全 文 ：基于分子标记的宏基因组 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因
高变区选择策略∗
张军毅１，２　 朱冰川１　 徐　 超１　 丁　 啸２　 李俊锋３　 张学工３　 陆祖宏２，４∗∗
（ １无锡市环境监测中心站， 江苏无锡 ２１４１２１； ２东南大学生物科学与医学工程学院生物电子学国家重点实验室， 南京
２１００９６； ３清华大学信息科学技术学院生物信息学教育部重点实验室 ／合成与系统生物学研究中心， 北京 １０００８３； ４北京大学
工学院， 北京 １００８７１）
摘　 要　 随着新一代 ＤＮＡ测序技术出现，人们能够同时对多个 ＤＮＡ 样本的宏基因组进行并
行分析，尤其是以 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因高变区为分子标记的测序已经成为微生物多样性研究最为
简洁有效的方法． 目前二代高通量测序的读长不能覆盖 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因的全长，需要选择一个
有效的高变区进行测序．十多年来，对于 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因高变区的选择策略没有统一的标准．本
文分析了常用的高变区选择策略，指出不同环境条件是影响高变区选择的重要因素之一．在
此基础上，提出了高变区选择的参考准则，同时建议应对选择的高变区进行有效评估．
关键词　 微生物多样性； １６Ｓ ｒＲＮＡ； 新一代测序技术； 选择策略
文章编号　 １００１－９３３２（２０１５）１１－３５４５－０９　 中图分类号　 Ｑ９３　 文献标识码　 Ａ
Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍａｔａｇｅｎｏｍｅ⁃ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ
ｇｅｎｅｓ ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ． ＺＨＡＮＧ Ｊｕｎ⁃ｙｉ１，２， ＺＨＵ Ｂｉｎｇ⁃ｃｈｕａｎ１， ＸＵ Ｃｈａｏ１， ＤＩＮＧ Ｘｉａｏ２， ＬＩ Ｊｕｎ⁃
ｆｅｎｇ３， ＺＨＡＮＧ Ｘｕｅ⁃ｇｏｎｇ３，ＬＵ Ｚｕ⁃ｈｏｎｇ２，４ （１Ｗｕｘｉ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｗｕｘｉ ２１４１２１，
Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ； ２Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９６， Ｃｈｉｎａ； ３Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ
Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ／ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＴＮＬＩＳＴ ａｎｄ Ｄｅｐａｒｔ⁃
ｍｅｎｔ ｏｆ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ， Ｔｓｉｎｇｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３， Ｃｈｉｎａ； ４Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｐｅｋｉｎｇ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８７１， Ｃｈｉｎａ） ． ⁃Ｃｈｉｎ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｅｃｏｌ．， ２０１５， ２６（１１）： ３５４５－３５５３．
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ａｄｖｅｎｔ ｏｆ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｅｎａｂｌｅｓ ｐａｒａｌｌｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｗｈｏｌｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ， ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｈｙｐｅｒｖａｒｉ⁃
ａｂｌｅ ｔａｇｓ ｈａｓ ｂｅｃｏｍｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｓｔ⁃ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．
Ｄｕｅ ｔｏ ｉｔｓ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ２ｎｄ⁃ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｈａｔ ｃａｎｎｏｔ ｃｏｖｅｒ ｔｈｅ ｆｕｌｌ １６Ｓ
ｒＲＮＡ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎ， ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｒ Ｖ⁃ｒｅｇｉｏｎｓ ｍｕｓｔ ｂｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ｔｈｅ
ｐｒｏｘｙ． Ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｐａｓｔ ｄｅｃａｄｅ， ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖ⁃ｒｅｇｉｏｎｓ ｈａｓ ｎｏｔ ｂｅｅｎ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｉｎ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｈｅｒｅ ｗｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｏｒ
ｓｕｒｖｅｙｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ． Ｗｅ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ａ ｐｉｌｏｔ ｓｔｕｄｙ ｔｏ ｔｅｓｔ ｄｉｆ⁃
ｆｅｒｅｎｔ Ｖ⁃ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ； １６Ｓ ｒＲＮＡ； ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ （ＮＧＳ）； ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ．
∗江苏省环境监测科研基金项目（１３２０）、国家自然科学基金项目
（６１２２７８０３）和 ２０１３ 年江苏省普通高校研究生科研创新计划项目
