全 文 ：表 2　各组小鼠睾丸 Fas蛋白表达率的比较( x±s) %
组别 Fas表达率 Fasl表达率
正常 23.833 3±15.174 5◇◇ 17.666 7±10.232 6◇◇
模型 53.055 6±19.108 0◎◎** 35.500 0±12.320 5◎◎**
强精煎 27.555 6±11.637 5◇◇ 21.166 7±9.363 6◇◇
黄精赞育胶囊 33.000 0±18.855 5◇◇ 22.555 6±9.599 2◇◇
　　与正常组比较 , ◎P<0.05, ◎◎P<0.01;与模型组比较 , ◇P<0.05, ◇◇
P<0.01;与黄精赞育胶囊组比较 , *P<0.05, **P<0.01;n=18
各组的间质细胞 、支持细胞 、各级生精细胞及精子均可见
Fas和 Fasl蛋白的阳性表达。 Fas多表达在精母细胞 、精子及其
周围残留胞浆中 , Fasl多表达在间质区。
3.3　病理损伤程度与 Fas及 Fasl蛋白表达率的关系 见表 3。
表 3　 72例小鼠睾丸病理损伤程度、Fas和
Fasl蛋白表达率间的 Pearson相关系数
项目 Johnson评分 Fas表达率 Fasl表达率
Johnson评分 1 -0.902＊＊ -0.896＊＊
Fas表达率 -0.902＊＊ 1 0.904＊＊
Fasl表达率 -0.896＊＊ 0.904＊＊ 1
　　＊＊P<0.01(双侧检验)
4　讨论
生精细胞过度凋亡是造成睾丸生精功能障碍的直接原因。
以往的研究表明 , 以补肾健脾为主要功效的经验方强精煎具有修
复睾丸病理损伤 , 降低睾丸生精细胞凋亡率的作用 , 临床治疗少
弱精子症可以有效改善精子质量 [ 2 , 5 , 6] 。本次研究也显示 , 腹腔
注射环磷酰胺后 , 模型组小鼠睾丸 Johnson评分较正常组明显偏
低 , 而给予强精煎灌胃的治疗组 Johnson评分则较模型组有明显
改善 , 与之前的研究相符。
生精细胞凋亡有多种调节机制 ,其中胱门蛋白酶在生精小管
凋亡调控中具有核心作用 ,其中涉及死亡受体 Fas及其配体 Fasl
的信号通路是哺乳动物生精细胞凋亡通过胱门蛋白酶的主要途
径之一。该通路又称为外源性通路 , Fas为一个单跨膜受体蛋
白 , 属于肿瘤坏死因子受体 /神经生长因子受体家族 ,当其与之配
体 Fasl结合后可导致 Fas三聚化 , 后者通过死亡结构域(DD)与
Fas-相关死亡结构域(FADD)结合。 FADD的 N-末端还包括
死亡效应结构域(DED)。 Fas/ FADD复合物随后通过 FADD
上的 DED与胱门蛋白酶原 8或 10结合 , 并激活后者 ,从而启动
分解信号并导致细胞解体 [ 7] 。国内研究证实 [ 8] , Fas及 Fasl系统
确实可以介导生精细胞的过度凋亡 , 引起生精功能障碍 , 并且其
定位不只局限在生精小管内 , 亦可能发生在间质细胞中。本次实
验也观察到 ,模型组各级生精细胞和支持细胞及间质细胞都可见
Fas和 Fasl的高表达 , 且 Fasl多表达在间质区 , Fas多表达在生精
细胞。同时 , 统计显示 ,所有小鼠睾丸 Johnson评分总体与 Fas和
Fasl的表达率间分别呈负相关性 ,说明 Fas和 Fasl系统可能在环
磷酰胺所致的小鼠生精细胞过度凋亡中发挥着重要作用 ,而且靶
点较为广泛。组间比较显示 , 强精煎组 Johnson评分和 Fas及
Fasl表达率与正常组和黄精赞育胶囊组无明显区别 , 但与模型组
