全 文 ：食品研究与开发 2008年6月第29卷第6期
基金项目:吉林大学生命科学与技术大学生创新实践基地科技创新实
验基金资助项目(JDCX2006007)
作者简介:安金双(1985-) ,女(满) ,在读本科生,研究方向:生物药物
有效成分的提取及活性研究。
*通讯作者
安金双,王迪,马士淇,杜萌,赵晓雷,滕利荣,王贞佐*
(吉林大学 生命科学学院,吉林 长春130012)
响应面法优化灰树花中多糖超声波
提取工艺的研究
摘 要:通过响应面法分析优化了超声提取灰树花中多糖的工艺条件,并与传统水提法进行了比较分析。结果表明,超
声提取灰树花中多糖的最佳工艺条件为:提取时间 171s,提取功率 352.4W,液料比 47.9∶1(mL∶g),提取率预测值为
14.23%,验证值为14.26%,与预测值的相对误差为0.21%,多糖得率比传统水提法有所提高,且提取时间大大减少。
关键词:响应面法;超声波提取;灰树花多糖
OPTIMIZATIONOFTHEULTRASONICASSISTEDEXTRACTIONCONDITIONSOF
GRIFOLAFRONDOSAPOLYSACCHARIDESUSINGRESPONSESURFACEMETHODOLOGY
ANJin-shuang,WANGDi,MAShi-qi,DUMeng,ZHAOXiao-lei,TENGLi-rong,WANGZhen-zuo*
(CollegeofScience,JilinUniversity,Changchun130012,Jilin,China)
Abstract: The RSAsoftware was used for extraction technologyoftotal polysaccharides in Grifola frondosa by
ultrasonicwave.Ultrasonic wave extractionandtraditionalwaterextractionwere compared.The resultsshowed
that,theperfectconditionsofultrasonicextractionforGrifolafrondosapolysaccharideswereasfollow:extraction
time is 171 s, ultrasonic power is 352.4 Wand ratioofliquid tosolid is 47.9∶1 (mL: g). The predictive be t
polysaccharidesextractionrateis14.23%,theactualextractionrateis14.26%andtherelativeerroris0.21%.
The rate ofthe polysaccharides extraction was higher than the traditional water extraction , and the extracted
timewassignificantlyreduced.
Keywords:responsesurfaceanalysismethodology;Ultrasonicextraction;Grifolafrondosapolysaccharides
灰树花(Grifolafrondosa)是一种食、药兼用的珍
稀真菌,其口味鲜美,营养丰富,含有众多活性物质,在
民间有悠久的食用历史[1]。灰树花多糖因具有抗肿瘤、
抗 HIV病毒、调节免疫、调节内分泌与营养代谢等多
种生物活性而备受菌物学家的关注[2-4],有广阔的开发
价值和应用空间。影响真菌胞内多糖提取率的因素很
多,如提取功率、提取时间及料液比等,必须经过大量
试验进行探索提取的最佳工艺,而大多数提取工艺的
优化采用的为正交试验方案等[5-6],响应曲面法(RSM)优
化多糖提取工艺的研究报道较少[7]。
响应面分析法 (Response Surface Methodology,
RSM) ,将数学与统计学相结合,采用多元二次回归方
法作为函数估计的工具来拟合因素与响应值之间的函
数关系[8],依此可对函数的响应面和等高线进行分析来
寻求最佳工艺参数。
本文在灰树花多糖的提取过程中,以液体深层发
酵获得灰树花菌丝体为原料,将单因素和响应面分析
法应用于超声波提取灰树花多糖,研究了超声提取的
条件及其对提取结果的影响。并与传统水浸提法进行
了比较,为其工艺路线的改造,降低生产成本以及工业
化生产提供一定的理论参考。
1 材料与方法
1.1材料、试剂与设备
灰树花菌种,菌号5.404;
蒽酮,浓硫酸,3,5-二硝基水杨酸,葡萄糖,所有试
剂均为分析纯;
HZQ-F160型全温振荡培养箱:哈尔滨市东联电
子技术开发有限公司,MLS-3750型高压自动灭菌锅:
科学研究
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食品研究与开发2008年6月第29卷第6期
日本 SANYO;超净工作台:苏净集团安泰公司;5810R
型高速冷冻离心机:德国Eppendorf;JY92-Ⅱ超声波细
胞粉碎仪:厦门精密仪器有限公司;UV-3150紫外分光
光度计:日本岛津;BP221S电子天平:德国赛多利斯。
1.2 多糖的测定
1.2.1 总糖的测定
蒽酮-硫酸法[9]。
1.2.2 还原糖的测定
DNS法[10]。
1.2.3 菌丝体多糖提取率的计算