（ＣＸＬＸ１３＿１１４）资助．
∗∗通讯作者． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｚｈｌｕ＠ ｓｅｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
２０１５⁃０１⁃０８收稿，２０１５⁃０７⁃２４接受．
　 　 宏基因组（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ），也称环境微生物基因
组或元基因组，是指环境中全部微小生物 ＤＮＡ的总
和［１］ ．自从 １９９８ 年 Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ 等［１］提出宏基因组
学（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ）这一概念，迄今为止，其研究对象
已从最初的土壤［１－３］发展到人体肠道［４－９］、口腔［１０］、
皮肤［１１－１２］、阴道［１３］等，水体［１４－２３］、沉积物［２４－２５］、空
气［２６－２７］、灰霾［２８］、废水［２９－３０］、动植物体等载体中微
生物及其附生微生物［３１－３７］ ．利用宏基因组学方法，
人们对环境微生物的研究实现了从基因、基因组到
环境中全部基因组的跨越．由于微生物物种多样性
应 用 生 态 学 报　 ２０１５年 １１月　 第 ２６卷　 第 １１期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｎｏｖ． ２０１５， ２６（１１）： ３５４５－３５５３
极其丰富，其中 ９９％以上无法在现有实验室条件下
进行培养［３８－４０］，所以利用宏基因组技术来研究那些
大量未知的微生物基因序列，突破了微生物研究的
初始瓶颈，给环境微生物多样性的研究带来革命性
的发展［４１－４３］ ．微生物群落多样性的宏基因组研究主
要有系统进化分子标记测序（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅ⁃
ｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅｓ）和宏基因组 ＤＮＡ 测序（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ） ［４４］ ．近年来，基于系统进化分子
标记 １６Ｓ ｒＲＮＡ［４５－４６］、 ＩＴＳ 序列［４７－４８］ 和 １８Ｓ ｒＲＮＡ
等［４９－５２］的宏基因组技术在研究微生物群落多样性
方面得到了广泛运用．尤其是 ２００５ 年之后，随着测
序技术的发展和条形码（ｓａｍｐｌｅ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｒｃｏｄｅ ｓｅ⁃
ｑｕｅｎｃｅｓ）技术的运用，使得对批量样本的平行、深度
测序成为可能［５３－５４］ ．随着测序准确度（ａｃｃｕｒａｃｙ）、读
长（ｒｅａｄｓ ｌｅｎｇｔｈ）和通量（ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）等参数不断改
进，加之测序成本的持续下降，自然界大量的微生物
多样性及其与环境相互作用的规律将逐步得到揭
示，无疑将极大地促进环境科学和生态学的发展．
从目前的研究来看，以 １６Ｓ ｒＲＮＡ 作为分子标
记的应用最为广泛．因此，这里我们主要探讨基于
１６Ｓ ｒＲＮＡ基因扩增子（１６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｃｏｎｓ）的
宏基因组学研究．大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）的 １６Ｓ
ｒＲＮＡ全长约 １５４２ ｂｐ［５５］，但是目前主流的二代测序
技 术， 如 Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ （ ＰＥ３００ ）、 Ｉｌｌｕｍｉｎａ
Ｈｉｓｅｑ２０００ （ ＰＥ１００）、 Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ２５００ （ ＰＥ１５０）、
Ｒｏｃｈｅ ４５４ ＦＬＸ＋（ＰＥ６００）和 Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭ（４００）
等读长均不能覆盖 １６Ｓ ｒＲＮＡ 全长，必须选择一个
或多个短的、有效的高变区（ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ）
作为替代．然而，扩增 １６Ｓ ｒＲＮＡ 不同的 Ｖ 区会对原
核微生物群落结构的分析结果产生明显的影
响［５６－５８］ ．在 １６Ｓ ｒＲＮＡ 高变区（Ｖ 区）的选择策略方
面还存在较大争议［８，３２，５９－６０］ ．目前用于多样性分析的
Ｖ 区 主 要 分 为 两 类， 一 类 是 单 独 Ｖ 区， 如
Ｖ３［１８，２９－３０，３２，５９－６４］、 Ｖ４［７－８，１２，３２，３５，６０－６２，６５－６９］、 Ｖ５［１０，６０，７０］、
Ｖ６［８－９，１６－１８，３０，５９－６０，６２，７１］和 Ｖ７［６２］等，另一类是连续 Ｖ
区，如 Ｖ１ －Ｖ２［７，１１，１３，６１－６２，７２－７３］、Ｖ１ －Ｖ３［３２，７４－７５］、Ｖ３ －
Ｖ４［３６，７６］、Ｖ３－Ｖ５［４５，７７］、Ｖ４－Ｖ５［７８］、Ｖ４－Ｖ６［９，３２］、Ｖ５－
Ｖ６［６，３４，６２］、Ｖ６ －Ｖ７［６２］、Ｖ５ －Ｖ８［６９］、Ｖ６ －Ｖ８［６９］、Ｖ７ －
Ｖ８［６２］、Ｖ１－Ｖ８［４，２９，７９］，Ｖ５－Ｖ９［８０－８１］、Ｖ６－Ｖ９［２４］和 ＮＬＦ
（ｎｅａｒｌｙ ｆｕｌｌ⁃ｌｅｎｇｔｈ） ［３６，６２］等．因此，对不同类型样本的
１６Ｓ ｒＲＮＡ高变区（Ｖ区）进行有效性评估以及研究 Ｖ
区的选择策略对于原核微生物群落的研究非常必要．
１　 １６Ｓ ｒＲＮＡ的结构
在分析原核微生物多样性时，最为常用的基因
是核糖体 ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）基因．由于功能上高度保守，
序列上的不同位置具有不同的变异速率，核糖体
ＲＮＡ （ｒＲＮＡ）是目前在微生物分子生态学上最为有
用以及应用最广泛的分子标记．一般认为，ｒＲＮＡ 基
因很少发生大规模的横向基因迁移，具有一系列由
非常保守到高变的区域，适合于原核微生物分类信
息的确定．通过 ｒＲＮＡ 序列比对，可以分析不同分类
水平的系统发育关系．对于 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列，序
列之间有 ９７％以上的相似性可以认为是同种，９５％
以上的相似性可以认为是同属，８０％以上的相似性
则可认为是同门［８２］ ．
１６Ｓ ｒＤＮＡ 指的是基因组中与编码核糖体 １６Ｓ
ｒＲＮＡ分子对应的 ＤＮＡ 序列．一般进行系统进化分
析或是对某特定环境进行细菌群落结构分析时，所
分析的对象都是 １６Ｓ ｒＤＮＡ．因为 ＤＮＡ 提取容易，也
比较稳定，但研究者从习惯上往往还是以 １６Ｓ ｒＲＮＡ
来进行描述．在基因组上，１６Ｓ ｒＲＮＡ基因与 ５Ｓ ｒＲＮＡ
和 ２３Ｓ ｒＲＮＡ的各自编码基因组成一个转录单元，
共同转录．大肠杆菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ 全长基因约为 １５４２
