全 文 ：收稿日期：２０１２－１２－２６
１）基金项目：哈尔滨市重点攻关项目（２００８ＡＡ６ＡＮ０８７）资助
响应面法优化蓝靛果花色苷分离纯化工艺１）
刘敬华１，王振宇１，２
（１．东北林业大学 林学院，哈尔滨 １５００４０；２．哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨 １５００９０）
摘　要：研究表明，花色苷具有显著的治疗眼疾的效果，常规法用大孔树脂纯化的蓝靛果花色苷纯
度大概在１４％～１８％，很难达到欧盟规定的药用的花色苷纯度需达到２４％以上。实验以Ｘ－５纯化
后的蓝靛果花色苷为原料，以聚酰胺作为层析介质，以纯度和回收率为指标进行单因素实验，在此
基础上，以上样浓度、上样体积、洗脱流速为自变量，花色苷的纯度为响应值，利用Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ
中心组合设计原理及响应面分析法，模拟得到二次回归方程的预测模型，获得层析的最佳条件为：
上样浓度为３．０ｍｇ／ｍＬ，上样体积为２５ｍＬ，径长比为１∶１５，洗脱剂乙醇的浓度为６０％，洗脱剂的
流速为２ｍＬ／ｍｉｎ，在此条件下纯化的花色苷的纯度达到３４．８５％，与模型预测值３４．４７相近，说明
模型具有一定的实际指导意义。这样纯化的蓝靛果花色苷较大孔树脂纯化的花色苷纯度提高１倍
左右，是未纯化的蓝靛果花色苷粗提物的１４倍左右。
关键词：聚酰胺；纯度；蓝靛果；花色苷；响应面法
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ
ｆｒｏｍＬｏｎｉｃｅｒａ　ｅｄｕｌｉｓ　ｂｙ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｍｅｔｈｏｄ
Ｌｉｕ　Ｊｉｎｇｈｕａ。１，Ｗａｎｇ　Ｚｈｅｎｙｕ１
，２
（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００４０；２．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈａｒｂｉｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００９０）
Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈａｔ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ　ｈａｖｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｙｅ　ｄｉｓｅａｓｅ，ｔｈｅ　ａｎ－
ｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｏｎｉｃｅｒａ　ｅｄｕｌｉｓ　ｂｙ　ｍａｃｒｏ－ｐｏｒｏｕｓ　ｒｅｓｉｎ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　１４％－
１８％，ｉｔ　ｉｓ　ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ　ｔｏ　ｒｅａｃｈ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　２４％ｆｏｒ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｓ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　ｎｅｅｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＥＵ　ｒｅｇｕｌａ－
ｔｉｏｎｓ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，Ｌｏｎｉｃｅｒａ　ｅｄｕｌｉｓ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　Ｘ－５ａｓ　ｒａｗ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ｐｏｌｙａｍ－
