全 文 ：第 27卷第 2期
2007年 4月
林　产　化　学　与　工　业
ChemistryandIndustryofForestProducts
Vol.27 No.2
Apr.2007
核桃叶中抗植物病毒活性物质提取条件的研究
　　收稿日期:2006-01-10
　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30571494);中国博士后科学基金资助项目(2004035689);陕西省科技攻关项目(2004K03-G3)
　　作者简介:翟梅枝(1963-), 女 ,河南西平人 , 副教授 ,博士 , 主要从事林产资源综合利用研究。
ZHAIMei-zhi　　
翟梅枝 , 景炳年 , 贾彩霞 , 刘朝斌
(西北农林科技大学 林学院 , 陕西 杨凌 712100)
摘　要:　以不同溶剂和方法对核桃叶进行了抗植物病毒物质的提取和活性测定。结果表明:提
取物的抗病毒活性因提取溶剂和提取方法的不同而异。以体积分数 95%乙醇为提取溶剂 , 冷浸
提取物在质量浓度 10g/L时 , 对烟草花叶病毒(TMV)的抑制率最高 , 为 100%。采用冷浸提取
时 ,核桃叶中抗 TMV活性物质提取的优化条件是:以体积分数 95%乙醇为提取溶剂 , 料液比 1∶10
(g∶mL),提取 18h, 得率 21.42%。质量浓度 5g/L的提取物对 TMV侵染心叶烟的抑制率为 100%。该提取物的乙酸
乙酯萃取物经多次层析分离和纯化得到黄酮类化合物 A,质量浓度 0.5g/L的化合物 A对 TMV侵染心叶烟的抑制率达
85.55%, 说明化合物 A是乙酸乙酯萃取物中的主要抗病毒活性成分之一。
关键词:　核桃;烟草花叶病毒;提取方法
中图分类号:TQ91　　　　　　文献标识码:A　　　　　　文章编号:0253-2417(2007)02-0071-05
StudyonExtractionConditionsofActiveAntiviral
SubstancefromWalnutLeaves
ZHAIMei-zhi, JINGBing-nian, JIACai-xia, LIUChao-bin
(ColegeofForestry, NorthwestAgricultureandForestryUniversity, Yangling712100, China)
Abstract:Antiviralsubstancesofwalnut(JuglansregiaL.)leaveswereextractedbydiferentsolventsandmethods, andtheir
antiviralactivitiesweredetermined.Theresultsshowedthatantiviralactivityisdissimilarbasedonextractsfromwalnutleaves
withdiferentsolventandmethods.Forcold-leachedextractwith95%ethanol, whenconcentrationinoculatedis10g/L, inhibi-
tionrateontobaccomosaicvirus(TMV)oftheextractwasthebest, 100%;optimumextractionconditionofthisextractis:
95% ethanolassolvent, ratioofmaterialtosolvent1∶10, soakingtime18h, extractionrate21.42%.Theinhibitionrateofthe
extractonTMVinfectingNicotianaglutinosais100% whenconcentrationinoculatedis5g/L.Besides, anantiviralflavonoidA
wasisolatedfromethylacetateextractthroughcolumnchromatography, thinlayerchromatographyandrecrystalization.Whenits
concentrationinoculatedis0.5g/L, inhibitionrateofthiscompoundonTMVinfectingN.glutinosais85.55%.Theresult
indicatedthatcompoundAisoneofthemainantiviralcomponentsinethylacetateextract.