多糖含量=总糖含量-还原糖含量
多糖提取率 (W/W%)=[多糖含量(g)/菌丝体质量
(g)]×l00%
1.3 菌丝体多糖的超声提取方法
液体深层发酵获得灰树花菌丝体,冷冻干燥至恒
重,粉碎,过60目筛。分别称取0.1g菌丝体干粉,按一
定水料比加入一定量去离子水,冰水浴中超声波提取
一定时间。提取液经12000r/min,4℃,离心10min,上
清测定总糖和还原糖的含量。
1.4 菌丝体多糖提取单因子实验
在提取过程中,利用单因素试验对影响多糖提取率
的水料比、超声功率、提取时间3个主要因素进行考察。
1.5 菌丝体多糖提取中心组合实验
在单因素试验的基础上根据 Box-Benhnken的中
心组合实验设计原理,采用响应面法在三因素三水平
上对菌丝体多糖的提取条件进行优化。按最佳提取条
件进行验证实验并考查提取次数对提取率的影响。
2 结果与分析
2.1 超声波提过程中的单因素影响
2.1.1 提取时间对胞内多糖提取率的影响
在水料比40:1,提取功率300W冰水浴中分别超
声提取 60、90、120、150、180、210、240s,然后测定菌丝
体多糖提取率,结果如图1所示。
从结果可以看出,提取时间 180s时多糖得率最
大。提取时间低于180s时多糖得率随着提取时间的
增加而增加,大于180s时多糖得率反而有所降低,估
计是多糖糖链在较长时间超声条件下遭到破坏。这与
大多数多糖提取工艺研究结果一致。
2.1.2 超声功率对胞内多糖提取率的影响
菌丝体干粉按水料比 40∶1加入蒸馏水,分别于
功率 160、200、240、280、320、360、400W下冰水浴中
超声波提取 180s。不同超声功率下胞内多糖得率结
果见图2。
从图2中可以看出,超声功率为320W时胞内多
糖得率最大。其后随着超声功率的增大多糖得率明显
下降,可能是大功率超声使多糖分解的结果。
2.1.3 水料比对胞内多糖提取率的影响
由于多糖等生物大分子物质的溶解度不高,因此,
提取过程中用水量是限制多糖得率的重要因素。菌丝
体干粉分别按水料比 20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1
加入蒸馏水,冰水浴中超声提取180s。胞内多糖得率
结果如图3所示。
从结果可以看出,水料比低于 50∶1时,多糖得率
随着水料比的增加而增加,水料比为50∶1时多糖得率
已经达到极值。因此选择最佳水料比为50∶1。
2.2 响应面分析法对灰树花菌丝体多糖提取工艺的
优化
根据单因素探索的实验结果,以水料比、超声功
科学研究
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食品研究与开发 2008年6月第29卷第6期
率、提取时间3个因素为自变量,菌丝体多糖提取率为
响应值,采用响应面分析法在三因素三水平上对菌丝
体多糖提取过程进行优化,以达到最大限度提取菌丝
体多糖的目的。试验因素与水平设计见表1。
对提取时间X1、超声功率 X2和水料比 X3各水
平进行如下编码:X1=(Z1-180)/30,X2=(Z2-320)/80,
X3=(Z3-50)/10,以 X1,X2,X3为自变量,以多糖提取
率Y为响应值,分析方案及实验结果见表2。
表 2中试验 1~12为析因试验,13~15为中心试
验。15个试验点分为析因点和零点,其中析因点为自变
量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点;零点为区域
的中心点,零点试验重复3次,用以估计试验误差。采
用SASRSREG程序对所得数据进行回归分析,回归分
析结果见表3。
对表中数据进行回归分析,获得灰树花菌丝体多
糖提取率对编码自变量提取时间、超声功率、水料比的
二次多项回归方程:
Y=14.06624-0.24224X1+0.54512X2-0.19584X3-
0.69792X12-0.50692X1X2-0.0673X1X3-0.86781X22+
0.01281X2X3-0.39716X32
回归方程中各变量对响应值影响的显著性由F检
验来判定,P值越小,则相应变量的显著程度越高。由
表3可以看出,方程中X2、X22、X1X2对响应值的影响
最为显著。在各影响因素中,提取功率对多糖提取率的
影响最大。试验因子对响应值不是简单的线性关系,二
次项和交互项与响应值都有很大的关系,说明方程的
拟合是充分的,回归方程也是高度显著的,相关系数
R2为92.33%。同时失拟项也进一步表明回归方程可
以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系,因此
可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。
根据回归分析结果做出相应的响应曲面图及其等
高线图,以确认提取时间、超声功率、水料比三因素对
多糖提取率的影响,结果如图4~6。
从响应面的最高点和等高线可以看出在所选的范
表3 回归分析结果
Table3 Theresultsofregressionanalysis
自由度
DF
1
1
1
1
1
1
1
1
1
9
3
3
3
5
3
2
14
平方和
SS
0.4695
2.3773
0.3068
1.7985
1.0279
0.0181
2.7806
0.0007
0.5824
8.7644
3.1535
4.5642
1.0467
0.7283
0.6823
0.0459
