全 文 ：黄瓜霜霉菌ITS区序列分析反应体系的构建及优化
蔡 宁,张艳菊,秦智伟*,周秀艳,刘艳玲
(东北农业大学园艺学院,哈尔滨 150030)
摘 要:文章以黄瓜霜霉菌为材料,采用改良的 CTAB方法提取基因组 DNA,研究了黄瓜霜霉菌 ITS区序列
分析中 PCR反应体系的各主要成分对检测结果的影响,确立了适宜的退火温度和反应体系。优化后的反应体系
(25!L)为:采用引物ITS1/ITS4各40ng, 60ngDNA模板,2.5mmol·L-1Mg2+2.0!L,2.5mmol·L-1dNTP1.5!L,
Taq酶 1U。优化的 PCR扩增程序为:94℃预变性 3min,94℃50s,52.2℃40s,72℃1.5min。在这一条件下
运行35个循环;72℃延伸7min。采用此反应体系和扩增程序,对采自黑龙江省不同地区的31份黄瓜霜霉菌基因
组DNA进行PCR扩增,均可得到一条约为900bp的条带。
关键词:黄瓜霜霉病菌;ITS区序列分析;反应体系;优化
中图分类号:S436.421 文献标识码:A
收稿日期:2008-03-25
基金项目:国家“863”项目(2006AA10Z1B9);黑龙江省教育厅科
技项目(11511038);黑龙江省博士后基金(LBH-Z06158);黑龙江
省自然科学基金(C2007-34);东北农业大学创新团队(CXT002-
1-2)
作者简介:蔡宁(1983-),女,河南人,硕士研究生,研究方
向为黄瓜抗病育种。
*通讯作者 E-mail:zwqin727@163.com
由鞭毛菌亚门古巴假霜霉菌[Pseudoperonospora
cubensis(Berk.&M.A.Curtis)Rostovzev]侵染引起的
黄瓜霜霉病是黄瓜生产中发生最广、造成损失最
严重的病害[1-2]。P.cubensis是一种活体营养专性寄
生菌,无法人工培养,这在一定程度上影响了对
该病菌生理分化、群体遗传等方面的深入研究。
近年来,随着分子生物学的发展,DNA水平
的分子标记在病原菌生理小种鉴定及群体遗传等
方面得到广泛应用。其中核糖体 DNA转录间隔区
(InternalTranscribedSpacer,ITS)序列分析作为一
种分子生物学手段,已广泛应用于植物、动物、
真菌及细菌在物种属内、近缘属间以及科内等低
阶元系统发育与分类鉴定问题的研究。大量的研
究表明它可以提供详尽的、系统学分析所需的可
遗传性状。尤其在真菌方面,ITS序列分析技术快
速、简便和高特异性已在众多的研究手段中显示
出了极大的优势。因而不少学者应用ITS序列分析
方法来研究 Verticilium、Phytophthora、Tiletia等
真菌的系统发育[3-11]。但利用核酸分子标记技术对
黄瓜霜霉菌亲缘关系及生理小种分化方面的研究国
内外报道较少。
本文以黄瓜霜霉病菌为材料,探讨适合黄瓜霜
霉病基因组ITS区序列分析的技术体系,为进行黄
瓜霜霉菌ITS碱基序列的多态性研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试 31个黄瓜霜霉病菌株分别采自黑龙江省
哈尔滨市、齐齐哈尔市、牡丹江市、佳木斯市、
大庆市、黑河市及大兴安岭地区的加格达奇和漠
河县(见表1)。病叶采集后,用蒸馏水冲洗2~3次
保湿培养,待长出新的浓密菌层后,用灭菌毛刷
把霜霉病菌刷入 95%乙醇,4℃保存以供 DNA提
取。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取与定量
基因组 DNA的提取采用王关林植物基因组
DNA提取的CTAB法并稍加改进[12]。取保存于95%
乙醇中的黄瓜霜霉菌离心,去上清;称取菌丝与
孢子囊的混合物 100mg,加液氮迅速研磨,反复
数次;移入1.5mL离心管后,加入700!L65℃预
热的2×CTAB提取缓冲液,充分混匀,65℃水浴
保温30min;加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),4℃
第39卷 第8期 东 北 农 业 大 学 学 报 39(8):25~30
2008年 8月 JournalofNortheastAgriculturalUniversity Aug.2008
文章编号 1005-9369(2008)08-0025-06
12000r·min-1,离心15min。将上清液转入另一离
心管中,加入 60!L65℃预热的 10%CTAB混匀,
加入等体积氯仿/异戊醇,颠倒混匀,4℃12000
r·min-1,离心10min,并重复1次;取上清液,转
入新的离心管中,加入等体积约 700L4℃预冷
的异丙醇沉淀缓冲液混匀,室温下放置30min;4℃
12000r·min-1,离心 10min,弃上清液,用 70%
乙醇洗涤 2~3次,室温干燥,每管加 25#LTE,
室温下溶解;DNA浓度和纯度检测使用 SMA3000
紫外分光光度计,稀释后放于-20℃保存备用。
表 1 用于ITS区序列分析的黄瓜霜霉菌样品
Table1 SampleofPseudoperonosporacubensisforstudyingrDNAITS
编号
No.
