表 1　Annexin V/PI检测细胞凋亡的结果
Tab.1　Apoptosis of Hela cells detected by Annexin V/ PI
组别
　　　　　各象限细胞百分比(%)　　　　　
　　　　　　D1　　　　D2　　　　D3　　　　D4
正常 Hela细胞 　1.39　　　3.52　　　　　90.7　　　　4.40
5 mg/ L PSP 　30.3　　　10.3　　　　　57.1　　　　2.29
10 mg/ LPSP 　32.6　　　12.3　　　　　52.0　　　　3.18
20 mg/ LPSP 　34.8　　　9.62　　　　　53.5　　　　2.8
40 mg/ LPSP 　38.8　　　7.01　　　　　50.5　　　　3.68
2.3　PSP诱导 Hela细胞早期凋亡的时效关系
40 mg/L PSP 分别处理 Hela 细胞 6 , 12 h ,经
Annexin V/PI 双染色检测细胞凋亡 ,结果表明 , 40
mg/L PSP 处理 Hela 细胞 6 h后即发生早期细胞凋
亡 ,凋亡率为 12.6%,而 12 h凋亡率为 38.8%,表明
随作用时间延长 ,凋亡率明显增加 。
3　讨论
近年来研究表明细胞凋亡与肿瘤发生 、发展与
消退有密切关系 ,大多数抗肿瘤药物能诱导肿瘤细
胞凋亡 ,而且其抗肿瘤作用的强弱与它们诱导肿瘤
细胞凋亡的活性呈正比[ 8 , 9] 。因此 ,诱导肿瘤细胞凋
亡已成为寻找抗肿瘤药物的新靶点 ,以及评价药物
疗效的一项新指标。目前关于 PSP 对肿瘤细胞周期
与凋亡的实验研究 ,国内外尚未见文献报道。
作者曾对 PSP 的体内抗肿瘤作用及对免疫功能
的影响作了一些研究 ,发现其对 S180小鼠肿瘤有较
好的抑制作用 ,对小鼠的免疫功能亦有一定的调节
作用[ 10] 。本研究首先应用 MTT 法研究了 PSP 对
Hela 细胞及 HepG2细胞生长的影响 ,结果表明 PSP
对这两种人癌细胞株均有明显的抑制作用 ,进一步
证明 PSP 具有良好的抗肿瘤活性。
在此基础上 ,本研究又观察了 PSP 诱导的 Hela
细胞凋亡 ,试图从凋亡角度阐明其抗肿瘤作用机制。
之所以采用 Annexin V/PI 双染色法检测 ,是因为
Annexin V/PI 双染色法较 PI 单染色法及 DNA 电
泳法可更好地区分早期凋亡 、晚期凋亡及坏死细胞 ,
是目前判断早期凋亡的常用方法[ 11 , 12] 。而且该法在
本实验中显示出良好的正确性和重复性 ,不失为一
种快速 、定量检测凋亡的手段 。实验结果表明 PSP
可诱导 Hela细胞的早期凋亡 ,并具有良好的量效关
系和时效关系。另一方面 , PSP 对 Hela 细胞抑制率
与凋亡率之间的差异 ,说明 PSP 的抗肿瘤机制 ,除了
诱导肿瘤细胞凋亡 ,还存在细胞毒性等其他机制 ,是
多种机制共同作用的结果 。至于 PSP 诱导细胞凋亡
在抗肿瘤机制中所占的比重 ,有待进一步研究 。
鉴于 PSP 在具有良好抑瘤效果的同时 ,不伴有
明显的毒副作用 ,还能治疗或预防肿瘤病人化疗和
放疗过程中对正常细胞的损伤[ 10 , 13] 。因此 , PSP 作
为一种新型的抗肿瘤药物 ,值得进一步研究和开发 ,
具有广阔的应用前景 。
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(本文编辑:谭雪静)
(上接第 40页)
Experimental studies on antiproliferation activities and early
apoptosis inducement of polysaccharides from Spirulina platen-
sis
YUHong
1 , L Rui1 , ZHANG Xue-cheng2
(1 .Col lege of M edicine , Qingdao University , Qingdao 266021 , China;2.Co lleg e of M arine Li fe Science ,
Ocean Unive rsity o f China , Qingdao 266003 , China )
Received:Dec., 20 , 2005
Key words:po ly saccharides from Sp irulina platensis(PSP);antitumor effect;apopto sis;annexin V/P I
Abstract:In vi t ro experiments the antiproliferation activities of poly saccharides f rom S pirulina platensis
(PSP)were evaluated on Hela cells and HepG2 cells by M TT assay , the re sults show ed that PSP (2.5 ～ 40
mg/L , 48 ～ 72 h)exhibited dose and time inhibition effects on the cell growth.The early apoptosis of Hela cells
w as detected by f low cy tometry analy sis w ith a combinat ion of A nnexin V-FITC and PI double staining , the
apoptosis rates induced by PSP (5 , 10 , 20 , 40 mg/ L )were 30.3%, 32.6%, 34.8% and 38.8% respectively ,
which w ere higher than tho se of the no rmal control g roup(P<0.05).Meanwhile , the apoptosis rate t reated
by PSP(40 mg/L)also increased in time-dependent manner.These results suggested that one of the anti-tumor
mechanisms of PSP may be related to inhibition on cell prolife rat ion and induction o f no table apoptosis.
(本文编辑:张培新)
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