全 文 ：　　收稿日期: 2003-09-04
　　基金项目: 湖南省教育厅资助项目 ( 02C056)
　　作者简介: 谭泽芳 ( 1981-) ,男 ,汉族 ,湖南邵阳人 ,湖南
农业大学硕士研究生 .
　　文章编号: 1007-1032( 2003) 06-0478-04
广玉兰的离体培养研究
谭泽芳1 ,洪亚辉1, 2 ,胡　超 1
( 1.湖南农业大学生物技术系 ,湖南 长沙　 410128; 2.湖南农业大学植物激素重点实验室 ,湖南 长沙　 410128)
摘　要:以广玉兰的叶芽、花托、花被、雄蕊、幼叶为试材 ,用 M S为基本培养基 ,添加不同浓度的 2, 4-D, N AA , 6-
BA ,筛选适合其脱分化、分化、生根的培养基 ,结果表明:最适外植体为叶芽 ,在 M S+ 2, 4-D 3. 5～ 5 mg /L+ N AA
3～ 5 mg / L+ 6-BA 0. 8～ 1. 2 mg / L+ AC 0. 8 g / L的培养基上都能很好地诱导出愈伤组织 ,其中速率最快的最佳
培养基是 MS+ 2, 4-D 4. 5 mg / L+ N AA 3 mg /L+ 6-BA 1. 2 mg / L+ AC 0. 8 g /L;愈伤组织继代培养基为 M S+ 2,
4-D 2. 5 mg /L+ NAA 2. 5 mg / L+ 6-BA 1. 2 mg / L+ AC 0. 8 g /L;胚状体的诱导培养基为 MS+ 2, 4-D 1. 5 mg /L
+ N AA 1. 5 mg / L+ 6-BA 2 mg /L+ AC 0. 8 g / L;诱导胚状体成苗培养基为 MS+ 2, 4-D 0. 2 mg / L+ N AA
0. 2 mg /L + 6-BA 2 mg / L+ AC 0. 8 g /L;生根培养基为 1 /2 M S+ NAA 0～ 1 mg /L+ 6-BA 1. 5～ 2 mg /L+ AC
0. 8 g /L.
关　键　词: 广玉兰 ;离体培养 ;愈伤组织 ;胚状体
中图分类号: S685. 150. 36　　　　　　　　文献标识码: A
Invit ro Culture of Magnolia grandi f lora
TAN Ze -fang 1 ,HONG Ya -hui 1, 2 ,HU　Chao 1
( 1. Depa rtment o f Bio technolog y , HNAU , Chang sha　 410128, PRC; 2. Key Labo rato ry o f Ph ytoho rmones, HNAU ,
Chang sha　 410128, PRC)
Abstract: Wi th leaf bud, receptacle, perianth, stamen, young leaf as material and M S as basic cul-
ture which adds dif ferent concentra tion of 2, 4-D, N AA, 6-BA, The authors at tempt to screen opti-
mum culture medium which sui t for dedi fferentiation, dif ferentiation and shoo t division. Resul ts
show tha t the most sui table explants are leaf buds. The medium which can induce callus smoo thly
is M S+ 2, 4-D 3. 5～ 5 mg /L + N A A 3～ 5 mg /L + 6-BA 0. 8～ 1. 2 mg /L+ AC 0. 8 g /L. Among
them the fastest and best medium is M S+ 2, 4-D 4. 5 mg /L+ N A A 3 mg /L+ 6-BA 1. 2 mg /L+
AC 0. 8 g /L. The best medium for pro li ferating is M S+ 2, 4-D 2. 5 mg /L+ N AA 2. 5 mg /L+ 6-
BA 1. 2 mg /L+ AC 0. 8 g /L. The medium fo r induce embryoid is M S+ 2, 4-D 1. 5 mg /L+ N AA
1. 5 mg /L+ 6-BA 2 mg /L+ AC 0. 8 g /L. The medium fo r induce plant is M S+ 2, 4-D 0. 2 mg /L
+ N AA 0. 2 mg /L+ 6-BA 2 mg /L+ AC 0. 8 g /L. The ro oting medium is 1 /2 M S+ N AA 0～ 0. 5
mg /L+ 6-BA 1. 5～ 2 mg /L+ AC 0. 8 g /L. This research provides reference fo r the indust riali zed
breeding o f Magnol ia grandif lora and the entry of o ther gene.