ｂｐ，由 ９个可变区和 １０ 个保守区组成，其中保守区
反映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则表明物
种间的差异［５５，８３］，其位置和长度见图 １和表 １．
２　 Ｖ区的选择
限于目前二代高通量测序读长并不能覆盖 １６Ｓ
ｒＲＮＡ全长，必须选择一个或多个较短且有效的 Ｖ
区作为替代．而关于 Ｖ 区的选择策略目前还没有公
认的准则，不同研究者往往采用不同的 Ｖ 区，即使
相同类型的样本也往往运用不同的 Ｖ 区，这限制了
研究之间的连续性和可比性．表 ２ 列举了一些常用
的 Ｖ区和引物选择 ．所以有必要建立一个Ｖ区的选
图 １　 １６Ｓ ｒＲＮＡ一级结构示意图
Ｆｉｇ．１　 Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ．
６４５３ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
表 １　 １６Ｓ ｒＲＮＡ可变区在 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因上的位置
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ
高变区 Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ Ｖ１ Ｖ２ Ｖ３ Ｖ４ Ｖ５ Ｖ６ Ｖ７ Ｖ８ Ｖ９
起点 Ｓｔａｒｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ （ｂｐ） ６８ １３７ ４４０ ５９０ ８２８ １０００ １１１７ １２４３ １４３５
终点 Ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ （ｂｐ） １０１ ２２７ ４９７ ６５２ ８５７ １０３７ １１５７ １２９５ １４６５
长度 Ｌｅｎｇｔｈ （ｂｐ） ３４ ９１ ５８ ６３ ３０ ３８ ４１ ５３ ３１
大肠杆菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ位点 Ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ［５５］ ．
表 ２　 １６Ｓ ｒＲＮＡ可变区在生物多样性检测中的运用
Ｔａｂｌｅ ２　 Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ
样本
Ｓａｍｐｌｅ
Ｖ区
Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ
ｒｅｇｉｏｎｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
参考文献
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
样本
Ｓａｍｐｌｅ
Ｖ区
Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ
ｒｅｇｉｏｎｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
参考文献
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
土壤 Ｓｏｉｌ Ｖ１⁃Ｖ２ ８Ｆ；３３８Ｒ ［６２］
肠道 Ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ８Ｆ；３３８Ｒ ［７］
土壤 Ｓｏｉｌ ２７Ｆ；３３８Ｒ ［６９］
阴道 Ｖａｇｉｎａ ２７Ｆ；３３８Ｒ ［７２］
皮肤 Ｈａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ２７Ｆ；３３８Ｒ ［１１］
废水 Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ２７Ｆ；３５５Ｒ ［６１］
阴道 Ｖａｇｉｎａ ２７Ｆ；３５５Ｒ ［１３］
人体病原菌 Ｈｕｍａｎ⁃ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ Ｖ３ ３３４Ｆ；５３６Ｒ ［５９］
土壤 Ｓｏｉｌ ３３８Ｆ；５３０Ｒ ［６２］
肠道和深海 Ｈｕｔ ａｎｄ ｄｅｅｐ ｓｅａ ３３８Ｆ；５３３Ｒ ［１８］
废水 Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ３３８Ｆ；５４８Ｒ ［６１］
鸡肠道 Ｃｈｉｃｋｅｎ ｇｕｔ ３３８Ｆ；５３３Ｒ ［３２］
废水 Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ３４１Ｆ；５１８Ｒ ［３０］
土壤 Ｓｏｉｌ ３４１Ｆ；５３１Ｒ ［６０］
废水 Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ３４１Ｆ；５３４Ｒ ［２９］
鼠肠道 Ｍｉｃｅ ｇｕｔ ３４１Ｆ；５３４Ｒ ［６３］
鼠肠道 Ｍｉｃｅ ｇｕｔ ３４１Ｆ；５３４Ｒ ［６４］
鸡肠道 Ｃｈｉｃｋｅｎ ｇｕｔ Ｖ１⁃Ｖ３ ８Ｆ；５３３Ｒ ［３２］
湖泊 Ｌａｋｅ ２７Ｆ；５３３Ｒ ［７５］
沉积物和岩石表面
Ｓｅｄｉｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｏｃｋ ｂｉｏｆｉｌｍ
２７Ｆ；５３４Ｒ ［７４］
酸性矿排水 Ａｃｉｄ ｍｉｎｅ ｄｒａｉｎａｇｅ Ｖ４ ５１５Ｆ；８０６Ｒ ［６８］
人肠道 Ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ５１５Ｆ；８０６Ｒ ［７］
沙漠 Ｄｅｓｅｒｔ ５１５Ｆ；８０６Ｒ ［６７］
土壤 Ｓｏｉｌ ５１５Ｆ；８０６Ｒ ［１１］
土壤 Ｓｏｉｌ ５１５Ｆ；８０６Ｒ ［６９］
室内环境 Ｉｎｄｏｏｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ５１５Ｆ；８０６Ｒ ［１２］
土壤 Ｓｏｉｌ ５１６Ｆ；７９８Ｒ ［６０］
人小肠 Ｈｕｍａｎ ｄｉｓｔａｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ５２０Ｆ；８０２Ｒ ［８］
土壤 Ｓｏｉｌ ５３０Ｆ；８０５Ｒ ［６２］
废水 Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ５３０Ｆ；８２６Ｒ ［６１］
鸡肠道 Ｃｈｉｃｋｅｎ ｇｕｔ ５２０Ｆ；８０２Ｒ ［３２］
鸡肠道 Ｃｈｉｃｋｅｎ ｇｕｔ ５２０Ｆ；８０２Ｒ ［３５］
马肠道 Ｈｏｒｓｅ ｇｕｔ ５２０Ｆ；８０２Ｒ ［６６］
猪肠道 Ｐｉｇ ｇｕｔ Ｖ３⁃Ｖ４ ３４１Ｆ；８０６Ｒ ［３６］
鼠肠道 Ｍｉｃｅ ｇｕｔ ３３８Ｆ；８０６Ｒ ［７６］
口腔 Ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ Ｖ５ ７８５Ｆ；８９４Ｒ ［１０］
土壤 Ｓｏｉｌ ７８６Ｆ；９２６Ｒ ［７０］
土壤 Ｓｏｉｌ ７８８Ｆ；８９６Ｒ ［６０］
河水、生物反应器等
Ｒｉｖｅｒ， ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ， ｅｔｃ．