ｉｄｅ　ａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｍｅｄｉａ，ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｂｙ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ａｓ
ｉｎｄｅｘ；ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅｓｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅ，ｓａｍｐｌｅ　ｖｏｌｕｍｅ，ｅｌｕｔｉｏｎ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ　ａｓ　ｖａｒｉａｂｌｅｓ，
ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｖａｌｕｅ，ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｆｏｒ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｔｈｅ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ｂｙ
ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｇｅｔ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅ　３．０ｍｇ／ｍＬ，ｓａｍｐｌｅ
ｖｏｌｕｍｅ　ｗａｓ　２５ｍＬ，ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｄｉａｍｅｔｅｒ　ｔｏ　ｌｅｎｇｔｈ　ｉｓ　１∶１５，ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｌｕｅｎｔ　ｗａｓ
６０％，ｔｈｅ　ｅｌｕｅｎｔ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ｉｓ　２ｍＬ／ｍｉｎ，ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅｓｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ｒｅａｃｈｅｄ　３４．８５％，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　３４．４７％，ｓｈｏｗｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｈａｓ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉ－
ｃａｎｃｅ．Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｐｕｒｉｔｙ　ｉｓ　ｄｏｕｂｌｅｄ　ｏｆ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｂｙ　ｍｉｃｒｏ－ｐｏｒｏｕｓ　ｒｅｓｉｎ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｂｏｕｔ　１４ｔｉｍｅｓ　ｏｆ
ｕｎｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ；Ｐｕｒｉｔｙ；Ｌｏｎｉｃｅｒａ　ｅｄｕｌｉｓ；Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ；Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄ
　　蓝靛果（Ｌｏｎｉｃｅｒａ　ｅｄｕｌｉｓ）是东北的野生浆果，
资源丰富，营养价值很高，其花色苷具有抗肿瘤［１］、
抗氧化［２］、抗癌［３］及抗疲劳［４］等重要功能，受到国内
外众多学者的关注，一般对于花色苷的纯化采用Ｘ－
５、ＡＢ－８、Ｄ１０１等大孔树脂进行纯化，这样纯化的花
色苷的纯度一般达到１４％～１８％，很难达到欧盟规
６１
第３期（总第１２４期） 中 国 林 副 特 产 Ｎｏ．３（ＧＳＮＯ．１２４）
２０１３年６月 Ｆｏｒｅｓｔ　Ｂｙ－Ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｎｄ　Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ　 Ｊｕｎ．２０１３