Key words: Magnolia g randi flo ra; invi t ro cul ture; callus; embryoid
　　广玉兰 Magnolia grandi f lora ,木兰科木兰属 ,
又名荷花玉兰 ,洋玉兰 .原产北美洲东部 ,引入中国
已有百年历史 ,是适合亚热带的珍贵观赏树种 [1 ] .广
玉兰树姿雄伟壮丽 ,四季常青 ,庭院、公园多有栽培 .
它抗性较强 ,病虫害少 ,能耐烟抗毒 ,也是净化空气 ,
美化及保护环境的优良树种 [2 ] .木兰科植物在愈伤
组织的诱导、不定芽产生、生根方面均较难 ,因此木
兰科树种的离体繁殖存在很大难度 ,有关报道也不
多 [3 ] .木兰科植物的离体繁殖一般是通过外植体直
接生成丛生芽 [4～ 7 ] .尚未发现有木兰科植物由愈伤
组织分化成植株进而繁育苗木的报道 .笔者通过组
织培养技术建立了广玉兰离体培养和植株再生的体
系 ,旨在为广玉兰的外源基因导入、品种改良和工厂
化育苗奠定基础 .
第 29卷第 6期 湖南农业大学学报 (自然科学版 ) 　 Vol. 29 No. 6
2003年 12月 Journal of Hunan Ag ricultura l Univ er sity ( Na tural Sciences) Dec. 2003 „
DOI : 10. 13331 /j . cnki . jhau. 2003. 06. 006
1　材料与方法
1. 1　材　料
广玉兰叶芽、花托、花被、雄蕊、幼叶 ,于 2003年
4月采自湖南农业大学校园 .
1. 2　方　法
采回材料去掉表皮 ,用 75%酒精浸泡 0. 5 min,
HgCl2灭菌 10 min,无菌水冲洗 3次 ,接种 .培养基
以 MS附加不同浓度的 2, 4-D, N AA, 6-BA. 脱分
化过程以叶芽为外植体 .
1. 3　试验设计
( 1)脱分化试验 .Ⅰ .当 NAA, 6-BA的质量浓
度分别为 4, 1 mg /L时 , 2, 4-D设 0, 2, 3, 3. 5, 4. 5,
5, 5. 5 mg /L 7个梯度 .Ⅱ .当 2, 4-D, 6-BA的质量
浓度分别为 4, 1 mg /L时 , N AA设 0, 1, 3, 5 mg /L 4
个梯度 .Ⅲ .当 2, 4-D, N AA的质量浓度均为 4 mg /
L时 , 6-BA设 0, 0. 6, 0. 8, 1. 2, 1. 5 mg /L 5个梯度 .
Ⅳ .在 M S+ 2, 4-D 4. 5 mg /L+ N AA 3 mg /L+ 6-
BA 1. 2 mg /L上筛选叶芽、花托、花被、雄蕊、幼叶 5
种外植体 .
( 2)分化试验 .Ⅰ . 6-BA的质量浓度 2 mg /L,
2, 4-D分别设为 0, 0. 2, 0. 7, 1, 1. 5, 2 mg /L, N AA
分别设为 0, 0. 5, 1, 1. 5 mg /L.将这些浓度的激素进
行组合 .Ⅱ .诱导生根 ,基本培养基用 MS培养基和
1 /2 M S培养基 , 2, 4-D质量浓度为 0～ 1 mg /L,
N A A浓度为 0～ 1 mg /L, 6-BA浓度为 1～ 2 mg /L.
所有试验的外植体数均为 24块 ,长度大约 0. 5
cm,宽约 0. 2 cm.培养基 pH 6. 0,琼脂 7 g /L ,白糖
30 g /L, AC 0. 8 g /L,诱导培养和继代培养在 26～
30℃无光照条件下培养 ,分化培养所需温度为 28～
30℃ ,分化苗的过程中待诱导出胚状体后转到光照
条件下生长 ,光照度 2 000 lx.
2　结果与分析
2. 1　不同生长调节剂对脱分化的影响
2. 1. 1　不同浓度 2, 4-D对脱分化的影响
NAA的质量浓度为 4 mg /L, 6-BA为 1 mg /L
时 , 2, 4-D对愈伤组织的诱导起着关键作用 .结果
(表 1)表明 ,当 2, 4-D质量浓度小于 3. 0 mg /L时 ,
愈伤组织难以生长 .当 2, 4-D达到 5. 5 mg /L时 ,愈
伤组织诱导率明显下降 ,为 50% ,而在 3. 5～ 5. 0
mg /L诱导率可达 100% ,而且愈伤组织量多 ,褐化
少 . 2, 4-D用量在此范围内变化时都能诱导出愈伤
组织 ,对结果无明显影响 .其中 2, 4-D用量在 4. 5
mg /L时愈伤组织的诱导速率更快 .