Ｖ３⁃Ｖ５ ３３８Ｆ；９０９Ｒ ［７７］
淡水 Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ ３４１Ｆ；９０７Ｒ ［４５］
沉积物 Ｓｅｄｉｍｅｎｔ Ｖ４⁃Ｖ５ ５１５Ｆ；９０７Ｒ ［７８］
土壤 Ｓｏｉｌ Ｖ６ ９２１Ｆ；１０６８Ｒ ［６０］
人体病原菌 Ｈｕｍａｎ⁃ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ９６０Ｆ；１０８５Ｒ ［５９］
深海 Ｄｅｅｐ ｓｅａ ９６７Ｆ；１０４６Ｒ ［１７］
深海 Ｄｅｅｐ ｓｅａ ９６７Ｆ；１０４６Ｒ ［１６］
肠道和深海 Ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ａｎｄ ｄｅｅｐ ｓｅａ ９６７Ｆ；１０４６Ｒ ［１８］
土壤 Ｓｏｉｌ ９６７Ｆ；１０４６Ｒ ［６２］
废水 Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ９６７Ｆ；１０４６Ｒ ［３０］
猪肠道 Ｐｉｇ ｇｕｔ ９６７Ｆ；１０４６Ｒ ［７１］
人肠道 Ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ９６７Ｆ；１０６２Ｒ ［９］
人小肠 Ｈｕｍａｎ ｄｉｓｔａｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ９８６Ｆ；１０２７Ｒ ［８］
人肠道 Ｈｕｍａｎ ｇｕｔ Ｖ４⁃Ｖ６ ５１５Ｆ；１０６２Ｒ ［９］
鸡肠道 Ｃｈｉｃｋｅｎ ｇｕｔ ５１５Ｆ；１１１４Ｒ ［３２］
人肠道 Ｈｕｍａｎ ｇｕｔ Ｖ５⁃Ｖ６ ７８４Ｆ；１０６１Ｒ ［６］
驴肠道 Ｄｏｎｋｅｙ ｇｕｔ ７８９Ｆ；１０６８Ｒ ［３４］
土壤 Ｓｏｉｌ ８０５Ｆ；１０４６Ｒ ［６２］
土壤 Ｓｏｉｌ Ｖ７ １０４６Ｆ；１２２０Ｒ ［６２］
土壤 Ｓｏｉｌ Ｖ６⁃Ｖ７ ９６７Ｆ；１２２０Ｒ ［６２］
土壤 Ｓｏｉｌ Ｖ５⁃Ｖ８ ８０４Ｆ；１３９２Ｒ ［６９］
土壤 Ｓｏｉｌ Ｖ６⁃Ｖ８ ９２６Ｆ；１３９２Ｒ ［６９］
土壤 Ｓｏｉｌ Ｖ７⁃Ｖ８ １０４６Ｆ；１３９２Ｒ ［６２］
人小肠 Ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ｖ１⁃Ｖ８ ８Ｆ；１３９１Ｒ ［４］
废水 Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ２７Ｆ；１３９１Ｒ ［２９］
土壤 Ｓｏｉｌ ２７Ｆ；１３９２Ｒ ［７９］
土壤 Ｓｏｉｌ ６３Ｆ；１３８７Ｒ ［７９］
土壤 Ｓｏｉｌ Ｖ５⁃Ｖ９ ７８７Ｆ；１４９２Ｒ ［８０］
马肠道 Ｈｏｒｓｅ ｇｕｔ ９３９Ｆ；１４９２Ｒ ［８１］
沉积物 Ｓｅｄｉｍｅｎｔ Ｖ６⁃Ｖ９ ９２６Ｆ；１３９２Ｒ ［２４］
土壤 Ｓｏｉｌ ＮＦＬ ８Ｆ；１４９２Ｒ ［６２］
猪肠道 Ｐｉｇ ｇｕｔ ８Ｆ；１５１０Ｒ ［３６］
择标准，并推荐适于所在环境的目标扩增 Ｖ 区，比
如，Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６等 Ｖ区经常被应用．一般来说，可
变性和适中的保守性被认为是 Ｖ 区选择的标准．此
外，引物的选择也被认为和 Ｖ区的选择同样重要．引
物偏向性会使得某些物种的多样性被高估或低估，
一些群体甚至会整个缺失．融合引物往往用来解决
这一问题，但引物混合比例的差异也会影响分析结
果［１７，８４］ ．
宏基因组技术最先应用于土壤，目前已经在肠
道、深海、口腔、土壤、废水、湖泊等环境中得到了广
７４５３１１期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 张军毅等： 基于分子标记的宏基因组 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因高变区选择策略　 　 　 　 　 　
泛的运用（表 ２）．而在 Ｖ 区的选择上，以 Ｖ３、Ｖ４ 和
Ｖ６居多．当然在此过程中，也有大量文章对单 Ｖ区、
以及单 Ｖ 区和连续 Ｖ 区之间进行了比较研
究［７－９，３２，５９－６０，６２，６９，８５－８６］ ．
　 　 由于各种环境中的细菌群落多样性差异明显，
以及试验的目的、条件和设计者的经验等原因使得
Ｖ区的选择复杂多变，但是考虑以下几个方面仍是
十分必要的．
２􀆰 １　 试验目的
目的是评估环境中微生物丰富度（ｓｐｅｃｉｅｓ ｒｉｃｈ⁃
ｎｅｓｓ）和均匀度（ｓｐｅｃｉｅｓ ｅｖｅｎｎｅｓｓ），还是更加关注精
确的分类，尤其是属和种水平上的精确分类和鉴定
等其他研究？ 这对于 Ｖ 区和引物的选择意义重大．
例如，由于 Ｖ６ 区长度偏短，可变性较高，虽然可以
用来进行多样性的评估和分析，以及表型（ ｐｈｙｌｏ⁃
ｔｙｐｅ）研究，但是作为物种鉴定 （ ｔａｘｏｎｏｍｙ ａｓｓｉｇｎ⁃
ｍｅｎｔ）却往往不是最合适的选择［８］ ． Ｗａｎｇ 等［８７］和
Ｌｉｕ等［８８］通过对比研究，认为 Ｖ２ 和 Ｖ４ 在种类鉴定
时的错误率较低，同时也适用于群落聚类分析
（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ） ［４２］ ．有些研究需要对某些特
定门类进行筛选，有时需要鉴定到属和种的水平甚
至株系的水平时，则不同 Ｖ区的选择意义重大［７，５９］ ．
２􀆰 ２　 测序平台、测序深度或经济成本
目前用于宏基因组生物多样性分析的高通量测
序平台主要有：Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｒｏｃｈｅ 和 Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（表 ３）．
但从发表论文数量来看，Ｉｌｌｕｍｉｎａ 是主流平台．同时
鉴于测序的长度，目前 Ｖ 区主要仍以单区为主． Ｉｏｎ
Ｔｏｒｒｅｎｔ 平台的测序速度最快， Ｉｌｌｕｍｉｎａ 通量最高，
Ｒｏｃｈｅ单位碱基测序价格最高．从目前的研究来看，
大多测序深度在 １万 ～ １０ 万条序列之间，当然也不
乏有研究者进行深度测序．作者运用 ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉｓｅｑ
２０００研究 ２０１２年太湖水体的浮游细菌，以 Ｖ６ 作为
目标扩增区，共 ９６ 个样本，平均每个样本 ３２０ 万条
细菌序列和 ７０ 万条古细菌序列，共获得 ６６０５ 个细
菌 ＯＴＵ和 ５１１４个古细菌 ＯＴＵ．此外，经过计算机模
拟（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ），引物在不同的平台 Ｉｌｌｕｍｉ⁃
ｎａ、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ 和 ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ 上也有一定
的差 异 性． 例 如， Ｓ⁃Ｄ⁃Ａｒｃｈ⁃０３４９⁃ａ⁃Ｓ⁃１７ ／ Ｓ⁃Ｄ⁃Ａｒｃｈ⁃
０５１９⁃ａ⁃Ａ⁃１６和 Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃０３４１⁃ｂ⁃Ｓ⁃１７ ／ Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃０７８５⁃