区别显著 ,说明强精煎同黄精赞育胶囊一样 , 可以下调 Fas和
Fasl在丸组织中的表达 ,这可能是其降低生精细胞凋亡率 , 修复
组织损伤 ,改善受损的生精功能的分子机制之一。
本次实验在观察中还注意到 ,强精煎组小鼠睾丸的三类细胞
中 Fas和 Fasl表达率均较模型组有所减少 ,说明其对三类细胞均
有影响。我们知道 , 间质细胞可以接受黄体生成素的刺激信号分
泌睾酮 ,而睾酮通过调节支持细胞 , 又对生精细胞的生存和分化
具有重要调控作用 ,同时 Francavila等 [ 9]的研究又表明 , 人类睾
丸 Fas和 Fasl的表达是在促性腺激素控制下进行的。 所以这可
能意味着 , 强精煎抑制生精细胞凋亡的机制中除了 Fas和 Fasl系
统的直接作用外可能还有内分泌因素的存在 ,这有待于今后作进
一步探讨。
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收稿日期:2009-05-05;　修订日期:2009-09-17
基金项目:广西科学研究与技术开发计划项目(No.0992025-22);
广西自然科学基金(No.0991137)
作者简介:庞　辉(1962-),女(汉族),广西博白人 ,现任广西医科大学教授 ,硕士学位 ,主要从事海洋产品的研究与开发工作.
螺旋藻激酶对大鼠动静脉环路血栓的溶栓作用研究
庞　辉 ,李小花 ,陈高斯 ,凌凯南 ,王保斌 ,张崔勇 ,黄家俍 ,刘　庆 , 朱召熊 ,安　明 ,蒙　莲
(广西医科大学 ,广西 南宁　530021)
摘要:目的 探索螺旋藻激酶(SPK)对大鼠动静脉环路血栓的溶栓作用及其机制。方法 采用大鼠颈动 -静脉环路血栓
模型 , 通过称取血栓重量来测定螺旋藻激酶的溶栓作用;腹主动脉取血分离血浆 ,测定螺旋藻激酶对血浆 D二聚体 、TPA
含量的影响。结果 螺旋藻激酶使动静脉环路血栓干 、湿重明显减轻 ,高 、低剂量螺旋藻激酶使血浆 D-二聚体含量明显
升高(P均 <0.05), 高剂量螺旋藻激酶使 TPA含量明显升高(P<0.05)。结论 螺旋藻蛋白激酶能抑制血栓形成 , 激活
纤溶活性 , 具有较好溶栓效力。
关键词:螺旋藻蛋白激酶;　颈动静脉血栓形成;　血栓溶解
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)04-0908-02
·908·
时珍国医国药 2010年第 21卷第 4期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.4
　　血栓性疾病是临床常见病 , 严重地危害人们的健康 , 寻找具
有抗凝和溶栓作用的物质对防治血栓性疾病具有广泛的临床实
用价值。螺旋藻(Spirulina)是一种水生植物 , 广泛分布于中国广
西 、福建 、浙江 、云南 、海南等省区 , 具有增强免疫力 、抗辐射 、抗疲
劳等药理作用 , 它现在已经被开发出具有多种功效的天然绿色保
健品 [ 1] 。我们首先从螺旋藻的发酵物中发现一种具有溶解纤维
蛋白作用的蛋白激酶类活性成分 , 我们称它为螺旋藻激酶
(SPK), 本试验主要使用螺旋藻激酶提取液观察它对大鼠动静脉
环路血栓的溶栓作用及其溶栓机制 ,为开发廉价有效的治疗血栓
性疾病的药物提供实验依据。
1　器材与方法
1.1　药品与试剂 肝素钠注射液(天津市生物化学制药厂
061226);纤维蛋白原冻干粉(24mg广西医科大学实验中心蛇毒