17
31
采集时间(年)
Yearofcolection
2006
2006
2006
编号
No.
1
15
16
来源地
Locality
哈尔滨
牡丹江
佳木斯
1820062 哈尔滨
14 牡丹江 2006 30
13 牡丹江 2006 29
12 齐齐哈尔 2006 28
11 齐齐哈尔 2006 27
10 齐齐哈尔 2006 26
9 齐齐哈尔 2006 25
8 齐齐哈尔 2006 24
7 哈尔滨 2006 23
6 哈尔滨 2006 22
5 哈尔滨 2006 21
4 哈尔滨 2006 20
3 哈尔滨 2006 19
来源地
Locality
佳木斯
漠河
大庆
牡丹江
哈尔滨
哈尔滨
加格达奇
加格达奇
黑河
黑河
黑河
黑河
黑河
大庆
大庆
采集时间(年)
Yearofcolection
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2007
2007
2007
2007
1.2.2 引物筛选
供筛选引物有两对,即通用引物 ITS1/ITS4和
ITS5/ITS4,由上海生物工程公司合成。ITS1、ITS4
和ITS5序列分别为:
ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′
ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′
ITS5:5′-GGAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′
随机抽取样品 1、样品 10和样品 16作为模
板,对两对引物进行筛选。
1.2.3 ITS反应程序及体系优化
ITS反应程序参考文献[13]的方法,扩增程序
为:94℃预变性 3min,94℃50s,51.2℃40s,
72℃1.5min条件下运行35个循环;最后72℃延伸
7min。退火温度设 9个梯度:50.6、51.1、51.6、
52.2、52.7、53.2、53.7、54.0、54.2℃。扩增产物在
1.5%琼脂糖凝胶 1×TAE缓冲液中电泳分析,EB
染色后用凝胶成像系统分析。
采用 25$L反应体系,对 Mg2+、dNTP、Taq
DNA聚合酶及DNA模板浓度采用单因素试验进行
了优化。模板DNA浓度设10个梯度,分别为10、
20、30、40、50、60、70、80、90、100ng;Mg2+(2.5
mmol·L-1)浓度设 6个梯度,分别为 0.5、1.0、1.2、
1.5、2.0、2.5%L;dNTP(2.5mmol·L-1)浓度设 6个
梯度,分别为 0.5、1.0、1.2、1.5、2.0、3.0&L;
TaqDNA聚合酶设 6个梯度为 0.5、1.0、1.5、2.0、
2.5、3.0U。
2 结果与分析
2.1 引物筛选
采用 ITS1/ITS4和 ITS5/ITS4两对引物进行 ITS
扩增,结果见图1。引物 ITS1/ITS4明显优于 ITS5/
ITS4,因此选用引物ITS1/ITS4。
·26· 东 北 农 业 大 学 学 报 第39卷
2.2 模板DNA浓度对ITS区扩增的影响
模板DNA的含量是制约PCR扩增产量和特异
性的一个重要因素,尽管其适宜范围较宽,一般
为 20~300ng,但是不同的生物,甚至同一种生物
不同的实验室所使用的模板 DNA浓度都不尽相
同。为了获得理想的扩增结果,避免谱带的减少
和非特异性条带的出现,本试验采用25!L反应体
系,共设 10、20、30、40、50、60、70、80、90、
100ng10个浓度梯度。PCR结果见图2。在50~90ng
范围内,不同的模板DNA浓度均能产生目的条带,
但是不同的模板 DNA浓度产生的条带清晰程度有
差别,以60ng时目的条带最清晰,且与非特异性
条带的差别最明显。低于或高于此浓度时,目的条
带的清晰程度均降低,且与非特异性条带的差别均
减小,因此在25L反应体系中加入60ng的模板
DNA量为最佳。
2.3 Mg2+浓度对ITS区扩增的影响
Mg2+浓度是影响 PCR结果的重要变量之一。
TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶,对Mg2+浓度非常
敏感。同时引物与模板的双链杂交体的解链与退火
温度受二价阳离子的影响,特别是其中的Mg2+浓度
能影响反应的特异性和扩增片段的产率。选择合适
的Mg2+浓度,对PCR反应至关重要。由图3可见,
25#L反应体系中2.0$L2.5mmol·L-1Mg2+浓度为最
佳。TaKaRaExTaqDRR001A所配置 10×ExTaq
Bufer(Mg2+Plus)中Mg2+为2.5mmol·L-1,因此本试验
选用TaKaRaExTaqDRR001A,可使反应体系得以
简化。
图1 引物对ITS区扩增的影响
Fig.1 EfectsofprimersonITSsequencePCRreaction