9.4926
均方
MS
0.4695
2.3773
0.30683
1.7985
1.0279
0.0181
2.7806
0.0007
0.5824
0.9738
1.0513
1.5214
0.3489
0.1456
0.2274
0.0229
方差来源
Source
X1
X2
X3
X1X1
X1X2
X1X3
X2X2
X2X3
X3X3
回归Model
线性Linear
平方Quadratic
交互CrossProduct
参差Eror
失拟项Lackoffit
纯误差PureEror
总离差Total
Pr>F
F值
F
3.2234
16.3226
2.1067
12.3488
7.0576
0.1244
19.0921
0.0045
3.9989
6.6864
7.2176
10.4462
2.3955
9.9135
0.132546
0.009921
0.206367
0.017026
0.045067
0.738678
0.007226
0.949088
0.101973
0.024957
0.02889
0.013584
0.184351
0.093011
水平Variablelevels
表1 响应面分析因素与水平
Table1 FactorsandlevelsofRSManalysis
因素
Independent
提取时间(Z1)/sExtractiontime(Z1)/s
超声功率(Z2)/Ultrasonicpower(Z1)/s
水料比(Z3)/mL/gRatioofliquidtosolid(Z3)/(mL/g)
-1
150
240
40
0
180
320
50
1
210
400
60
X1
-1
-1
1
1
0
0
0
0
-1
1
-1
1
0
0
0
X2
-1
1
-1
1
-1
-1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
X3
0
0
0
0
-1
1
-1
1
-1
-1
1
1
0
0
0
多糖提取率/%
Polysaccharidesextractionrate/%
11.77
13.99
12.03
12.22
12.77
11.85
13.72
12.85
12.95
12.88
13.20
12.85
14.24
14.01
13.95
试验号
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
表2 响应面分析方案及实验结果
Table2 TheexperimentdesignandresultsofRSM
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食品研究与开发2008年6月第29卷第6期
表4 灰树花多糖提取中超声波波辅助提取法与水提法效果对比
Table4 Comparisonofultrasonicassistedmethodandwater
methodduringextractionofpolysacccharidesfromGrifolafrondosa
围内存在极值,响应面的最高点同时也是等值线中的
最小椭圆的中心点。图 4表明 X1、X2的交互作用显
著,在所选范围内,X1取不同的编码值时 X2对 Y的
影响表现出不同的规律;同样,X2取不同的编码值时
X1对Y的影响规律也呈一定的变化趋势。从单个因素
对Y值的影响来看,X2的影响显著性要大于 X1。从
图 5可以看出,X1与 X3的交互作用并不显著,它们
对 Y值的影响规律并不会随着另一因素的改变而有
明显变化。同时也可以看出,X3对Y值影响的显著性
要大于X1。图6中X2、X3也表现出与图 5相似的规
律。综合各图,3个因素对Y值的影响以及各因素之间
的交互影响与回归分析结果吻合。SAS工具箱给出了
能够得到最大响应值(Y)的 X1,X2,X3对应的编码值
X1=-0.309,X2=-0.403,X3=-0.214,即在提取时间为
171s,水料比为47.9∶1,提取功率为 352.4W时提取率
有最大值14.23%。
2.3 验证实验
为了检验模型预测的准确性,按最佳提取条件提
取,实验重复3次。3次平行实验的多糖提取率分别为
14.19%,14.18%和 14.40%,平均提取率为 14.26%,
与理论预测值相比相对误差为0.21%,可见该模型能
较好地模拟和预测灰树花菌丝体胞内多糖提取率。
2.4 提取次数对多糖提取率的影响
验证实验提取1次后残渣再按最佳条件提取第 2
次、第3次,测定各次提取液总糖、还原糖含量。结果提
取1、2、3次的多糖提取率分别为14.26%,2.77%,0.85%。
以3次多糖的提取率为100%计,第1次多糖的提取率
为79.75%,第2次为13.14%,第3次为3.31%。尽管
增多提取次数可以增加多糖的提取率,但从经济角度
看并不合算。因此,选择两次提取较合适。
2.5 超声提取法与水浸提法比较
分别采用按响应面法优化得到的最佳超声提取条
件和最优水浸提条件[11]提取灰树花深层发酵菌丝体中
多糖,比较两种方法,结果见表4。
从表4可知,超声波提取法与传统水提法相比,提
取时间缩短98.08%,多糖得率提高5.10%。这是由超
声波所具有的高频特性和生物效应所致。一方面,超声
促使样品中偶极分子旋转而导致弱氢键破裂及离子迁
移,加速了多糖对样品的渗透,并使多糖很快溶解;另
一方面,超声具有生物效应,会引起样品细胞膜破裂,