所研制)、凝血酶(由中国药品生物制品所提供), TPA含量测定
试剂盒(上海太阳生物技术公司), 尿激酶(丽珠集团丽珠制药
厂 , 批号 国药准字 H44020645,产品批号 060701),其他均为国产
分析纯。
1.2　SPK粗酶提取物的制备 按照螺旋藻激酶粉 [由北海市康福
保健食品有限公司提供 ,经广西测试中心检测其蛋白激酶含量为
6 000FU(活力单位)/g] 10 g粉剂溶于 100 ml生理盐水的比例混
匀 , 以 3 000r/min离心 10 min,取一定体积上清液搅拌加入饱和
硫酸铵溶液 , 然后以 8 000r/min低温离心 20min后 ,依次分别获
得 0 ～ 15% , 15% ～ 35% , 35% ～ 45% , 45% ～ 55% , 55% ～
65%, 65% ～ 75%饱和度的蛋白质沉淀 , 用三蒸水溶解 , 倒入透析
袋 , 置于冰箱中进行透析 ,除去硫酸铵 , 然后置于低温冷冻干燥机
中干燥得各段盐析产物的粉剂。取各段盐析产物在琼脂糖 -纤
维蛋白平板上进行溶圈实验 ,取纤溶活性高的部分为 SPK提取
物。
1.3　动物与仪器 Wistar大鼠 , 雌雄不拘 ,体质量 300 ～ 350 g,由
广西医科大学实验动物中心提供。动物合格证号桂动许字
(2000)第 001号。主要仪器:电热恒温水浴箱(姜堰市天力医疗
器械有限公司生产);电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂 ,型
号:G2X-DH-40＊4.5-BS);电子分析天平(sartorious公司生
产 , 型号:BP190S81136606);TDL25台式离心机(上海安亭科学
仪器厂)。
2　方法
2.1　大鼠动静脉环路血栓模型的制备及给药 Wistar大鼠 40
只 , 随机分为 4组 ,每组 10只 , 即 SPK高剂量组(1 mg/ml)、低剂
量组(0.3mg/ml), 生理盐水阴性对照组及尿激酶阳性对照组
(2 000μl/ml), 大鼠以 20%氨基甲酸乙酯 0.5 ml/100 g腹腔麻
醉 , 由股静脉按 0.5 ml/100 g推药 , 参照文献制作动静脉环路血
栓模型 , 分离右侧颈总动脉及左侧颈外静脉 , 并将两根用肝素生
理盐水(25U/ml)处理的聚乙烯管分别插入颈总动脉及颈外静
脉 , 在动 -静脉旁路的连接管内插入一段长 8 cm的钢丝 , 用药后
40 min开放动脉静脉环路 15 min,中断血流形成血栓 [ 2 , 3] 。
2.2　动静脉环路血栓测定 用药后 40 min开放动脉静脉环路 15
min,中断血流形成血栓后迅速取出包裹钢丝的血栓称重 , 并减去
钢丝重量 , 即得血栓湿重 ,并求出其血栓抑制率。在 70℃干燥箱
中 1 h后 ,待其冷却后称取干重 , 求出血栓抑制率 [ 2] 。
2.3　血浆 D二聚体和 TPA含量的测定 腹主动脉取血及分离
得到血浆 , 在广西医科大学第一附属医院检验科测定 D二聚体
含量 , 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆 TPA的含量。
2.4　统计学处理 数据处理所测数据由作者采用 SPSS10.0软
件经计算机处理 , 统计结果以 x±s表示 ,组间差别显著性用 t检
验判定。
3　结果
3.1　SPK对大鼠动静脉环路血栓形成重量的影响 结果显示 ,
SPK有抑制动静脉环路血栓形成的作用 , 使血栓形成的湿重及干
