全 文 ：第 28卷　第 3期 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Vol. 28　 No. 3
　 2008年 6月 Journal o f Central South Univ er sity o f Fo rest ry& Techno log y Jun. 2008　
文章编号: 1673- 923X ( 2008) 03- 0045- 04
4种不同广玉兰基因组 DNA提取方法的比较
陈永华1 ,相　阳 2 ,张冬林 1, 3 ,李志辉 1 ,陈亮明 1 ,彭　婧 1 ,马　倩 1
( 1.中南林业科技大学资源与环境学院 ,湖南长沙 410004;
2.山东省济宁市园林管理局科研所 ,山东 济宁 272100;
3.美国缅因大学 , Maine, USA)
摘　要: 　采用常规 CT AB法、常规 SDS法、改良 CTAB法、改良 SDS法 4种方法对广玉兰 ( Magnolia g randi f lora )叶片基因组 DNA
的提取进行比较 ,并进行 ISSR-PCR检测 ,结果表明:改良的 CT AB法提取的基因组 DNA效果比常规 CT AB法、常规和改良 SDS法都
好 ,提取 DN A的浓度和纯度高 ,无蛋白质和 RN A等杂质影响 ,并且可以很好的应用于 IS SR分子标记分析 , IS SR-PCR反应体系中模
板 DN A的最佳浓度是 30 ng /20μL.
关键词: 　生物工程与技术 ;广玉兰 ;基因组 DN A提取 ;方法
中图分类号: 　 Q78; S792　　　　　文献标志码:　 A
Comparison of 4 Different Extraction Methods for Magnolia grand if lora DNA
CHEN Yong-hua
1 , XIANG Yang
2 , ZHANG Dong-lin
1, 3 , L I Zhi-hui
1 ,
CHEN Liang-ming
1 , PEN G Jing
1 , M A Qian
1
( 1. School of Resou rces and Environm en t, Cen t ral Sou th Univ ersi ty of Fores t ry and Tech nology, Ch angsha 410004, Hunan, China;
2. Research Agency Jining Gard en Adminis t ration of Sh and ong, Jining 272100, Sh and ong, China;
3. Maine State Universi ty, Maine, U SA)
Abstract: Magnol ia g rand if lora DN A w as is olated using four ext ract ion m ethods. Th ey are t radi tional C TAB method, improved
C TAB m ethod, t radi tional SDS m ethod and improved SDS method. Th e resul t s indicate that imp roved C TAB DN A ex t raction
produces DN A of much bet ter qualit y th an th e oth ers , which h as high er d ensi ty and puri ty, no protein and no such impuri ti es as RN A
and can b e w ell applied to th e analysis of IS SR molecular mark ers; and th at th e op timal DN A densi ty in th e ISSR-PCR reacting
sys tem is 30 ng /20μL.
Key words: bioengineering; Magnol ia g randi f lora ; gen omic DN A ex t raction; meth ods
广玉兰 Magnol ia grandif lora,别名洋玉兰、大花玉兰、玉兰 ,属木兰科木兰属 ,为优良的园林观赏树种 .该
属原产北美东南部 ,在我国长江流域以南有大量栽培 .广玉兰用途广泛 ,是理想的观赏树及行道树种 ,在材用、
庭园绿化、香料、药用等方面具有很大的发展潜力 .目前 ,关于广玉兰的研究主要集中在育种 [1 ]、繁殖 [ 2]、细胞
学 [3 ]、离体培养和植株再生的繁殖体系 [4, 5 ]等方面 .另一个研究热点就是对广玉兰的景观价值的研究 [ 6] ,而对于
其分子生物学方面的研究尚属空白 .
在 广玉兰叶片 DNA提取预备实验中我们发现材料易褐化 ,提取出来的 DNA呈褐色 ,说明叶片里含有大
收稿日期: 2007-11-12
基金项目: 湖南省“芙蓉学者”专项基金 ( 0595) ,中南林业科技大学引进人才基金项目 ( 06Y035) .
作者简介: 陈永华 ( 1977- ) ,男 ,湖南攸县人 . 讲师 ,博士后 ,主要从事观赏植物的育种与湿地植物应用研究 .