M-DL2000Marker;1~3-引物ITS1/ITS4,模板分别为
1、10、16;4~6-引物ITS5/ITS4,模板分别为1、10、16
M-DL2000Marker;1-3-PrimersITS1/ITS4,template
1,10,16;4-6-PrimersITS5/ITS4,template1,10,16
M 12 3456
2000bp
1000bp
750bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2000bp
1000bp
750bp
图2 模板浓度对ITS区扩增的影响
Fig.2 EfectsoftemplateconcentrationonITSsequencePCRreaction
M-DL2000Marker;1~10-模板DNA浓度10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng
M-DL2000Marker;1-10-Templateconcentration:10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ng
M 1 2 3 4 5 6
2000bp
1000bp
750bp
图3 Mg2+浓度对ITS区扩增的影响
Fig.3 EfectsofMg2+concentrationonITSsequencePCRreaction
M-DL2000Marker;1~6-Mg2+浓度:0.5、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5!L
M-DL2000Marker;1-6-Mg2+concentration:0.5,1.0,1.2,1.5,2.0,2.5!L
蔡 宁等:黄瓜霜霉菌ITS区序列分析反应体系的构建及优化第8期 ·27·
2.4 dNTP浓度对ITS区扩增的影响
dNTP为PCR中TaqDNA聚合酶提供底物,使
得产物得以延伸。底物 dNTP浓度过高,会导致
聚合酶错误的掺入;浓度过低,又会影响合成效
率,甚至会因为 dNTP过早消耗而使产物单链化,
从而影响扩增效果。试验结果在25!L反应体系中
1.5LdNTP(2.5mmol·L-1)量为最佳。
结果见图4。
2.5 TaqDNA聚合酶浓度对ITS区扩增的影响
Taq酶的使用量也是影响试验的一个重要因
素。Taq酶浓度过高不仅会使试验成本过高,而且
容易产生非特异性扩增产物;Taq酶浓度过低则会
导致产物的合成效率下降。一般PCR反应中,Taq
酶的用量在 0.2~1.0U之间。本试验结果表明,在
25#L体系中Taq酶含量为1U时扩增反应效果最
佳,结果见图5。
2.6 退火温度对ITS区扩增的影响
退火温度过低会造成引物和模板 DNA之间的
错配,产生非特异性产物;退火温度提高会提高产
物的特异性,但过高会阻碍引物和模板 DNA之间
的配对,减少产物的产量。本试验设置9种不同的
退火温度,结果见图6,在25$L反应体系中退火
温度为52.2℃时效果最好。
2.7 31个黄瓜霜霉病菌株ITS区扩增结果
通过上述体系优化,获得黄瓜霜霉菌ITS序列
分析的优化体系,采用此体系对采自黑龙江省不同
地区的 31份黄瓜霜霉菌基因组 DNA进行 PCR扩
增,31个菌株均可得到一条约为 900bp的条带,
结果见图7。
图4 dNTP浓度对ITS区扩增的影响
Fig.4 EfectsofdNTPconcentrationonITS
sequencePCRreaction
M-DL2000Marker;
1~6-dNTP浓度:0.5、1.0、1.2、1.5、2.0、3.0!L
M-DL2000Marker;
1-6-dNTPconcentration:0.5,1.0,1.2,1.5,2.0,3.0!L
M 1 2 3 4 5 6
2000bp
1000bp
750bp
图5 Taq酶浓度对ITS区扩增的影响
Fig.5 EfectsofTaqpolymeraseconcentrationonITS
sequencePCRreaction
M-DL2000Marker;
1~6-Taq酶浓度:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0U
M-DL2000Marker;
1-6-Taqpolymeraseoncentration:0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0U
M 1 2 3 4 5 6 M
2000bp
1000bp
750bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
2000bp
1000bp
750bp
图6 退火温度对ITS区扩增的影响
Fig.6 EfectsofannealingtemperatureonITSsequencePCRreaction