表 1　不同 2, 4-D浓度的培养基上生长情况
Table 1　The different growing stations in medium
with various concentration of 2, 4-D
2, 4-D质量浓度
/( mg· L- 1 )
愈 伤 组 织 数
5 d 9 d 14 d 18 d 21 d
诱导率
/%
　　　 0 褐化 0 　 0 　 0 　 0 　　 0
2. 0 褐化 0 0 0 0 0
3. 0 膨大 0 2 7 14 58. 3
3. 5 膨大 1 12 24 24 100
4. 5 膨大 2 13 24 24 100
5. 0 膨大 1 10 22 24 100
5. 5 部分膨大 0 8 12 12 50
2. 1. 2　不同浓度 NAA对脱分化的影响
2, 4-D质量浓度为 4 mg /L , 6-BA为 1 mg /L
时 , N AA对广玉兰愈伤组织的诱导有一定的
调节作用 (表 2) .不加 NAA时愈伤组织的诱导率达到
62. 5% ,当 NAA质量浓度达到 3. 0 mg /L时 ,愈伤
组织的产率都在 95%以上 , N AA质量浓度在 3. 0～
5. 0 mg /L时对培养结果无明显影响 . N AA用量在
3. 0 mg /L时愈伤组织的诱导速率更快 .
表 2　不同 NAA浓度的培养基上生长情况
Table 2　The different growing stations in medium
with various concentration of NAA
NAA质量浓度
/( mg· L- 1 )
愈 伤 组 织 数
5 d 9 d 14 d 18 d 21 d
诱导率
/%
0 膨大 0 　 2 12 15 　 62. 5
1 膨大 0 4 15 18 75. 0
3 膨大 1 12 22 23 95. 8
5 膨大 0 10 20 22 91. 7
2. 1. 3　不同浓度 6-BA对脱分化的影响
2, 4-D, N AA质量浓度均为 4 mg /L时 , 6-BA
作为细胞分裂素在愈伤组织的诱导中也起着比较重
要的作用 (表 3) . 6-BA在 0. 8～ 1. 2 mg /L变化时对
愈伤组织的诱导结果影响不大 ,但超过这个范围 ,愈
伤组织诱导率会明显降低 .当 6-BA为 1. 2 mg /L时
愈伤组织的诱导效果更好 .
将诱导出的愈伤组织进行继代培养 ,经过几种
培养基的筛选 ,发现在 MS+ 2, 4-D 2. 5 mg /L+
N AA 2. 5 mg /L+ 6-BA 1. 2 mg /L+ AC 0. 8 g /L的
培养基上培养 ,愈伤组织增殖速率快、活力强 , 2周
后愈伤组织增加约 1倍 ,颜色为黄白色 ,质地紧密 .
479　第 29卷第 6期 谭泽芳等　广玉兰的离体培养研究
表 3　不同 6-BA浓度的培养基上生长情况
Table 3　The different growing stations in medium
with various concentration of 6-BA
6-BA质量浓度
/( mg· L- 1 )
愈 伤 组 织 数
5 d 9 d 14 d 18 d 21 d
诱导率
/%
　　　 0 褐化 0 　 0 　 0 　 0 　　 0
0. 6 膨大 0 2 5 7 29. 2
0. 8 膨大 1 12 20 23 95. 8
1. 2 膨大 0 12 21 24 100
1. 5 膨大 0 3 7 7 29. 2
2. 2　不同外植体培养效果
不同外植体在培养基上生长情况见表 4,外植
体试验结果见图 1-5.结果表明 ,叶芽和花托是最好
的外植体 ,用其来诱导愈伤组织速率快 ,产生愈伤组
织量多 .花被产生的愈伤组织量少 .叶片由于有蜡质
表面 ,很难启动产生愈伤组织 .用雄蕊诱导愈伤组织
速率太慢 , 3周后才有愈伤组织出现 ,而且量少 .