通讯作者: 张冬林 ( 1968- ) ,系美国缅因大学终身教授 ,美国缅因大学 , M ain e, U SA.
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1673 -923x . 2008. 03. 019
量色素及酚类物质 ,这样的 DNA无论是作为酶切的底物还是作为 PCR的模板 ,均难获得满意的结果 .因此 ,我
们对提取 DNA方法进行了比较优化 ,分别采用常规 CTAB法、常规 SDS法、改良 CTAB法、改良 SDS法等 4种
方法比较研究广玉兰叶片 DNA提取的效果 ,为今后广玉兰地理种源的群体遗传多样性研究及开发利用提供基
础 .
1　材料与方法
1. 1　材　料
2007年 4月到湖南省长沙林科院天际岭林场 ,采集广玉兰幼嫩叶片 , - 20℃低温保存备用 .
1. 2　主要试剂
用于 ISSR-PCR反应的 dN T P、 Taq酶、 Mg2+ 购自 TaKaRa公司 ,标准分子量 ( 100 bp M arker ) 购自
T INGEN公司 ,引物参照加拿大哥伦比亚大学 ( UBC)提供的 ISSR引物序列 [7 ] , Inv ert rig en公司合成 .试验于
中南林业科技大学森林培育“芙蓉学者”实验室完成 .
1. 3　方　法
1. 3. 1　基因组 DNA的提取方法
常规 CT AB和常规 SDS法提取法分别参照 Cla rk [8 ]和 Edw ards[9 ]的方法进行 .改良 CT AB法与常规 CT AB比
较有两点改良:第一 ,将常规 CTAB法中先磨样品后加 CTAB提取液 ,改成先把 CTAB提取液预热后直接加样品 ,
且增加 PV P和 β-巯基乙醇的浓度 ;第二 ,加入了 Tris-酚等体积抽提步骤 .具体步骤: ( 1)在 1. 5 mL EP管中加入
500μL CT AB提取液 ( 70 m L双蒸水、 8. 128 g NaCl、 2 g CTAB干粉、 2 g PV P-40 000, 10 mL 1 mol /L的 Tris-
HCl、 4 m L 0. 5 mol /L的 EDTA,定溶至 100 mL)和 20μLβ -巯基乙醇放在 65℃水浴锅中预热; ( 2)称叶片 0. 2 g ,
加入液氮研磨成粉末 ,迅速加入到已预热的 1. 5 mL EP管的溶液中 ,充分混合 ; ( 3)保存在 65℃水浴30～ 40 min,
每隔 15 min混合一次 ; ( 4)加入 400μL K Ac( 4 mo l /L) ,混匀 ,冰浴 30 min; ( 5)以 14 000 r· min- 1 ,离心 10 min,
取上清加入等体积 Tris饱和酚抽提 ; ( 6)加入等体积氯仿 /异戊醇 ( 24∶ 1) ,混匀 ,在 14 000 r· min- 1、 4℃条件下
离心 15 min.重复第 6步 ; ( 7)加入在- 20℃预冷的异戊醇 500μL,混合之后置于 - 20℃冰箱中 1 h; ( 8)在 14 000 r
· min- 1、 4℃条件下离心20 min; ( 9)移去上清液 ,用80%乙醇洗涤 ,离心 ,吹 10～ 15 min; ( 10)加入50μL TE溶液
溶解 ,加入 2μL的 Rnase,在 37℃水浴锅中放置 30 min; ( 11) - 20℃保存 .
改良 SDS法与常规 SDS法比较有三点改良: 第一 ,将常规 SDS法中先磨样品后加 SDS提取液中;改成先把
SDS提取液预热后直接加样品 ;第二 ,在 SDS提取缓冲液中加入适量 PV P;第三 ,加入了 Tris-酚等体积抽提步骤 .