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DOI:10.13268/j.cnki.fbsic.2013.03.004
定的２４％以上［５］，因此本实验着眼于提高蓝靛果花
色苷的纯度，以经过Ｘ－５纯化过的蓝靛果花色苷进
一步进行纯化，以期达到更高的纯度。
１　材料与方法
１．１　实验材料与主要仪器
原料为经Ｘ－５树脂纯化过蓝靛果花色苷，实验
室自备，经测量其纯度为１７．１４％；无水乙醇、乙酸
钠、乙酸、氯化钾、盐酸均为分析纯；大孔树脂（ＡＢ－
８，Ｘ－５，Ｄ１０１，ＮＫＡ－９，Ｄ１０１－１）及６０～８０目的聚酰
胺。
ＨＡＮＧＰＩＮＧ　ＦＡ２００４电子分析天平，上海良
平仪器仪表有限公司；ＲＥ－５２Ａ旋转蒸发器，上海亚
荣生化仪器厂；ＴＤＬ－５－Ｗ 离心机，京医用离心机；
ＰＢ－１０精密ｐＨ计，上海熙浩实业有限公司；７２２Ｓ型
紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；
层析柱（规格Ф２０×６００ｍｍ）。
１．２　测定方法
１．２．１　ｐＨ试差法测定花色苷的浓度
对蓝靛果花色苷进行光谱扫描发现，其最大吸
收波长为５３１ｎｍ，研究发现［６］蓝靛果中８３％的色素
是矢车菊３－葡萄糖苷，此花色苷的最大吸收波长为
５１０ｎｍ，并且ｐＨ 试差法是以矢车菊花色苷为标准
物质计算的，因此我们选用花色苷的主测定波长为
５１０ｎｍ
原理：花色苷发色团随ｐＨ值变化，而对花色苷
颜色有干扰作用的褐色降解物则不随ｐＨ 值变化。
利用花色苷及黄酮的结构特性，ｐＨ值１．０时，二者
在５１０ｎｍ处都有最大吸收峰；ｐＨ值４．５时，花色苷
因为会转变为无色查尔酮形式，故在５１０ｎｍ处无吸
收，而黄酮仍会有吸收峰［７－１０］。
１．２．２　缓冲液的配制
ｐＨ４．５的缓冲液的制备：准确称取１．６４ｇ乙酸
钠用蒸馏水定容１００ｍＬ，用乙酸调ｐＨ（４．５±０．１）。
ｐＨ１．０的缓冲液的制备：准确称取１．４９ｇＫＣｌ
用蒸馏水定容至１００ｍＬ。准确量取１．７ｍＬ盐酸用
蒸馏水定容至１００ｍＬ，配制成０．２ｍｏＬ／Ｌ盐酸溶
液，将ＫＣＩ溶液与盐酸溶液以２５∶６７的比例混合。
用 ＨＣＩ溶液调ｐＨ（１．０±０．１）。
１．２．３　ｐＨ试差法的测定过程
将样品稀释至一定浓度，取稀释后样品１ｍＬ，
加入ｐＨ值为１．０、４．５的缓冲溶液９ｍＬ，室温下，以
蒸馏水为空白，于５１０ｎｍ下和７００ｎｍ波长下测定
其吸光度，计算其浓度。
稀释后样品的吸光度ΔＡ按下式计算：
ΔＡ＝（Ａ５１０－Ａ７００）ｐＨ１．０－（Ａ５１０－Ａ７００）ｐＨ４．５
花色苷含量按下式计算：
花色苷含量（ｍｇ／ｍＬ）＝（ΔＡ×Ｍｗ×ＤＦ）／（ε
×Ｌ）
式中：ΔＡ－吸光度；Ｍｗ－矢车菊３－葡萄糖苷的相对分
子质量，４４９．２；ＤＦ－样品的稀释倍数（初始稀释倍数×缓冲
液的稀释倍数）；ε－矢车菊３－葡萄糖苷的摩尔消光系数，
２６９００ｍｏｌ－１；Ｌ－比色皿光程（一般为１ｃｍ）。
将花色苷溶液倒入培养皿中，在４０℃下烘干，
用万分之一电子天平取１２～１４ｍｇ，用６０％的乙醇
溶液定容于５０ｍＬ容量瓶中，按下式计算其纯度：
纯度（％）＝［（Ｃ×Ｖ）／ｍ］×１００％
式中：Ｃ－花色苷的含量，ｍｇ／ｍＬ；Ｖ－花色苷的体积，
ｍＬ；ｍ－花色苷干物质的质量，ｍｇ。
１．３　实验方法
１．３．１　树脂的筛选
将处理好的７种大孔树脂 ＡＢ－８、Ｘ－５、Ｄ１０１、
Ｄ１０１－１、ＮＫＡ－９、Ｄ３５２０、聚酰胺分别装入层析柱中，
径长比１∶２０，上样浓度为２．６４ｍｇ／ｍＬ，上样体积
为１０ｍＬ，用２ＢＶ 的７０％的乙醇溶液进行洗脱，计
算其纯度和回收率，筛选出最佳树脂。
１．３．２　上样浓度对纯化的影响
通过上述实验，用聚酰胺进一步进行上样浓度
的筛选，将花色苷粗提液浓缩至一定浓度，然后将其
稀释为０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ｍｇ／ｍＬ
分别上柱，径长比１∶２０，上样体积为１０ｍＬ，用２ＢＶ
的７０％的乙醇溶液进行洗脱，计算其纯度和回收
率，筛选出最佳上样浓度。
１．３．３　上样体积对纯化的影响
将蓝靛果花色苷粗提浓缩液调节至浓度３．０
ｍｇ／ｍＬ，分别按体积５、１０、１５、２０、２５、３０ｍＬ的体积
