全 文 ：收稿日期:2009 － 04 － 22;修回日期:2009 － 06 － 01
doi∶10． 3969 / j. issn. 1008 － 9632． 2010. 04. 068
钝顶螺旋藻 luxAB载体的构建
朱一伟，唐欣昀
(安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036)
摘 要:实验拟构建钝顶螺旋藻 luxAB载体，为螺旋藻遗传转化操作系统的建立提供技术参考和支持。使用 EcoRI
和 SmaI双酶切质粒 pUCΩGUS，胶回收获得含有 Ubil启动子基因及 amp基因的载体大片段;根据质粒 pRL1063a中
luxAB基因的序列设计引物，以质粒 pRL1063a为模板(SalI 酶切) ，PCR 扩增 luxAB 基因片段;在 T4 DNA 连接酶的
作用下将载体大片段和 luxAB基因片段进行体外连接重组并转化感受态细胞，构建成新型质粒载体 pUCΩluxAB。
关键词:钝顶螺旋藻;报告基因 luxAB ;质粒;酶切
中图分类号:Q943． 2 文献标识码:A 文章编号:1008 － 9632(2010)04 － 0068 － 03
Construction of pUCΩluxAB vector of Spirulina platensis
ZHU Yi-wei，TANG Xin-yun
(School of Life Science，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)
Abstract:In this experiment，luxAB vector of Spirulina platensis for the genetic handle system of Spirulina platensis was constructed．
The plasmid pUCΩGUS was digested by the restriction enzyme SmaI and EcoRI，and the fragment with promoter Ubil and amp gene
was recovered． According to the sequence of luxAB gene in the plasmid pRL1063 a，primers were designed with the digested points of
SmaI and EcoRI in the upriver and downriver． With the template of pRL1063a digested by SalI，the luxAB gene fragment was received
by PCR． Then the victor fragments and luxAB gene were recombined with T4 DNA ligase． The reconstructed plasmid is pUCΩluxAB
with the luxAB and amp gene． Furthermore，the reconstructed plasmid was transformed into E． coliDH5α．
Keywords:Spirulina platensis;luxAB reporter;plasmid;digestion
螺旋藻作为一种基因转化受体，与大肠杆菌、酵
母、植物和动物相比，除了具有高安全性、高营养性和
高药用价值外，还具有基因组结构简单，对外源蛋白质
容受力高，繁殖迅速，再生快等独到之处［1］。螺旋藻正
是以其自身的优势，向人们展示了它作为生物反应器
的广阔应用前景和巨大潜力。藻类基因工程的研究，
目的是为了通过重组 DNA技术构建藻类新品种，如将
外源目的基因(如 SOD 基因，植物的不饱和脂肪酸基
因等)引入螺旋藻，对培育优质高产适用性强的新品系
与开发食品资源及发展海洋药物都具有十分重要的意
义［2］。
质粒 pRL1063a(报告基因 luxAB)是大肠杆菌-鱼
腥藻穿梭质粒，本身即可在蓝细菌中表达，质粒
pUCΩGUS是大肠杆菌-盐藻穿梭质粒。本实验通过改
造质粒 pRL1063a 和质粒 pUCΩGUS 来构建钝顶螺旋
藻 luxAB穿梭载体，以实现在螺旋藻细胞中表达。
luxAB分别编码细菌发光酶的 α 和 β 亚单位，共
同组成具有强活性的异质二聚体细菌发光酶［3］。lux-
AB基因作为一种新型的报告基因具有许多优点: (1)
检测方便，只需荧光显微镜或激发光源;(2)材料无需
前处理，可以活体观察;(3)不需任何反应底物及其它
辅助因子;(4)由于植物、微生物本身不含有 luxAB，不
会出现假阳性结果。另外，luxAB 作为分子探针可以
代替用于细胞学研究的荧光染料而避免由于染料扩散
造成的定位不准等等。目前已广泛地应用在植物的转
基因的研究中［4］。
1 材料与方法
1． 1 实验菌株
质粒 PRL1063a (报告基因 luxAB)［5］ 和 质 粒
pUCΩGUS分别由美国密歇根州立大学的 C． Peter．
wolk教授和中国遗传所耿德贵和陈颖博士惠赠。
1． 2 培养基
配制无菌 Zarrouk［6］培养基时，各组分溶液先分别
高压蒸汽灭菌，SOLⅡ、SOLⅢ 121℃ 灭菌 20min，
SOLⅠ、SOLA5、SOLB6115℃灭菌 25min，灭菌后各溶液
按比例混合保存备用。配固体培养基时蒸馏水与 1%
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琼脂粉一起灭菌，并加入 2%豆芽汁［7］。SOLⅠ现配现
用。
LB培养基配方(g /L)胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，
NaCl 10，pH值 7． 0，121℃灭菌 20min。
1． 3 试剂
1． 3． 1 主要试剂
Zarrouk 溶液所需试剂及磷酸缓冲液所需试剂均
为国产分析纯，琼脂粉为 Sigma 公司产品。RNaseA、氯
仿、异戊醇、限制性内切酶、T4DNA 连接酶、DNA Mark-
er、pfu高保真聚合酶、胶回收试剂盒、电泳缓冲液所需