ａ⁃Ａ⁃２１被认为最适于 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 和 Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ 平台的
古细菌和细菌调查［８６］ ．
２􀆰 ３　 群落结构
不同的生境往往蕴含不同的生物群落． Ｇｈａｉ
等［２０］通过宏基因组的方法研究了亚马逊河上游段
的细菌群落，发现 Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ 的 ａｃＩ 和 ａｃｌＶ 家族
是明显的优势类群．其对比了可利用的其他水生态
系统的宏基因组数据，发现淡水系统之间具有很大
的相似性，但是与海洋生态系统相比差异较大．不同
生境群落结构之间的差别，不仅体现在门的水平上，
更体现在属的水平上，从而给 Ｖ 区的选择带来了挑
战．基于宏基因组研究的环境中细菌群落结构往往
是未知的，这显然给 Ｖ区的选择带来了困扰．尽管可
以根据以往的文献资料来了解研究对象的微生物群
落结构，但是进行一个 Ｖ 区评估的预试验仍然很有
必要．Ｐｅｉｆｆｅｒ 等［６９］研究野外条件下的玉米根际微生
物群落，首先利用 Ｒｏｃｈｅ ４５４平台对多个 Ｖ区（２７Ｆ⁃
３３８Ｒ， Ｖ１⁃Ｖ２； ５１５Ｆ⁃８０６Ｒ， Ｖ４； ８０４Ｆ⁃１３９２Ｒ， Ｖ５⁃
Ｖ８； ９２６Ｆ⁃１３９２Ｒ； Ｖ６⁃Ｖ８）进行了测序，对比研究了
４个 Ｖ区，结果表明，不同的引物对在门水平上形成
的细菌群落的测定结果略有不同，５１５Ｆ⁃８０６Ｒ 因在
域和门的水平上获得的多样性最好、得到的 ｒｅａｄｓ
数量较多、能注释上的比例较高等原因而被选择进
行后续分析．
２􀆰 ４　 引物偏向性
引物的偏向性往往由引物、ＰＣＲ 循环数和反应
的酶系统等引入［８９］ ．偏向性在某些环境样本中的影
响会非常大，造成对某些种类过低或过高的估计，甚
至有些群体被完全遗漏．例如， ８Ｆ、 ３３７Ｆ、 ３３８Ｒ、
５１５Ｆ、９１５Ｆ、９３０Ｒ 和 １０６１Ｒ 等一些通用的引物在肠
道微生物群落的研究中，通过 ＲＤＰ 数据库（ ｒｉｂｏｓｏ⁃
ｍａｌ ｄａｔａｂａｓｅ ｐｒｏｊｅｃｔ ｄａｔａｂａｓｅ）可以比对 ９５％以上的
主要门类（ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、
表 ３　 宏基因组多样性分析的主要测序平台
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＧＳ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ⁃ｂａｓｅｄ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ
平台
Ｐｌａｔｆｏｒｍ
读长
Ｒｅａｄ ｌｅｎｇｔｈ （ｂｐ）
运行时间
Ｔｉｍｅ ／ ｒｕｎ
通量
Ｏｕｔｐｕｔ ｄａｔａ ／ ｒｕｎ
准确性
Ａｃｃｕｒａｃｙ
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ （ＰＥ３００） ２×３００ ４０ ｈ ８ Ｇｂ Ｍｏｓｔｌｙ＞Ｑ３０
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ ２０００ （ＰＥ１００） ２×１００ ＞８ ｄ ＞５００ Ｇｂ Ｍｏｓｔｌｙ＞Ｑ３０
Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭ （４００）∗ ＞４００ ３ ｈ １ Ｇｂ Ｍｏｓｔｌｙ＞Ｑ２０
Ｒｏｃｈｅ ４５４ ＦＬＸ ＞７００ ２４ ｈ ７００～１０００ Ｍｂ Ｍｏｓｔｌｙ＞Ｑ３０
∗３１８芯片 ３１８ ｃｈｉｐｓ．
８４５３ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
表 ４　 不同测序平台上的最佳引物选择
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ
普通命名
Ｃｏｍｍｏｎ ｎａｍｅ
新命名
Ｎｅｗ ｎａｍｅ１）
平台
Ｐｌａｔｆｏｒｍ
５′⁃３′序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ５′⁃３′
位点
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ２）
长度
Ｌｅｎｇｔｈ
（ｂｐ）
覆盖度 Ｃｏｖｅｒａｇｅ４）（％）
Ａ Ｂ Ｅ
Ａ５１９Ｆ Ｓ⁃Ｄ⁃Ａｒｃｈ⁃０５１９⁃ａ⁃Ｓ⁃
１５
Ｒｏｃｈｅ ４５４ ＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧ⁃
ＴＡＡ
５１９～５３５ １５ ７６．６ ０．０ ０．０
Ａｒｃｈ１０１７Ｒ Ｓ⁃Ｄ⁃Ａｒｃｈ⁃１０４１⁃ａ⁃Ａ⁃
１８
ＧＧＣＣＡＴＧＣＡＣＣＷＣ⁃
ＣＴＣＴＣ
１０４１～１０５８ １８
Ｂａｋｔ＿３４１Ｆ Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃０３４１⁃ｂ⁃Ｓ⁃
１７
ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧ⁃
ＧＣＡＧＣＡＧ
３４１～３５７ １７ ０．５ ８６．２ ０．０
Ｂａｋｔ＿８０５Ｒ Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃０７８５⁃ａ⁃Ａ⁃
２１
ＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧ⁃
ＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ
７８５～８０５ ２１
Ａｒｃｈ３４９Ｆ Ｓ⁃Ｄ⁃Ａｒｃｈ⁃０３４９⁃ａ⁃Ｓ⁃
１７
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＆ Ｉｏｎ Ｔｏｒ⁃
ｒｅｎｔ
ＧＹＧＣＡＳＣＡＧＫＣＧ⁃
ＭＧＡＡＷ
３４９～３６５ １７ ７６．８ ０．０ ０．０
Ｐａｒｃｈ５１９Ｒ Ｓ⁃Ｄ⁃Ａｒｃｈ⁃０５１９⁃ａ⁃Ａ⁃１６
ＧＧＴＤＴＴＡＣＣＧＣＧ⁃
ＧＣＫＧＣＴＧ
５１９～５３３ １５
５２０Ｆ Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃０５６４⁃ａ⁃Ｓ⁃
１５
ＡＹＴＧＧＧＹＤＴＡ⁃
ＡＡＧＮＧ
５６４～５７８ １５ １４．６ ８９．０ ０．０
８０２Ｒ Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃０７８５⁃ｂ⁃Ａ⁃
１８
ＴＡＣＮＶＧＧＧ⁃
ＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ
７８５～８０２ １８
２７Ｆ Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃０００８⁃ｃ⁃Ｓ⁃
２０
ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ３）和经
典克隆库
ＡＧＲＧＴＴＹＧＡＴＹＭＴ⁃
ＧＧＣＴＣＡＧ
８～２７ ２０ ０．１ ７８．０ ０．０
１３９１Ｒ Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃１３９１⁃ａ⁃Ａ⁃
１７
ＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴ⁃
ＧＴＲＣＡ
１３９１～１４０７ １７
１）引物的新命名参照 Ｎｅｗ ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ ｗａｓ ｇｉｖｅｎ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ Ａｌｍ ｅｔ ａｌ．［９１］ ； ２）位点命名参照大肠杆菌命名系统 Ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ［９２］ ； ３）如果扩增子＞１４００ ｂｐ，推荐 Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃０００８⁃ａ⁃Ｓ⁃１６ ／ Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃１４９２⁃ａ⁃Ａ⁃１６ Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃０００８⁃ａ⁃Ｓ⁃１６ ／ Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃１４９２⁃ａ⁃
Ａ⁃１６ ｗａｓ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ｆｏｒ ｎｅａｒｌｙ ｆｕｌｌ⁃ｌｅｎｇｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ （＞１４００ ｂｐ）； ４）根据 ＳＩＬＶＡ数据库 １０６进行评估 Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｗａｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＳＩＬＶＡ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ｄａｔａｂａｓｅ １０６［９３］ ； Ａ： 古细菌 Ａｒｃｈａｅａ； Ｂ： 细菌 Ｂａｃｔｅｒｉａ； Ｅ： 真核 Ｅｕｋａｒｙｏｔａ．
Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ和 Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）序列［４２］ ．但是对于
某些门类的缺失也同样存在，如 ７８４Ｆ 很难区分 Ｖｅｒ⁃
ｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ的种类［６］；９６７Ｆ 只能比对不足 ５％ 的
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ序列［１６］；１４９２Ｒ 只能比对 ６１％的 Ａｃｔｉ⁃
ｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、５４％ 的 Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ序列和不到一半的
其他门类［９０］ ．同时，也有通过优化引物设计来实现
对 ９８．０％的细菌和 ９４．６％的古细菌在 ＲＤＰ 数据库
中同时分析的策略［３６］ ．在玉米根际微生物群落的研
究中，可能是因为过长的原因，８０４Ｆ⁃１３９２Ｒ 产生的
序列数最少；２７Ｆ⁃３３８Ｒ 对于 Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ 扩增的
效率不高；９２６Ｆ⁃１３９２Ｒ 扩增了大量的色素体（ｐｌａｓ⁃
ｔｉｄ）１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因；５１５Ｆ⁃８０６Ｒ 在域和门的水平上
获得的多样性最好［６９］ ．Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ 等［８６］通过计算机
模拟在 ＳＩＬＶＡ数据库中研究了 １７５条引物和 ５１２对
引物，结合引物的物种覆盖度（ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｃｏｖｅｒａｇｅ）
和门类覆盖度（ｐｈｙｌｕｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）认为仅有 １０ 条可
以被推荐为广谱性引物（ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ ｐｒｉｍｅｒｓ），推荐
扩增长度为 ４６４ ｂｐ 的 Ｓ⁃Ｄ⁃Ｂａｃｔ⁃０３４１⁃ｂ⁃Ｓ⁃１７ ／ Ｓ⁃Ｄ⁃
Ｂａｃｔ⁃０７８５⁃ａ⁃Ａ⁃２１为最好的引物组合．不同测序平台
引物的表现有所不同，一些被认为是通用的引物（例
如 Ｆ５１５和 Ｒ８０６）表现也并非最为突出，详见表 ４．
２􀆰 ５　 连续性和可比性
通过 ＤＮＡ测序来分析微生物多样性的最大优
势是可以将来自不同研究的数据进行整合分析，这
是 ＤＮＡ指纹图谱等方法所不具有的．但是，如果这
些数据出自各种不同的试验方法，将会给这种整合
分析带来麻烦．理论上来说，如果这些数据都来自同
样一个 Ｖ区，那么就可以直接进行操作单元（ｏｐｅｒａ⁃
ｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔｓ， ＯＴＵｓ ） 聚类和种类注解
（ｔａｘｏｎｏｍｙ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）的整合分析［９］ ．因此，连续性
和可比性对于 Ｖ区的选择也至关重要．
３　 小结和展望
基于 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列分析细菌多样性的宏
基因组技术，突破了微生物研究纯培养的瓶颈，改变
了人们对微生物世界的传统认识．近年来，在农业、
工业、环境、食品和卫生等领域得到了广泛的运用．
然而限于目前主流测序平台的读长和成本，还很难
对 １６Ｓ ｒＲＮＡ全长进行高通量测序．所以在未来一段
时间内，Ｖ区的选择对于基于序列分析的宏基因组
多样性研究者来说仍然是一项必须面对的困扰．本
文总结了如下 Ｖ区选择的参考准则：１） 结合研究目
的和意义，选择合适的测序平台和测序深度．２） 不
同生境条件所形成的特有群落结构是需要重点考虑
的因素，尤其是针对某种目的细菌门类的研究．３）
可变性和适中的保守性被认为是 Ｖ 区选择的标准．
Ｖ 区两边高保守的侧翼位点（ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｌｏｎｇ ｆｌａｎ⁃
ｋｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）有利于通过设计相应引物“抓取”更多的
９４５３１１期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 张军毅等： 基于分子标记的宏基因组 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因高变区选择策略　 　 　 　 　 　
种类．４） 连续性和可比性．
总之，从目前的研究结果来看，仍然没有一个统
一的 Ｖ区选择标准，研究者需要综合以上各种因素
进行 Ｖ区的选择．从引物的设计和选择来看，也没有