进行上样，径长比为１∶２０，用２ＢＶ 的７０％的乙醇
溶液进行洗脱，计算其纯度和回收率，筛选出最佳上
样体积。
１．３．４　径长比对纯化的影响
将聚酰胺按径长比分别为１∶１０、１∶１５、１∶
２０、１∶２５、１∶３０装入各层析柱中，将花色苷粗提液
浓度调节至３．０ｍｇ／ｍＬ 进行上样，上样体积为
２５ｍＬ，用２ＢＶ的７０％的乙醇溶液进行洗脱，计算其
纯度和回收率，筛选出最佳径长比。
７１
２０１３年 刘敬华等：响应面法优化蓝靛果花色苷分离纯化工艺 第３期
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１．３．５　洗脱剂乙醇浓度对纯化的影响
将聚酰胺按径长比１∶１５装入层析柱中，上样
浓度为３．０ｍｇ／ｍＬ，上样体积为２５ｍＬ，用２ＢＶ的乙
醇进行洗脱，调节乙醇浓度为分别为３０％、４０％、
５０％、６０％、７０％、８０％，计算纯度和回收率，筛选出
最佳洗脱剂浓度。
１．３．６　洗脱流速对纯化的影响
将聚酰胺按径长比１∶２５装入层析柱中，调节
上样浓度为３．０ｍｇ／ｍＬ，上样体积为２５ｍＬ，用２ＢＶ
的６０％乙醇进行洗脱，洗脱流速分别为１．０、２．０、
３．０、４．０、５．０ｍＬ／ｍｉｎ，计算纯度和回收率，筛选出
最佳洗脱流速。
１．３．７　响应面分析
选择对纯度影响较大的上样浓度、上样体积、洗
脱流速三个因素利用 ｍｉｎｉｔａｂ１６软件进行 Ｂｏｘ－
Ｂｅｎｈｎｋｅｎ实验，设计如下。
表１　响应面实验因素水平编码表
变　量 编　码
编码水平
－１　 ０　 １
上样浓度／（ｍｇ·ｍＬ－１） Ａ　 ２．５　 ３．０　 ３．５
上样体积／ｍＬ　 Ｂ　 ２０　 ２５　 ３０
流速／（ｍＬ·ｍｉｎ－１） Ｃ　 １　 ２　 ３
２　结果与分析
２．１　最佳树脂的筛选
表２　不同树脂的纯度及回收率的比较
树脂 纯度／％ 回收率／％
聚酰胺 ３４．６５　 ６９．６３
ＮＫＡ－９　 １９．８４　 ６１．７０
ＡＢ－８　 １８．２０　 ８９．９９
Ｄ３５２０　 １７．９０　 ７４．３７
Ｘ－５　 １７．２３　 ９２．４２
Ｄ１０１　 １６．８８　 ９０．７７
　　由表２可知，以Ｘ－５纯化后的花色苷为原料（纯
度为１７．１４％）用以上树脂进行再次纯化，发现的Ｘ－
５、Ｄ１０１的纯度几乎没有变化，而它们的回收率却很
高，说明这两种树脂对纯化过的花色苷没有进一步
的作用，ＡＢ－８、ＮＫＡ－９树脂虽有一定的提高，提高
幅度却不大，而且ＮＫＡ－９树脂的回收率不高，说明
损失很多，但有一种树脂聚酰胺虽然回收率不很高，
但经它纯化过的花色苷的纯度却 很 高，达 到
３４．６５％，这种树脂颗粒较小，容易阻塞层析柱，不适
合纯化含杂质较多的蓝靛果粗提物，从纯化效果看，
选择聚酰胺作为花色苷再次纯化的树脂。
２．２　上样浓度对纯化的影响
图１　不同浓度的上样液对回收率的影响
由图１可知，回收率随上样液浓度的增加而增
加，当上样液浓度为３．０ｍｇ／ｍＬ时，回收率达到最
大，为７５．３３％，上样液浓度继续增加，回收率开始
下降，这是因为上样液浓度过大，导致花色苷不能完
全溶解堆积于树脂顶部不能被树脂吸附，即使洗脱
液也不能将其完全洗脱下来，因而导致回收率下降。
图２　不同浓度的上样液对花色苷纯度的影响
由图２可知，随着上样浓度的增加，花色苷的纯
度增加，当浓度是３．０ｍｇ／ｍＬ，花色苷的纯度达到最
大，为３２．６７％，上样浓度继续增加，花色苷的纯度
开始下降，这是因为浓度过低时，花色苷残留在树脂
中的部分所占比重较大，洗脱下来的较少，因此纯度
较低；而浓度过大时，聚酰胺的吸附能力有限，花色
苷不能被完全吸附，因此纯度会下降，综合考虑选择
花色苷的上样浓度３．０ｍｇ／ｍＬ。
２．３　上样体积对纯化的影响
图３　不同的上样体积对回收率的影响
由图３可知，随上样体积的增加回收率呈现逐
渐增加的趋势，这种增加包含不能被树脂吸附的花
色苷被洗脱液洗脱下来的部分，因此不能仅仅根据
回收率的大小确定它的最佳上样量。
８１
２０１３年 中　国　林　副　特　产 第３期
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图４　不同上样体积对花色苷纯度的影响
由图４可知，随着上样体积逐渐增加，纯度逐渐
增加，当上样体积为２５ｍＬ时，花色苷的纯度达到最
大，为３３．２２％，当上样体积继续增加，花色苷的纯
度开始下降，这说明聚酰胺的吸附能力有限，当上样
体积过大，花色苷不能被聚酰胺完全吸附而导致纯