M-DL2000Marker;1~9-退火温度:50.6、51.1、51.6、52.2、52.7、53.2、53.7、54.0、54.2℃
M-DL2000Marker;1-9-Annealingtemperature:50.6,51.1,51.6,52.2,52.7,53.2,53.7,54.0,54.2℃
·28· 东 北 农 业 大 学 学 报 第39卷
3 讨 论
黄瓜霜霉菌为专性寄生菌,鉴于这一特点,其
研究工作颇具难度,而黄瓜霜霉病的严重危害使对
其病菌及黄瓜抗病育种的研究迫在眉睫。ITS区序
列分析方法作为一种研究系统发育的有效手段,虽
已在真菌病理学领域得到了广泛应用,但在黄瓜霜
霉病菌方面的研究国内尚未见报道。
本试验尝试把ITS区序列分析方法引入黄瓜霜
霉病的研究领域中来,试验表明,这一思路具有可
行性。由于 ITS反应体系和程序涉及 PCR反应过
程中的变性、退火、延伸的温度和时间以及循环数
的变化,同时反应混合物中各种试剂的来源和浓度
等诸多因素的不确定性,这些因素都会对其结果产
生影响。因此,构建同一物种在相同仪器设备和一
定操作规范下的最优化技术体系是ITS研究成功的
关键。本试验涵盖了从样品采集到ITS区序列分析
方法反应体系优化过程的基本操作技术,尤其是确
立了黄瓜霜霉病菌基因组提取方法和ITS区序列分
析方法反应体系,即在25!LPCR反应体系中,加
入60ng黄瓜霜霉病菌基因组DNA,引物ITS1/ITS4
各 40ng,Mg2+(2.5mmol·L-1)用量为 2.0L,dNTP
(2.5mmol·L-1)用量为 1.5#L,Taq酶用量为 1U。
希望能为进一步的黄瓜霜霉菌ITS区序列分析及遗
传多样性和生理分化研究提供参考。
[ 参 考 文 献 ]
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图7 31个黄瓜霜霉病菌株ITS区扩增结果
Fig.7 ElectrophoresisresultsofITSregionsof31P.cubensisamplification
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1500bp
1000bp
800bp
M-DNAMarkerE(200~1500bp,with800bpasreference);1~31-为样品1-31
M-DNAMarkerE(200-1500bp,with800bpasreference);1-31-Sample1-31
M 17 18 19 20 20 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
1500bp
1000bp
800bp
蔡 宁等:黄瓜霜霉菌ITS区序列分析反应体系的构建及优化第8期 ·29·
EstablishmentandoptimizationofPCRreactionsystemfor
rDNAITSofPseudoperonosporacubensis
CAINing,ZHANGYanju,QINZhiwei,ZHOUXiuyan,LIUYanling
(ColegeofHorticulture,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)
Abstract:GenomicDNAofPseudoperonosporacubensiswasextractedbytheimprovedCTABmethod,
efectsofmajorcomponentsofPCRamplificationonITSdetectionresultswerestudiedandtheoptimalreaction
systemwasestablished.TheoptimalPCRamplificationsystemwas:40ngeachITSuniversalprimersITS1and
ITS4,60ngDNAtemplate,2.0!L2.5mmol·L-1Mg2+,1.5!L2.5mmol·L-1 eachdNTP,1UTaqpolymerase.The
optimizedPCRcyclesstartedat94℃3min,folowedby35cyclesof25sat94℃,40sat52.2℃and1.5minat
72℃,andthenextended7minat72℃.Usingtheestablishedsystem,althe31genomicDNAsamplescould
obtainanapproximate900bpband,whichcolectedfromdiferentregionsofHeilongjiangProvince.
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·30· 东 北 农 业 大 学 学 报 第39卷