Keywords:walnut(JuglansregiaL.);tobaccomosaicvirus;extractionmethod
从植物中寻找具有农药活性的物质是新农药创制的重要途径 。植物病毒病给农业生产造成极大的
损失。据统计 ,全世界每年仅烟草花叶病毒(TMV)造成的损失就达 1亿美元以上[ 1] 。植物是天然药物
的宝库 ,国内外学者对植物中抗病毒活性物质进行了广泛深入的研究[ 2-7] ,发现了一些对 TMV有较好
效果的抑制剂。目前 ,国内外对于植物活性成分的研究主要集中在次生代谢物质上 。次生物质种类繁
多 ,且化合物骨架结构 、取代基种类也不同 ,对生物的活性作用就不同。因此 ,从植物中寻找抑制植物病
毒的天然活性物质 ,并将其直接运用到防治 ,或进一步研究有效成分的分子结构与生物活性的构效关
系 ,通过仿生合成得到既能有效控制植物病毒病 ,又不会对环境及其他生物造成伤害的植物源抗病毒
剂 ,这方面的研究具有广阔的应用前景。核桃(JuglansregiaL.)是胡桃属植物中经济价值最高的一种 ,
在我国栽培历史悠久 ,分布广泛 。据报道 ,核桃叶次生物质对蚜虫 、粘虫 、杨毒蛾具有较好的触杀和胃毒
72　 林　产　化　学　与　工　业 第 27卷
效果[ 8-10] ,对金黄色葡萄球菌 、蜡状芽孢杆菌等具有较好的抑制作用 [ 11] ,但核桃叶抗植物病毒活性方面
未见报道 ,本研究采用不同溶剂和提取方法对核桃叶中次生物质进行提取 ,利用活性跟踪手段测定其抗
TMV活性 ,并进行核桃叶中抗病毒活性物质提取条件的优化 ,研究结果可望为核桃叶的综合利用和植
物源抗病毒剂的开发提供科学的理论依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　植物样品　核桃叶于 2004年 9月采自西北农林科技大学核桃采穗圃内 ,自然晾干后 ,于 45℃
左右的烘箱中烘干 ,粉碎过 20目筛(孔径 0.84mm),然后密封于塑料袋内 ,置冰箱中备用。
1.1.2　寄主植物　选用普通烟 K326(Nicotianatabacumvar.K326)和心叶烟(Nicotianaglutinosa)为寄
主植物 ,前者为 TMV的系统侵染寄主 ,用于病毒的繁殖;后者为 TMV的局部枯斑寄主。供试烟苗均采
用直播漂浮育苗技术进行培育 ,经 50d水培后 ,将幼苗移入直径 15cm的花盆中土培 ,生长一定时间后 ,
选长势一致的幼苗用于病毒接种试验 。
1.1.3　供试病毒　烟草花叶病毒(TMV)普通株系 ,保存在普通烟 K326植株上 ,提纯后备用 。
1.1.4　主要仪器及试剂　仪器主要有 RE52A旋转薄膜蒸发仪 、循环水真空泵 、751型分光光度计 、高
速离心机 、植物粉碎机 、恒温水浴锅等;试剂有乙醇 、石油醚 、乙酸乙酯 、正丁醇 、聚乙二醇 、二甲基亚砜
等 ,均为分析纯。
1.2　方法
1.2.1　核桃叶中次生物质的提取　在提取时间 3h、料液比 1∶15(g∶mL,下同)条件下 ,用 95%(体积
分数 ,下同)乙醇 、甲醇和水作溶剂 ,采取 3种不同的提取方法 ,提取核桃叶中的次生物质 ,以半叶法接
种心叶烟 ,根据提取物对 TMV的抑制效果确定适宜的提取溶剂和方法。 1)索氏提取:称取核桃叶粉样
品 20g,加入折叠好的脱脂滤纸 ,装入索氏提取器中 ,用不同溶剂在水浴中加热连续提取一定时间 ,过滤
提取液 ,滤液减压浓缩得索氏提取物 。 2)回流提取:称取核桃叶粉样品 20g置于圆底烧瓶中 ,用不同的
溶剂进行回流提取 ,过滤提取液 ,滤液减压浓缩得回流提取物 。 3)冷浸提取:称取核桃叶粉样品 20g置
于烧杯中 ,用不同提取溶剂于室温下浸泡一定时间后过滤 ,滤液减压浓缩得冷浸提取物。
1.2.2　核桃叶中抗病毒活性物质提取条件优化　以乙醇体积分数 、提取时间和料液比为因素 ,设置正
交试验 ,采用冷浸法提取核桃叶中的抗病毒活性物质 ,根据活性跟踪结果确定适宜的提取条件。