重明显减轻 ,与对照组比较有显著性差异 , 且呈量效依赖关系。
结果见表 1。
表 1　SPK对大鼠动静脉环路血栓形成重量的影响( x±s)
组别 剂量C/ml· (100g)-1
血栓湿重
重量 m/mg溶栓率(%)
血栓干重
重量m/mg溶栓率(%)
生理盐水 0.5 92.37±4.49 - 26.31±3.81 -
SPK(低) 0.5 59.41±3.06＊ 35.87 11.45±.324＊ 57.69SPK(高) 0.5 22.24±6.36＊ 76.09 4.71±1.47＊ 81.92
尿激酶 0.5 33.10±2.82＊ 64.13 6.6±1.124＊ 74.62
　　与生理盐水组比较 , ＊P<0.05;n=10
3.2　SPK对大鼠血浆 D二聚体和 TPA的含量的影响 结果显
示 , 高 、低剂量 SPK均使 D二聚体含量显著增加 , 高剂量 SPK使
TPA含量显著增加 ,且从数值上看 ,有剂量效应依赖关系。结果
见表 2。
表 2　SPK对大鼠 D二聚体和 TPA的含量的影响( x±s)
组别 剂量C/ml· (100g)-1
D二聚体
m/mg· L-1
TPA
m/ng· ml-1
生理盐水 0.5 194.2±15.6 14.5±1.6
SPK(低) 0.5 289.0±18.8＊ 15.1±1.8SPK(高) 0.5 461.0±48.9＊ 36.5±8.9＊
尿激酶 0.5 310.5±48.9＊ 10.5±4.9
　　与生理盐水组比较 , ＊P<0.05;n=10
4　讨论
螺旋藻激酶(SPK)是利用液体发酵的技术从螺旋藻生产出
的蛋白酶 ,前期我们研究发现 SPK有较高的溶栓活性。 本实验
我们验证其体内溶栓活性 , 实验结果表明 SPK可抑制动静脉环
路血栓 , 使血栓形成的湿重及干重明显减轻 ,与对照组比较有显
著性差异 ,且呈量效依赖关系。血栓是血液中纤维蛋白多聚体与
细胞组成的复合物 ,血栓溶解的中心环节在于纤维蛋白的溶解。
纤维蛋白溶解分为两个基本阶段 , 第一阶段:纤溶酶原被纤溶酶
原激活物激活为纤溶酶。纤溶酶原激活物(TPA)是内皮细胞合
成的一种丝氨酸蛋白酶 , 在血栓形成时 , TPA与纤维蛋白原形成
复合物后在局部有效地激活纤溶酶原转化为纤溶酶而使血栓溶
解 [ 4] 。本实验中 , 大鼠注射 SPK溶液后 , 血浆 TPA含量增加 , 且
随着用药剂量的增加 ,其含量有递增趋势 , 说明 SPK可以通过促
进内皮细胞合成分泌 TPA来促进纤溶作用;第二阶段:纤溶酶分
解纤维蛋白和纤维蛋白原为许多可溶性的小肽 ,称为纤维蛋白降
解产物 ,而 D二聚体为交联纤维蛋白降解的特异性分子标记物 ,
为降解产物中的最小片段 ,是血栓被溶解的直接证据 [ 4, 5] 。本实
验制作大鼠动静脉环路血栓模型 , 大鼠注射 SPK溶液后 , 血浆 D
二聚体含量明显增加 ,且随着用药剂量的增加有递增趋势 , 说明
SPK可使血液系统的纤溶活性增强 ,使纤维蛋白溶解 ,特异性降
解产物增多。综上所述 SPK具有溶栓作用 , 但其溶栓作用的机
制有待进一步研究 ,同时由于提取工艺不成熟 , 产品成分复杂 , 纯
度低 , 作用效果尚不够稳定 , 也有待今后我们进一步进行分离提
纯 , 为开发价格更低 、作用更显著 , 副作用更少更安全的新型溶
栓药物提供了实验与理论联系实际依据。
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