一个真正意义上的通用引物（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ）能够
覆盖所有的原核微生物．所以，建议在研究之前对选
择的 Ｖ区进行有效评估．此外，也有学者对现有的
１６Ｓ ｒＲＮＡ数据库进行研究和改善［８８，９４－９５］、对生物信
息学算法［９６－９８］进行改进，这些都是十分必要的．
高通量测序技术的快速发展，尤其是以长读长
为主要特点的第三代测序技术，如 Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏ⁃
ｓｃｉｅｎｃｅｓ （ＰａｃＢｉｏ） ＲＳ ＳＭＲＴ 测序仪，其平均读长可
达 ５０００ ｂｐ以上，很容易覆盖 １６Ｓ ｒＲＮＡ全长．Ｍｏｓｈｅｒ
等［７４］通过对比 ＰａｃＢｉｏ ＲＳ ＳＭＲＴ 和 Ｒｏｃｈｅ ４５４ 这两
个平台，认为在系统进化树的构建和种类的分类方
面第三代测序技术目前并没有表现出明显的优势，
其主要原因为第三代测序错误率高．随着测序技术
向低错误率、长读长和高通量方向发展，１６Ｓ ｒＲＮＡ
全长的高通量测序将会成为现实，并将为原核微生
物群落结构的研究提供更加准确和全面的信息．此
外，随着测序技术的发展和成本的不断下降，利用鸟
枪法直接进行宏基因组 ＤＮＡ 的测序 （ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）也将逐步成为主流．该方法不依
赖于 １６Ｓ ｒＲＮＡ目标片段的大量扩增，减少 ＰＣＲ 扩
增所带来的误差，进而提高了微生物多样性结果的
准确性和可靠性．
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ｏｆ ｓｅｘ， ｈａｎｄｅｄｎｅｓｓ， ａｎｄ ｗａｓｈｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
ｈａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａ⁃
ｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， ２００８，
１０５： １７９９４－１７９９９
［１２］　 Ｌａｘ Ｓ， Ｓｍｉｔｈ ＤＰ， Ｈａｍｐｔｏｎ⁃Ｍａｒｃｅｌｌ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｌｏｎｇｉｔｕ⁃
ｄｉｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎｓ
ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｏｏｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１４， ３４５： １０４８－
１０５２
［１３］　 Ｓｐｅａｒ ＧＴ， Ｓｉｋａｒｏｏｄｉ Ｍ， Ｚａｒｉｆｆａｒｄ ＭＲ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒｉ⁃
ｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｇｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ＨＩＶ⁃ｉｎ⁃
ｆｅｃｔｅｄ ａｎｄ ＨＩＶ⁃ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｂａｃｔｅ⁃
ｒｉａｌ ｖａｇｉｎｏｓｉｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， ２００８， １９８：
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ｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． Ｎａｔｕｒｅ， ２００４，
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ｔｅｒｍｉｎｅｓ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｒｋ
ｇｒａｓｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ， ２０１５， ６９： ３９５ －
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［４７］　 Ｓｃｈｏｃｈ ＣＬ， Ｓｅｉｆｅｒｔ ＫＡ， Ｈｕｈｎｄｏｒｆ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉ⁃
ｂｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ （ ＩＴＳ） ｒｅｇｉｏｎ ａｓ ａ
ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｆｕｎｇｉ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａ， ２０１２， １０９： ６２４１－６２４６
［４８］　 Ｓｏｎｇ ＪＹ， Ｓｈｉ ＬＣ， Ｌｉ ＤＺ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎ⁃
ｃｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｉｎｔｒａ⁃ｇｅｎｏｍｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ．
ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１２， ７（８）： ｅ４３９７１
［４９］ 　 Ａｇｕｉｌｅｒａ Ａ， Ｓｏｕｚａ⁃Ｅｇｉｐｓｙ Ｖ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ⁃Ｔｏｒｉｌ Ｅ， ｅｔ ａｌ．
Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｍａｔｓ ｉｎ ｔｗｏ Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｈｏｔ ｓｐｒｉｎｇｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ⁃
ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１０， １３： ２１－３２
［５０］　 Ｌｉｎｄｅｑｕｅ ＰＫ， Ｐａｒｒｙ ＨＥ， Ｈａｒｍｅｒ ＲＡ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｘｔ ｇｅ⁃
ｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｈｉｄｄｅｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｚｏｏ⁃
ｐｌａｎｋｔｏｎ ａｓｓｅｍｂｌａｇｅｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１３， ８ （ １１ ）：
ｅ８１３２７