1.2.3　萃取物 、分离物的制备　以 95%乙醇冷浸提取的核桃叶粗提物(W)悬浮于水中 ,依次以石油
醚 、乙酸乙酯 、正丁醇为溶剂萃取分离 ,分别得到石油醚萃取物(W1)、乙酸乙酯萃取物(W2)、正丁醇萃
取物(W3)和萃余水相(W4);乙酸乙酯萃取物经聚酰胺柱层析分离得 30%、50%、70%乙醇洗脱物质
分别记为 W2-30 , W2-50 , W2-70 ,选择活性高的洗脱物质上硅胶柱和 SephadexLH-20凝胶柱分离纯化得到
化合物 A。
1.2.4　TMV病毒的提纯　TMV经心叶烟纯化后 ,在普通烟 K326上繁殖 。 TMV的提纯参考 Gooding
等 [ 12]的方法 ,略有修改 ,其中在第一次加入聚乙二醇(PEG)之前采取两次离心的方法 ,离心速度为
5 000r/m,每次 30min,其他步骤不变。
1.2.5　病毒接种液的配制　取一定量样品提取液 ,加入少量二甲基亚砜(DMSO)溶解后 ,加蒸馏水稀
释至 1mL,接种前加入提纯病毒液 ,使提取液中病毒的最终质量浓度为 20 ～ 30mg/L,混合均匀后用于
接种 ,以不含样品提取物的相同浓度病毒溶液为对照接种液 。
1.2.6　抗病毒活性的测定　采用半叶法混合接种。选择健康 、生长旺盛的 6 ～ 8叶期心叶烟 ,左半叶接
种含有 TMV的植物样品提取液 ,右半叶接种对照液。每处理接种 4 ～ 5个叶片 ,重复 3次 , 3d后分别统
计枯斑数目 ,抑制率计算公式为:
　抑制率 =(对照平均每叶枯斑数 -处理平均每叶枯斑数)/对照平均每叶枯斑数 ×100%
第 2期 翟梅枝 , 等:核桃叶中抗植物病毒活性物质提取条件的研究 73　
2　结果与讨论
2.1　提取溶剂和方法对核桃叶提取物抗 TMV活性的影响
在提取时间(3h)、料液比(1∶15)一定时 ,用 95%乙醇 、甲醇和水 3种溶剂 ,采取 3种不同提取方
法对核桃叶中抗病毒活性物质进行提取 ,所得提取物(供试质量浓度 10g/L)抗 TMV活性跟踪测定结
果见表 1(数据为 3次的平均值)。
表 1　不同溶剂和方法提取的核桃叶活性物质对 TMV的抑制效果
Table1　Inhibitingeffectsofactivesubstanceextractedwithdifferentsolventsandmethods
fromwalnutleavesonTMVinfectingN.glutinosa
溶剂　　
solvents　　
不同提取方法的抑制率 /%
inhibitionrateofextractsfromdiferentextractionmethods
索提 Soxhletextraction 回流 refluxing 冷浸 coldsoaking
水 water 62.42 58.46 64.55
甲醇 methanol 86.04 78.58 88.96
95% EtOH 93.25 86.68 100.00
　　由表 1可看出:1)提取方法相同时 ,提取物的抗病毒活性因提取溶剂不同而异 , 95%乙醇提取物对
TMV侵染心叶烟的抑制效果最好。水提取物的抑制率最低仅为 30%左右 ,比 95%乙醇提取物的抑制
率低 30%左右 。这种差异可能是由于溶剂不同提取物中活性物质的种类和含量不同所致。乙醇是活
性成分提取中最常用的溶剂 ,其毒性小 、价格便宜 、浓缩回收方便;以水为溶剂 ,虽然成本较低 ,但提取物
中其他杂质含量较多 ,且水提取物浓缩困难 、易腐败变质。甲醇提取物的 TWV抑制率与乙醇提取物的
相仿 ,但甲醇有毒 、污染严重。因此 ,从经济和安全的角度来看 ,选择乙醇为溶剂提取核桃叶中抗病毒活
性物质较适宜。 2)提取溶剂相同时 ,冷浸提取物对 TMV侵染心叶烟的抑制效果最好 ,其次为索提提取
物 ,回流提取物对 TMV侵染心叶烟的抑制效果最差。 95%乙醇为溶剂提取时 ,不同提取方法所得提取
物(供试质量浓度 10g/L)对 TMV侵染心叶烟的抑制效果依次是:冷浸提取物(100%)>索提提取物