度下降，因此我们选择花色苷的上样体积为２５ｍＬ。
２．４　层析柱的径长比对纯化的影响
图５　不同的径长比对回收率的影响
由图５可知，花色苷的回收率随径长比的增加
逐渐提高，当径长比达到１∶１５时，回收率达到最
大，为７３．８７％，径长比继续增加，花色苷的回收率
开始下降，这是因为径长比较小时，杂质不能被有效
去除；径长比较大时，花色苷洗脱时的路径较长，残
留于树脂中一部分。
图６　不同径长比对花色苷纯度的影响
由图６可知，纯度随径长比增加呈先增后减的
趋势，在径长比１∶１５时，纯度达到最高点，径长比
继续增加，纯度反而下降，这与花色苷纯化时路径增
加不能完全洗脱而被截留于树脂中有关，综合考虑，
选择１∶１５的径长比较合适。
２．５　洗脱剂乙醇浓度对纯化的影响
由图７可知，洗脱过程中花色苷的回收率随乙
醇浓度的增加而增加，当乙醇浓度达到５０％左右
时，乙醇浓度继续增加，花色苷的回收率变化不明
显，因此应选择乙醇浓度为５０％以上较合适。
图７　不同的乙醇浓度对回收率的影响
图８　不同乙醇浓度对花色苷纯度的影响
由图８可知，花色苷的纯度随乙醇浓度的增加
而增加，当乙醇浓度达到６０％时，花色苷的纯度达
到最大，乙醇浓度继续增加，花色苷的纯度呈一定的
下降趋势后趋于稳定，这是由于花色苷中部分易溶
于水部分易溶于醇的特性所决定的，易溶于醇的部
分占绝大部分，当乙醇的浓度较大时，易溶于水的部
分减少，纯度有一定程度的下降，综合考虑，选择
６０％浓度的乙醇作为洗脱剂较合适。
２．６　洗脱流速对纯化的影响
图９　不同的洗脱流速对回收率的影响
由图９可知，随流速的增加，洗脱液中花色苷的
回收率逐渐下降，当流速超过２ｍＬ／ｍｉｎ时，花色苷
的回收率下降较快，因此洗脱流速 不 宜 超 过
２ｍＬ／ｍｉｎ。
由图１０可知，洗脱液中花色苷的纯度随洗脱流
速的增加而下降，当流速超过２ｍＬ／ｍｉｎ时，花色苷
的纯度下降较快，虽然流速在１ｍＬ／ｍｉｎ时，花色苷
的回收率与纯度都较大，但流速过慢，影响收集效
率，综合考虑，选择洗脱流速为２ｍＬ／ｍｉｎ较为适宜。
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２０１３年 刘敬华等：响应面法优化蓝靛果花色苷分离纯化工艺 第３期
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图１０　不同流速对花色苷纯度的影响
２．７　响应面分析的结果
表３　Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ实验设计及结果
标准序 Ａ　 Ｂ　 Ｃ 纯度／％
１ －１ －１　 ０　 ２６．３７
２　 １ －１　 ０　 ２９．１３
３ －１　 １　 ０　 ２７．２０
４　 １　 １　 ０　 ３０．８２
５ －１　 ０ －１　 ３２．３３
６　 １　 ０ －１　 ２５．４５
７ －１　 ０　 １　 １８．３８
８　 １　 ０　 １　 ２３．３６
９　 ０ －１ －１　 ３０．２７
１０　 ０　 １ －１　 ２９．３２
１１　 ０ －１　 １　 １９．９６
１２　 ０　 １　 １　 ２６．５５
１３　 ０　 ０　 ０　 ３４．１９
１４　 ０　 ０　 ０　 ３４．４６
１５　 ０　 ０　 ０　 ３４．５６
　　使用 ｍｉｎｉｔａｂ１６软件，以上样液浓度、上样体
积、洗脱流速为响应变量，以分段收集中最浓段花色
苷的纯度为响应值对表３的数据进行处理，得到表
４回归方程方差分析表。
表４　回归方程方差分析表
项目 自由度 平方和 均方 Ｆ值 Ｐ值 显著性
回归 ９　 ３３７．１３１　 ３７．４５９　１７．１５　０．００３
线性 ３　 １１６．８２５　 ３８．９４２　１７．８２　０．００４
Ａ　 １　 ２．５０６　 ２．５０６　 １．１５　０．３３３
Ｂ　 １　 ８．３３５　 ８．３３５　 ３．８２　０．１０８
Ｃ　 １　 １０５．９８４　１０５．９８４　４８．５１　０．００１＊＊
平方 ３　 １７０．７６３　 ５６．９２１　２６．０５　０．００２
Ａ×Ａ　 １　 ３９．９０９　 ５４．２２６　２４．８２　０．００４＊＊
Ｂ×Ｂ　 １　 １１．４１４　 １７．７１６　 ８．１１　０．０３６ ＊
Ｃ×Ｃ　 １　 １１９．４４０　１１９．４４０　５４．６７　０．００１＊＊
交互作用 ３　 ４９．５４３　 １６．５１４　 ７．５６　０．０２６ ＊
Ａ×Ｂ　 １　 ０．１１８　 ０．１１８　 ０．０９　０．７８１