具体步骤: ( 1)在 1. 5 mL EP管中加入 900μL提取液和 100μL 10% SDS, 65℃预热; ( 2)称叶片 0. 2 g ,加入液氮
研磨成粉末 ,装入已预热的 EP管中 , 65℃ , 10～ 15 min间隔晃动 2～ 3次 ; ( 3)加入 160μL KAc,混匀 ,冰浴 30
min; ( 5) 4℃ , 12 000 r· min- 1 , 15 min,取上清 , T ris饱和酚等体积抽提 . ( 6)取上清液放入一新的 EP管中 ,加入
等体积氯仿 /异戊醇 ( 24∶ 1) ,混匀 ,于 4℃、 r· min- 1下 , 10 min;重复第 6步 ; ( 7)取上清液移入另一 EP管中 ,加入
2 /3体积在- 20℃预冷的异戊醇 ,放置 30 min; ( 8) 4℃ , 8 000 r· min- 1 , 10 min; ( 9)移去上清液 , 80%乙醇洗涤 ,
离心 ,吹 10～ 15 min; ( 10)加入 50μL T E溶解 ,加入 2μL RNase, 37℃ , 30 min. ( 11) - 20℃保存 .
1. 3. 2　基因组 DNA的检查
用 GenQuan TM pro DN A /RN A紫外分光光度计测定 DNA样品在波长 260 nm和 280 nm处的光吸收值 ,
由 A260 /A280比值判断样品的大致纯度 .取 4μL样品 用 0. 8% 琼脂糖凝胶电泳检测质量 .
1. 3. 3　基因组 DNA样品质量的 ISSR-PCR检测
为了检验我们提取的 DNA样品 PCR扩增的效果 ,选用一个 ISSR引物序列为 ( CA) 8AG.反应体系: 在 20
μL 的反应体系中 , TaqDN A聚合酶 1. 0 U, Mg2+ 1. 5 mmol· L- 1 , dN TP 1. 80 mmo l· L- 1 ,引物
0. 5μmol· L- 1 , DN A采用 0、 6、 15、 24、 30、 36、 45、 54、 60 ng 9个梯度 .参考冯富娟等 [10 ]人的 ISSR-PCR反应程
序: 94℃预变性 5 min, 94℃变性 30 s, 56℃退火 45 s, 72℃延伸 2 min,循环 35次 , 72℃延伸 7 min, 4℃保存 . PCR
产物用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测 .
46 中　南　林　业　科　技　大　学　学　报 第 28卷
2　结果与分析
2. 1　 4种方法提取 DNA的质量检测比较
紫外分光光度计测定波长 260 nm和 280 nm的光吸收值 , A260 /A280比值:常规 CT AB法 1. 67,常规 SDS
法1. 71,改良 CTAB法 1. 81,改良 SDS法 1. 70.其中改良 CTAB法提取的 DNA A260 /A280比值在 1. 80左右 , 数
据 表明所提取的 DNA基本没有蛋白质的污染 , 纯度较高 .而常规 CTAB法和常规 SDS法提得的 DNA溶液
A260 /A280在 1. 66～ 1. 71,说明该法除蛋白质的效果较差 .因此 ,我们采用的改良 CTAB法可以应用到以后的
广玉兰分子方面的研究中 .
M: 100 bp标准分子量 ; 1.常规 CT AB法 ; 2.常规 SDS法 ; 3.改
良 CTAB法 ; 4. 改 良 SDS 法 ; M: 100 bp Marker; 1.
conv ent ional C TAB; 2. conventional SDS; 3. imp roved C TAB;
4. imp roved SDS;
图 1　不同 DNA提取方法的电泳图
Fig. 1　 Electrophoresis for diff erent DNA extractions
1-9: DNA浓度为: 0, 6, 15, 24, 30, 36, 45, 54, 60 ng /20μL.
DN A of: 0, 6, 15, 24, 30, 36, 45, 54, 60ng /20μL. M: 100 bp标
准分子量 100 bp Marker.