(93.25%)>回流提取物(86.68%)。推测是由于不同提取方法所获得的活性物质种类和数量有所不
同 ,回流提取时 ,样品和溶剂一直处于较高温度下 ,虽然提取物的得率较其它方法高些 ,但一些热不稳定
的活性物质因长期受热发生性质变化 。因此 ,在同一溶剂的相同浓度下 ,回流提取物的抗病毒活性最
差 ,冷浸提取物的抗病毒效果最好 ,索提获得的提取物其抗病毒效果居中 。从提取物的抗 TMV活性考
虑 ,核桃叶中抗 TMV活性物质的提取以 95%乙醇溶液冷浸提取较好 。
2.2　核桃叶中抗 TMV活性物质提取条件的优化
表 2　正交试验设计方案及结果分析
Table2　Orthogonaltestdesignandanalyses
试验号
No.
A
乙醇体积分数 /%
EtOHvolumefraction
B
时间 /h
time
C
料液比(g∶mL)
material∶liquid
得率 /%
yield
抑制率 /%
inhibitionrate
1 75 6 1∶7.5 7.86 89.12
2 75 12 1∶10 9.02 92.36
3 75 18 1∶12.5 12.26 98.02
4 95 6 1∶12.5 16.75 98.57
5 95 12 1∶7.5 10.68 99.99
6 95 18 1∶10 21.42 100.00
7 100 6 1∶10 11.36 92.56
8 100 12 1∶12.5 15.86 88.36
9 100 18 1∶7.5 10.96 86.92
k1 93.17 93.42 96.37　
k2 99.52 93.57 94.97　
k3 89.28 94.98 94.98　
R 10.24 1.56 1.40　
74　 林　产　化　学　与　工　业 第 27卷
由正交试验结果(见表 2 ,数据为 3次的平均值)的直观分析可以看出:1)供试质量浓度 10g/L时 ,
3个试验因素对活性物质抗 TMV抑制率的影响顺序依次为:A>B>C。即乙醇体积分数为影响提取物
抗 TMV活性的主要因素。所以 ,进行核桃叶中活性物质的提取时 ,必须将乙醇体积分数控制在最优水
平上 ,对于次要因素则可在一定范围内选取适当的水平。 2)核桃叶中活性物质提取的适宜条件为
A2B3C2和 A2B2C1 ,这两种组合所得的提取物(供试质量浓度 10g/L)对 TMV的抑制率分别为 100%和
99.99%。但两者的提取物得率因料液比 、提取时间不同差异较大 , A2B3C2组合提取 18h,得率为
21.42%;A2B2C1组合因料液比小于 A2B3C2组合 ,且提取时间较短(12h),得率仅为 10.68%,前者的
提取得率为后者的 2.01倍 。综合考虑提取时间 、料液比和提取物得率等因素对活性成分的影响 ,选择
A2B3C2作为核桃叶中抗 TMV活性物质提取条件的最优组合 。即以 95%乙醇为提取溶剂 ,料液比
1∶10,冷浸 18 h,所得活性物质对 TMV抑制作用最强 ,且提取物得率较高 。
2.3　核桃叶提取物对 TMV的抑制效果
核桃叶的 95%乙醇冷浸提取物具有成分复杂 ,所含物质种类多的特点 ,以不同溶剂(极性依次由
小到大:石油醚 、乙酸乙酯和正丁醇)进行萃取分离将其分为 4个极性不同的部分 ,并对其中抗 TMV侵
染心叶烟活性最高的乙酸乙酯萃取物进一步跟踪分离。核桃叶提取物 、各萃取物和分离物对 TMV侵染
心叶烟的抑制效果见表 3。
表 3　核桃叶提取物对 TMV侵染心叶烟的抑制效果
Table3　InhibitingefectsofdiferentextractsfromwalnutleavesonTMVinfectingN.glutinosa
提取物 1)
extracts
质量浓度 /(g·L-1)
massconcentration
接种叶片数 /片
no.ofinoculationleaf/piece
左 /右半叶平均枯斑数 /个
left/rightaveragenecrosis/No.