Ａ×Ｃ　 １　 ３５．１６２　 ３５．１６２　１６．０９　０．０１０ ＊
Ｂ×Ｃ　 １　 １４．１９４　 １４．１９４　 ６．５０　０．０５１
残差误差 ５　 １０．９２３　 ２．１８５
失拟 ３　 １０．８５３　 ３．６１８　１０２．０６　０．０１０
纯误差 ２　 ０．０７１　 ０．０３５
合计 １４　 ３４８．００５
Ｒ２＝９６．８６％
Ｒ２（调整）
＝９１．２１％
　　注：＊＊表示极显著（Ｐ＜０．０１），＊表示显著（０．０１＜Ｐ＜０．０５）
由表４可知，上样浓度、上样体积对纯度影响不
显著，洗脱流速对纯度的影响结果显著；上样浓度与
上样浓度、上样体积与上样体积、流速与流速之间交
互作用显著；上样浓度与上样体积之间交互作用不
显著，上样浓度与流速、上样体积与流速之间交互作
用显著。
各因素的Ｆ值可以反映各因素的影响程度，Ｆ
值越大，表明对实验指标的影响越大。由表３可得
出各因素对花色苷纯度的影响的大小顺序为：洗脱
流速＞上样体积＞上样浓度。
模型的失拟值为０．０１，不显著，证明模型与实
际的拟合性较好，方程的相关系数Ｒ２ 为９６．８６％，
调整后为９１．２１％，说明模型可以解释，利用软件进
行非线性回归的二次多项式的拟合，得到预测模型
如下：
Ｙ＝３４．４０２０＋０．５５９７Ａ＋１．０２０７Ｂ－３．６３９７７Ｃ
－３．８３２２７Ａ２－２．１９０４７Ｂ２－５．６８７５７Ｃ２＋０．２１６７２５
ＡＢ＋２．９６４８７ＡＣ＋１．８８３７３ＢＣ
由回归方程解得中心点的最佳解为：纯度
３４．４７％，上样浓度２．９８ｍｇ／ｍＬ，上样体积为２５．４７
ｍＬ，洗脱流速为１．６８ｍＬ／ｍｉｎ，这一结果与单因素
所得结果相近，实际验证得花色苷 的 纯 度 为
３４．８５％，模型与实际吻合。
图１１　上样浓度与上样体积对花色苷纯度影响的响应面图
图１２　上样体积与洗脱流速对花色苷纯度影响的响应面图
图１３　上样浓度与洗脱流速对花色苷纯度影响的响应面图
３　结论
通过上述研究，聚酰胺对经过Ｘ－５纯化过的蓝
靛果花色苷纯度有较大提高，其再次纯化的纯度达
０２
２０１３年 中　国　林　副　特　产 第３期

黑莓的组培快繁技术研究
焦　宏
（辽宁省森林经营研究所，辽宁 丹东 １１８００２）
摘　要：对黑莓的组织快繁技术进行了研究。结果表明：茎段茎尖在 ＭＳ＋ＢＡ０．１＋ＧＡ３０．１＋
ＩＢＡ０．５＋ＩＡＡ０．５、ＭＳ＋ＢＡ０．１＋ＧＡ３０．１＋ＩＢＡ１培养基上可诱导出丛生芽，增殖系数在６倍以
上；在 ＭＳ＋ＢＡ０．６＋ＧＡ３０．５＋ＩＢＡ０．２５＋ＩＡＡ０．２５培养基上壮苗一次即可长到２ｃｍ以上；生根
培养以１／２ＭＳ＋ＩＢＡ０．１培养基为最好，生根率达９８％以上，并且每株可达５～１０条根；移栽以纯
沙为最好，成活率达９５％以上。
关键词：黑树莓；组织培养；成活率
　　黑莓（Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｉｅｓ），属蔷薇科悬钩子属植物。
浆果柔嫩多汁，色泽宜人，风味独特。其浆果含有
２０种氨基酸和多种维生素，总糖含量为３．９８％，总
酸为２．２４％，ＶＥ　７０～１６０μｇ／ｇ，ＶＣ　２２．１ｍｇ／１００ｇ，
尤其特含有超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）含量１５７９～
２１５１μｇ／ｇ和硒（具防癌治癌作用）含量２．０７μｇ／ｇ均
较高，在各种果类中罕见。由于黑莓的各种生理活
性物含量高，所以具有促进代谢、降压降血脂、抗心
率失常等作用。是目前风靡世界的“第三代水果”，
在国际市场上被誉为黄金水果。其浆果中所含的水
杨酸，可作为发汗剂，是治疗感冒、流感、咽喉炎的良
好降热食品。根浸酒可作为舒筋活血、消炎退肿的
药剂，茎叶煎水可洗痔疮等。果实还富含挥发性的
具防腐作用的抗生素物质。黑树莓浆果除供鲜食
外，主要用来加工制成各种食品，如果汁、果冻、微发
酵饮料、清凉饮料、糖渍果实、果酱、果酒及果汁糖浆
等。我们用组织培养技术加快繁殖，为该品种的推
广提供一条有效、快捷的途径
櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐櫐
。
到３４％左右，因此，我们选择聚酰胺树脂作为蓝靛
果花色苷再次纯化的层析介质。通过直接上柱对吸
附、解析过程的几个重要单因素研究，以及经过响应
面验证发现优化蓝靛果花色苷的最佳条件为：上样
浓度为 ３．０ｍｇ／ｍＬ，上样量为 ２５ｍＬ，径长比为