表 4　不同外植体生长情况
Table 4　The growing stations of various explants
外植体 愈 伤 组 织
5 d 10 d 15 d 20 d 25 d
叶芽 膨大 出现 较多 很多 部分褐化
花托 膨大 膨大 出现一些 很多 部分褐化
花被 稍膨大 膨大 边缘出现 较多 较多
雄蕊 - - 少数膨大 膨大 出现
幼叶 少许褐化 全部褐化 - - -
2. 3　不同生长调节剂对分化的影响
木兰科植物在苗和根的分化上都比较难 , 2, 4-
D对愈伤组织的诱导有强烈作用 [8 ] ,笔者经多次试
验后也发现: 只有在加了 2, 4-D的培养基上才可诱
导出胚状体 ,甚至在 2, 4-D达到 1 mg /L才有效果 .
N A A对胚状体的诱导也有一定调节作用 ,当 6-BA
的质量浓度不变为 2. 0 mg /L时 , 2, 4-D和 NAA不
同配比诱导分化培养基的筛选情况见表 5.
在 5号 , 7号 , 8号培养基上愈伤组织都能分化
出较多胚状体 ,但是在 8号培养基上分化速率明显
要比 5号 , 7号快 ,分化率更高 .在 MS+ 2, 4-D 1. 5
mg /L + N AA 1. 5 mg /L + 6-BA 2. 0 mg /L+ AC
0. 8 g /L上接入黄白色愈伤组织 ,在黑暗条件下培
养 , 2周后有芽尖冒出 ,诱导出胚状体 (图 1-6) .但在
这种培养基上继续培养 ,胚状体没有继续分化成植
株 ,而是保持原状 ,一个月后逐渐变黑死亡 .由此可
表 5　分化培养基的筛选
Table 5　The screening of di fferentiation medium
编号
激素质量浓度
/( mg· L- 1 )
2, 4-D NAA
生 长 情 况
1 　 0 　 0 逐渐褐化死亡
2 0. 2 0 逐渐褐化死亡
3 0. 7 0. 5 逐渐褐化死亡
4 1. 0 0. 5 极少量愈伤组织分化出胚状体
5 1. 5 0. 5 较多愈伤组织分化出胚状体
6 2. 0 0. 5 愈伤组织增殖
7 1. 5 1. 0 较多愈伤组织分化出胚状体
8 1. 5 1. 5 较多愈伤组织分化出胚状体
见 ,在利用 2, 4-D诱导出胚状体后应该将胚状体转
移到其他培养基上进行培养 [9 ] . 2, 4-D对胚状体的
进一步发育有阻碍作用 ,应降低 2, 4-D的浓度 [9 ] .
在配方中逐步降低 2, 4-D的含量 ,发现在 MS
+ 2, 4-D 0. 2 mg /L+ N AA 0. 2 mg /L+ 6-BA 2. 0
mg /L+ AC 0. 8 g /L的培养基上接种胚状体 ,每瓶
4块 ,共 5瓶 ,光照度 2 000 lx . 3周后有 12块有苗
长出 ,诱导率为 60% .新生幼苗见图 1-7.
诱导分化苗必须用分化培养基 M S+ 2, 4-D 1.
5 mg /L + N A A 1. 5 mg /L + 6-BA 2. 0 mg /L+
AC 0. 8 g /L诱导出胚状体后转入 MS+ 2, 4-D 0. 2
mg /L+ N AA 0. 2 mg /L+ 6-BA 2. 0 mg /L+ AC
0. 8 g /L继续培养 , 3周后可长出幼苗 .
2. 4　不同生长调节剂对生根的影响
利用愈伤组织进行生根培养基的筛选试验 ,发
现 MS培养基对根的诱导效果不好 ,而 1 /2 M S培
养基有明显效果 .激素方面 , 2, 4-D能诱导愈伤组织
和胚状体 ,但对生根没有任何作用 .少量的 NAA有
助于根的诱导 ,但当 NAA超过 2 mg /L时会刺激愈
伤组织增殖 . 6-BA宜控制在 2 mg /L左右 .参考同
类木兰科植物的快繁研究 [3, 5～ 7 ] ,多次试验后发现在
1 /2 M S+ N AA 0～ 1 mg /L+ 6-BA 1. 5～ 2. 0 mg /L
+ AC 0. 8 g /L的培养基上 ,已分化出幼苗的愈伤
组织能在一周左右长出比较健壮的根 (图 1-8) ,多
次试验诱导率在 50% ～ 60% .