从而加速了多糖从细胞中的释放。
3 结论
本实验通过单因素实验对影响灰树花菌丝体多糖
提取的主要因素——提取时间、超声功率、水料比进行
了探索,选取中心组合实验的范围和水平,应用响应面
分析法对各因素的最佳水平范围及其交互作用进行了
研究和探讨,建立了影响多糖提取率的二次多项数学
模型,依据回归分析结果知,灰树花菌丝体多糖超声提取
的最佳工艺条件为:提取时间171s,提取功率352.4W,
液料比47.9∶1(mL∶g)。在此条件下,实际提取率14.26%,
与模型理论预测值14.23%的相对误差为0.21%。灰树
花深层发酵菌丝体多糖提取2次的提取率为16.93%。
水料比/(mL/g)
Ratioofliquid
tosolid/(mL/g)
47.9
31.1
提取时间/h
Extraction
time/h
0.048
2.48
多糖得率/%
Polysaccharides
extractionrate/%
14.23
13.54
方法
Method
超声提取法
Ultrasonicassistedextraction
水浸提法
Traditionalwaterextraction
科学研究
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食品研究与开发 2008年6月第29卷第6期
基金项目:国家科技成果重点推广计划(2003EC000171)
作者简介:洪宇波(1982-) ,女(满) ,硕士研究生,研究方向:食品科学。
*通讯作者:张卫明(1957-) ,男,博导。
该方法与传统水提法相比,提取时间缩短98.08%,多
糖得率提高5.10%。实验结果证明,采用响应面分析法
优化灰树花菌丝体多糖的超声波提取工艺条件准确可
靠,具有实际价值。
参考文献:
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取工艺的研究[J].食品科学,2006,27(4):142-147
收稿日期:2008-01-08
洪宇波 1,2,史劲松 2,张卫明 1,2,*,顾龚平 2,史吉平 3,孙达峰 2
(1.南京农业大学 食品学院,江苏 南京210095;2.南京野生植物综合利用研究院,江苏 南京210042;
3.上海天之冠可再生能源有限公司,上海201203)
谷朊蛋白制备ACE抑制肽的酶解工艺优化
摘 要:采用碱性蛋白酶水解小麦谷朊蛋白制备 ACE抑制肽,选取酶解时间、温度、pH和加酶量 4个因素进行中心
组合实验设计,利用响应面法对ACE抑制肽的提取工艺进行优化研究。通过SAS软件对ACE抑制率的二次多项数
学模型解逆矩阵分析表明:在酶解时间为 3h、pH8.5、温度 60℃、加酶量 15mg/g时,酶解产物的 ACE抑制效果最
好,最大抑制率平均为93.82%,与实测值相符。利用优化工艺条件酶解小麦谷朊蛋白制备ACE抑制肽时,其抑制率
比优化前提高40.7%。
关键词:谷朊粉;血管紧张素转换酶;抑制活性;水解度
STUDYANDOPTIMIZATIONTOTHEENZYMOLYSISTECHNOLOGYOFACEINHIBITORY
PEPTIDESFROMWHEATGLUTEN
HONGYu-bo1,2,SHIJin-song,ZHNAGWei-ming1,2*,GUGong-ping2,SHIJi-ping3,SUNDa-feng2
(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,NanjingAgriculturalUniversity, Nanjing 210095,Jiangsu,China;
2.NanjingInstituteforComprehensiveUtilizationofWildPlant,Nanjing210042,Jiangsu,China;
3.ShanghaiTianzhiguanRenewableEnergyCO.,LTD,Shanghai201203,China)
Abstract: AngiotensinIconvertingenzymeInhibitorypeptides (ACEIP)werepreparedfromwheatglutenbya
alkaline proteinase.The effects of hydrolysis time, hydrolysis temperature, pH value and quantity of protease
added the ACE inhibitoryactivityand degree ofhydrolysis ofgluten were studied. Based on these, the experi-
mentofResponseSurfaceAnalysis (RSA)wascarriedoutbytheprogramofStatisticalAnalysisSystem (SAS).
Then a quadratic regression equation relatingof four important factors was obtained. The optimal conditions
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
科学研究
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