抑制率 /%
inhibitionrate
W 5 12 85/0　 100.00
W1 1 12 72/35 51.39
W2 1 12 84/11 86.91
W3 1 12 76/28 63.16
W4 1 12 85/46 42.59
W2-30 0.5 12 76/21 72.37
W2-50 0.5 12 80/31 61.25
W2-70 0.5 12 72/29 59.72
化合物 AcompoundA 0.5 12 90/12 85.55
1)表中代号见 1.2.3节 symblesintheTableseeinpart1.2.3
　　由表 3可看出 ,在供试质量浓度为 5g/L时 , W对 TMV侵染心叶烟的抑制率仍为 100%。在冷浸
提取物的各萃取物 、分离物中 , W2和化合物 A对 TMV侵染心叶烟的抑制率都在 85%以上 ,分别为
86.91%和 85.55%;各萃取物在供试质量浓度为 1g/L时 ,对 TMV侵染心叶烟的抑制率大小依次为:
W2(86.91%)>W3(63.16%)>W1(51.39%)>W4(42.59%)。活性最高的乙酸乙酯萃取物经多次
聚酰胺柱层析分离得到的 3个不同洗脱流分中 , W2-30对 TMV侵染心叶烟的抑制率最高 ,为 72.37%。
该洗脱物经 SephadexLH-20柱纯化得到化合物 A,定性检测显示:化合物 A具有黄酮类物质的典型反
应 。活性检测表明 ,在供试质量浓度为 0.5g/L时 ,化合物 A对 TMV侵染心叶烟具有较好的抑制效果 ,
抑制率达 85.55%,高于 W2-30对 TMV侵染心叶烟的抑制率 ,与 W2的抑制率接近 。说明化合物 A是乙
酸乙酯萃取物中的主要抗病毒活性成分之一。
3　结 论
3.1　同一植物材料因提取溶剂 、提取方法不同 ,所得活性物质对 TMV侵染心叶烟的抑制效果不同。核
桃叶中抗 TMV活性物质的提取以 95%乙醇溶液冷浸提取较好。
3.2　核桃叶的 95%乙醇冷浸提取物经萃取分离和活性跟踪显示 ,各萃取物中对 TMV侵染心叶烟的
抑制作用大小依次为:乙酸乙酯萃取物 >正丁醇萃取物 >石油醚萃取物 >萃余水相;乙酸乙酯萃取物经
柱层析分离 、纯化和重结晶得到化合物 A, A物质对 TMV侵染心叶烟具有较好的抑制效果 ,质量浓度
第 2期 翟梅枝 , 等:核桃叶中抗植物病毒活性物质提取条件的研究 75　
0.5g/L的 A对 TMV抑制率达 85.55%。
3.3　采用冷浸提取时 ,核桃叶中抗 TMV活性成分提取的优化条件是:95%乙醇为提取溶剂 ,料液比
1∶10(g∶mL),提取 18h,得率为 21.42%。质量浓度 5g/L的活性物质对 TMV的抑制率为 100%。
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