480 湖南农业大学学报 (自然科学版 ) 2003年 12月　
1.花托 ; 2.雄蕊 ; 3.叶芽 ; 4.花被 ; 5.幼叶 ; 6.胚状体 ; 7.新生幼苗 ; 8.生根幼苗
图 1　广玉兰不同外植体的筛选及愈伤组织的分化
Fig . 1　The fil tration of different explants of Magnolia grandiflora and the di fferentiation of callus
3　讨　论
在愈伤组织的诱导中发现 ,由于广玉兰是六倍
体乔木 ,染色体数目为 114条 [2 ] ,因此在培养中膨大
十分惊人 ,长度可由 0. 5 cm膨大到 2 cm ,体积大约
可以膨大 10倍 ,当外植体切成 0. 5 cm长、 0. 2 cm
宽 ,每瓶接种数在 6个以内时 ,培养效果很好 .若大
于这个范围 ,外植体膨大占满三角瓶 ,无处生长 .
以当年新生叶芽为外植体 ,激素在较大范围内
都能快速、高效地诱导出愈伤组织 .经过对激素用量
的筛选比较发现 ,在 MS+ 2, 4-D 3. 5～ 5 mg /L+
N A A 3. 0～ 5. 0 mg /L+ 6-BA 0. 8～ 1. 2 mg /L的培
养基上 ,愈伤组织生长速率快、量多 ,诱导率接近
100% .其中又以 MS+ 2, 4-D 4. 5mg /L+ N AA 3. 0
mg /L + 6-BA 1. 2 mg /L对广玉兰的愈伤组织诱导
速率最快 .
广玉兰含有大量的挥发油、生物碱、萜类物质和
多酚类物质 ,这些物质极易氧化引起褐化 .因此 ,在
诱导愈伤组织的过程中 ,褐化问题十分严重 ,大约达
到 50% .有研究发现 ,在培养基中加入抗褐化物质
AC,但 AC用量若过多则会阻碍愈伤组织的生长 ,
所以必须对 AC的用量进行测试 [10 ] .本试验发现当
AC用量在 0. 8 g /L的时候效果较好 .
由愈伤组织诱导胚状体的效率仍然比较高 , 2
周后诱导率可以达到 70% .但是从胚状体分化成苗
的过程难度很大 ,效率较低 ,常有胚状体不能启动的
现象 ,这方面技术还不成熟 ,有待进一步研究 .生根
培养技术已经较成熟 ,虽然有文献报道木兰科植物
生根困难 [ 7] ,但在本试验中生根效率和根的质量较
好 .由上所述 ,通过本试验 ,已初步建立广玉兰离体
培养和植株再生的繁殖体系 ,不仅为下一步外源基
因的导入奠定了基础 ,而且可为其他木兰科植物的
愈伤组织诱导和植株再生提供参考 .
参考文献:
[ 1]　刘玉壶 .中国植物志: 第 30卷第 1分册 [ M ].北京: 科
学出版社 , 1996.
[ 2]　孟庆武 ,刘　金 .夏季花卉 [ M ].北京: 中国农业出版
社 , 2000.
[ 3]　褚建民 ,周凌娟 ,王　阳 ,等 .白玉兰离体培养和快速繁
殖 [ J].防护林科技 , 2002, ( 4): 29-31.
[ 4]　王　琪 ,王 之 ,李映丽 .荷花玉兰组织培养的研究
[ J].西北药学杂志 , 2001, 16( 1): 11-13.
[ 5]　陈金慧 ,施季森 ,诸葛强 .杂交鹅掌楸的不定芽诱导及
植株再生 [ J].植物生理学通讯 , 2002, 38( 5): 459.
[ 6]　周丽华 ,许冲勇 ,曾　雷 ,等 .紫玉兰组织培养繁殖研究
[ J].经济林研究 , 2002, ( 4): 37-38.
[ 7]　曾宋军 ,彭晓明 ,曾庆文 . 深山含笑的组织培养和快速
繁殖 [ J].热带亚热带植物学报 , 2000, 8( 3): 264-268.
[ 8]　周维燕 .植物细胞工程原理与技术 [ M ].北京: 中国农
业大学出版社 , 2001.
[ 9]　金晓玲 ,何　平 .乔木树种体细胞胚胎发生 [ J].林业科
学研究 , 2003, 16( 3): 343-350.
[ 10 ]　吴晓霞 ,陈　刚 ,张　彪 ,等 .植物组织培养中褐变的
研究 [ J].河北林果研究 , 2002, 17( 3): 284-288.
481　第 29卷第 6期 谭泽芳等　广玉兰的离体培养研究