试剂［8］购自上海生工生物工程公司。
1． 3． 2 聚合酶链式反应的引物
根据质粒 pRL1063a 中 luxAB 基因的序列设计引
物，并在上下游分别加入 EcoRI 和 SmaI 酶切位点。引
物序列如下:
上游引物:5-AATCCCGGGTAGCTACTTGGAGCCT-
GACTC-3，下 游 引 物: 5-GCGGAATTCGCAGAC-
CAAAACGATCTCAAG-3［9］，引物合成由上海生工生物
工程公司完成。
1． 4 实验方法
1． 4． 1 质粒抽提
采用常规碱裂解法提取实验质粒。
1． 4． 2 聚合酶链式反应(PCR)［8］
将反应各成分加在 0. 2 mL 灭菌离心管，温和混
匀，反应成分如下:
10 × pfu PCR Buffer 5μL，20mmol /L 4 种 dNTP 混
合液 pH 值 8． 0 1μL，20μmol /L 上游引物 2μL，20μ
mol /L 下游引物 2μL，Pfu DNA 聚合酶 1μL，H2O
35μL，模板 DNA 4μL。
反应程序:预变性 94℃，5min;变性 94℃，1min;退
火 55℃，1min;延伸 72℃，4min30s;延伸 72℃，10min;
循环 30 次。
抽取扩增后样品 5μL，用琼脂糖凝胶电泳分析扩
增结果。
1． 4． 3 纯化及酶切 PCR产物
琼脂糖凝胶电泳 PCR 产物，在紫外灯下切下含有
目的片段的胶块，用凝胶回收试剂盒回收目的片
段［10］。Buffer 8μL、纯化的 PCR产物 29μL、EcoRI 1μL、
SmaI 2μL，37℃水浴 4h，用凝胶回收试剂盒回收纯化
酶切产物。
1． 4． 4 双酶切质粒 pUCΩGUS及回收载体大片段
Nuclease-free water 5μL、Buffer 2μL、pUCΩGUS
1. 5μL、EcoRI 0. 5μL、SmaI 1μL，37℃水浴 6h。琼脂糖
凝胶电泳分离纯化载体大片段，用凝胶回收试剂盒回
收载体大片段。
1． 4． 5 体外连接重组及转化和重组子筛选
酶切回收的 PCR产物 7μL、载体大片段 1μL、10 ×
T4 ligation buffer 1μL、T4DNA ligase 1μL，16℃水浴 8h，
进行体外连接重组，采用热激法转化感受态细胞E． coli
DH5α。
挑取 Amp(50μg /mL)平板上的单菌落接种于 Amp
(100μg /mL)LB液体培养基，160r /min 培养 12h，离心
收集细胞，抽提质粒进行酶切鉴定。
2 结果与分析
2． 1 PCR反应扩增 luxAB
如图 1 所示，以线型的质粒 p1063a(SalI 酶切)作
为模板 DNA能有效地扩增出目的基因片段 luxAB，并
且非特异性扩增不明显［8］，扩增的目的基因片段大小
为 2． 5kb左右，符合预期的目的片段大小，为后续的酶
切回收试验做好基础。
图 1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig 1 Gel electrophoresis of PCR product
1:DNA Markers2000;2、3:PCR of fragments of pRL1063a digested
with SalI;4:collator;
2． 2 双酶切 pUCΩGUS的结果检测
如图 2 所示，pUCΩGUS 质粒经 EcoRI 和 SmaI 双
酶切后，获得大片段和小片段，泳道 2 上面的条带所示
的是目的载体大片段，下面的条带所示的是小片段。
目的大片段的大小为 4． 5kb 左右，小片段的大小为
2. 4kb左右，符合预期结果。
图 2 pUCΩGUS质粒双酶切后的电泳检测图
Fig 2 Gel electrophoresis of plasmid pUCΩGUS double digested
1． Plasmid pUCΩGUS ;2． Plasmid pUCΩGUS double digested;3．
DNA Marker;
2． 3 重组子鉴定
如图 3 所示，重组子经 SmaI单酶切后的片段大小
为 7kb左右，符合预期的大小。由于 PCR 扩增的 lux-
AB片段中有两个 XbaI 酶切位点，两酶切位点之间的
片段大小为 2kb 左右，所以对重组子进行双酶切鉴定
时选用了限制性内切酶 XbaI。如图 4 所示，重组子经
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XbaI双酶切后大、小片段的大小分别为 5kb 和 2kb 左
右，符合预期的大小。通过酶切的初步鉴定，重组质粒
pUCΩluxAB构建成功，能否在螺旋藻细胞中表达需进
一步鉴定。
图 3 重组质粒单酶切电泳检测图
Fig 3 Gel electrophoresis of recomposed plasmid digested by SmaI
1． DNA marker;2． recomposed plasmid digested by SmaI
图 4 重组质粒双酶切电泳检测图
Fig 4 Gel electrophoresis of recomposed plasmid double digested by XbaI
1． DNA marker;2． recomposed plasmid double digested by XbaI;3． re-
composed plasmid
3 讨论
本实验选择质粒 pRL1063a 和质粒 pUCΩGUS 为
出发质粒，质粒 pRL1063a 中含有 luxAB 基因，质粒
pUCΩGUS中含有 Ubil 启动子和 amp 基因，Ubil 启动
子能有效地启动外源基因在蓝藻细胞中表达，保障质
粒的顺利复制，是外源基因在螺旋藻细胞中表达的理
想启动子［11］。目的载体大片段不仅具有大肠杆菌的
复制起始位点，还具有能被螺旋藻细胞识别的蓝藻质
粒复制起始位点，保证构建的穿梭质粒在藻细胞中自
主复制。amp抗性基因为转化子的筛选提供了条件。
本实验首次构建钝顶螺旋藻 luxAB 穿梭载体，并
成功转化大肠杆菌 E． coliDH5α，重组质粒在细胞内获
得高拷贝数并能稳定传代遗传。
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