１∶２５，洗脱剂乙醇的浓度为６０％，洗脱剂的流速为
２ｍｌ／ｍｉｎ，再 次 纯 化 后 的 花 色 苷 的 纯 度 达 到
３４．８５％。
４　展望
本实验通过聚酰胺对经过Ｘ－５纯化过的蓝靛果
花色苷进行再次纯化，虽然得到了较高的纯度，但这
种方法的原料需要经过Ｘ－５纯化，原料的制取复杂，
另外聚酰胺的再生也较困难，成本较高，不适合工业
化生产，需要对工艺进行改进及简化以达到更好的
效果。
参 考 文 献
［１］　李文星．蓝靛果花色苷提取及其抗肿瘤功能机理的初
步研究［Ｄ］．哈尔滨：东北林业大学，２０１１．
［２］　任健．稠李属果实色素理化性质及及抗氧化抗疲劳作
用研究［Ｄ］．哈尔滨：东北林业大学，２０１１．
［３］　杨玲．蓝靛果提取物抗氧化及抗癌作用的研究［Ｄ］．哈
尔滨：东北林业大学，２００９．
［４］　Ａｒｕｓａ，Ｃｈａｏｖａｎａｌｉｋｉｔ，Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ，Ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ，Ａｎｔｉｏｘ－
ｉｄａｎｔ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ａｎｄ　Ｃｏｌｏｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｂｌｕｅｈｏｎｅｙ－
ｓｕｃｋｌｅｓ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，２００１，４５：３６２－３６７．
［５］　吴克伟，马越，赵晓燕，等．花青素类色素提取纯化研究
现状及发展趋势［Ｊ］．中国食品添加剂，２００８（Ｃ００）：
１４７－１５０．
［６］　Ｒｅｎａｔａ　Ｍｙｊａｖｃｏｖａ，Ｐｅｔｒ　Ｍａｒｈｏｌ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎ－
ｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｐｉｇｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｌｏｎｉｃｅｒａ（Ｃａｅｒｕｌｅａ）ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｕ－
ｓｉｎｇ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎ　ｌｉｑ－
ｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ，１２１７（２０１０）：７９３２－７９４１．
［７］　霍琳琳．桑葚红色素的提取纯化及结构初步鉴定［Ｄ］．
杭州：浙江大学，２００６．
［８］　赵慧芳，王小敏，间连飞，等．黑梅果实中花色苷的提取
和测定方法研究［Ｊ］．食品工业科技，２００８，（５）：１７６－１７９．
［９］　卢立真．紫甘薯花色苷的高效提取及抗衰老、抗糖尿病
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［１０］　唐琳，李子江，赵磊，等．两种ｐＨ值法测定玫瑰花花色
苷含量的比较［Ｊ］．食品科技，２００９，３０（８）：３１０－３１３．
作者简介：刘敬华（１９８７－），女，硕士研究生，研究方向
功能性食品，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕ．ｊｉｎｇｈｕａ＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ。
＊通讯作者：王振宇，男，教授，博士生导师，主要从事活
性成分分离合成与调控、新资源开发 与 利 用，Ｅ－ｍａｉｌ：
ｗｚｙ２１９００１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。
１２
第３期（总第１２４期） 中 国 林 副 特 产 Ｎｏ．３（ＧＳＮＯ．１２４）
２０１３年６月 Ｆｏｒｅｓｔ　Ｂｙ－Ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｎｄ　Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ　 Ｊｕｎ．２０１３