图 2　不同模板 DN A的 ISSR-PCR电泳结果
Fig. 2　 Electrophoresis of ISSR-PCR with dif ferent
concentrat ions of template DNA
2. 2　 4种方法提取 DNA的电泳比较
由图 1可知: 常规 CTAB法和改良 SDS法提取的
DNA样品点样孔有较多残留杂质 ,这说明该 DNA样品
中含有一些的未被去除的多糖或其他杂质 ,常规 SDS法
和改良 CTAB法提取的 DNA样品点样孔杂质很少 ,但是
改良 CT AB法提取的 DNA样品 ,谱带较清晰的效果明显
好于其它方法 ,没有拖尾现象 ,说明 DNA完整性相对较
好 .
2. 3　基因组 DNA样品质量的 ISSR-PCR检测
影响 PCR的主要因素是模板 DNA的浓度.量少导致
产物过少 ,量多则可能增加非特异性产物 DNA中的杂质 .
从图 2中可以看出 ,模板 DNA浓度为 30 ng /20μL时条带
最清晰 ,多态性最好 ,为反应最优水平 ,可以扩增出最多的
条带 ,模板 DNA浓度低于15 ng /20μL没有条带 ,浓度太高
条带不清楚.因此选择30 ng /20μL作为 ISSR-PCR反应体
系中模板 DNA的最佳浓度 .
3　结论与讨论
自 Marmur1961年建立用十二烷基磺酸钠 ( SDS)和
氯仿从细胞中分离提取 DNA样品的经典方法以来 ,研究
者一直在探索能制备高纯度和高完整性的 DNA制品的最
佳方案 .如今常用到的提取方法有 CTAB法、 SDS法和试
剂盒法等 .但是按照广泛应用常规的 CTAB法和常规的
SDS法所提取的广玉兰总 DNA样品都褐化非常严重 ,而
且含有很多大分子物质和杂质 ,我们采用改良的 CTAB
法 ,先把 CT AB提取液预热后直接加磨碎的样品 ,这样减
少 DNA样品暴露在空气中褐化的程度 ,与先把样品加入
EP管在加 CTAB提取液的步骤比较 ,可以大大降低 DNA褐化的程度 ,这与唐玉海 [ 11 ]等在提取茶树叶片 DNA时
进行改良的方法一致 ,由于茶树中富含茶多酚和生物碱等次生物质 , DN A的提取相对比较困难 ,未加预处理液的
样品在提取过程中褐变现象明显 ,而在提取前加入提取预处理液的样品 ,整个提取过程中提取液均保持原来的绿
色 ,无褐变现象发生 ,并且得到的 DNA(经电泳检测显示条带整齐 ,无 RNA或者多糖等杂质污染 .
在广玉兰叶片里含有大量色素及酚类物质 ,因此在改良的方法中必须加入抗氧化剂 β -巯基乙醇和加入一
定量的 PV P,这样可以抑制叶片中酚类物质的氧化 [12 ] .谭晓风等 [13 ]在山茶属植物叶片 DNA提取的研究中 ,发
现采用标准的 CT AB法时抽提液明显变黄 ,认为这可能与山茶属植物叶片含较多酚类等物质有关 ,所以采用改
良的 CT AB法 ,在提取液中加入了抗氧化剂 β -巯基乙醇 .陈析丰等 [14 ]在谭晓风等研究的基础上采用通过在
47第 3期 陈永华等 : 4种不同广玉兰基因组 DN A提取方法的比较
DNA提取液中增加 β -巯基乙醇的量 ( 4% )和加入一定量的 PV P( 2% )后 ,使抽提溶液能保持绿色或黄绿色 ,基
本抑制了山茶花叶片中酚类物质的氧化 .黄桂华等采用 CT AB法改良技术提取木麻黄基因组 DNA,在提取液
中加入 2%β -巯基乙醇防氧化和 2%的 PV P去除酚类等物质 ,获得高质量的基因组 DNA,我们发现在改良的
CT AB法中加入了 Tris-酚等体积抽提步骤 ,能更有效地去处杂质和油脂 ,这与别人的报道一致 [15, 16 ] ,从而得到
高质量的 DNA样品 , DN A呈现白色的絮状沉淀 .可以满足 ISSR-PCR的需求 .
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[本文编校:邱德勇 ]
(上接第 32页 )
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[本文编校:谢荣秀 ]
48 中　南　林　业　科　技　大　学　学　报 第 28卷