１５５３１１期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 张军毅等： 基于分子标记的宏基因组 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因高变区选择策略　 　 　 　 　 　
［５１］　 Ｈｕｇｅｒｔｈ ＬＷ， Ｍｕｌｌｅｒ ＥＥ， Ｈｕ ＹＯ， ｅｔ ａｌ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｄｅ⁃
ｓｉｇｎ ｏｆ １８Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｅｕｋａｒｙｏ⁃
ｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｎｓｏｒｔｉａ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１４， ９
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［５２］　 Ｗｕ ＷＸ， Ｈｕａｎｇ ＢＱ， Ｌｉａｏ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｐｉｃｏｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｄｉ⁃
ｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ⁃ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｓｏｕｔｈ
Ｃｈｉｎａ Ｓｅａ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｃｏｌｏｇｙ， ２０１４， ８９：
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［５３］　 Ｈａｍａｄｙ Ｍ， Ｗａｌｋｅｒ ＪＪ， Ｈａｒｒｉｓ ＪＫ， ｅｔ ａｌ． Ｅｒｒｏｒ⁃ｃｏｒｒｅｃ⁃
ｔｉｎｇ ｂａｒｃｏｄｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈｕｎｄｒｅｄｓ ｏｆ
ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００８， ５： ２３５－
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［５４］ 　 Ｍｅｙｅｒ Ｍ， Ｓｔｅｎｚｅｌ Ｕ， Ｈｏｆｒｅｉｔｅｒ Ｍ． Ｐａｒａｌｌｅｌ ｔａｇｇｅｄ ｓｅ⁃
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［５５］　 Ｂａｋｅｒ ＧＣ， Ｓｍｉｔｈ ＪＪ， Ｃｏｗａｎ ＤＡ． Ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｒｅ⁃ａｎａｌｙｓｉｓ
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ａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｒｒｓ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｂｙ ＰＣＲ⁃ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ⁃
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［５７］　 Ｌｉ Ｈ， Ｚｈａｎｇ Ｙ， Ｌｉ ＤＳ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｒｒｓ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ ｐａｄｄｙ ｓｏｉｌｓ． Ｓｏｉｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００９， ４１： ９５４－９６８
［５８］　 Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ
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ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉ⁃
ｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００７， ６９： ３３０－３３９
［６０］　 Ｖａｓｉｌｅｉａｄｉｓ Ｓ， Ｐｕｇｌｉｓｉ Ｅ， Ａｒｅｎａ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ Ｖ ｒｅ⁃
ｇｉｏｎｓ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉ⁃ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎ⁃
ｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１２， ７（８）： ｅ４２６７１
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ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ （ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ⁃
ｒｅｓｉｓ） ｗｉｔｈ ｇｒｏｕｐ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｌａｎｔｓ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｃｏｌｏ⁃
ｇｙ， ２００２， ３９： １０１－１１２
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ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ ｒｉｃｈｎｅｓｓ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ｎｅａｒｌｙ ｃｏｍ⁃
ｐｌｅｔｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ⁃ｇｅｎｅｒａｔｅｄ
ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ⁃ｂａｓｅｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｕｒ⁃
ｖｅｙｓ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００９，
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ｌｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ ｕｎｄｅｒ ｈｉｇｈ⁃ｆａｔ
ｄｉｅｔａｒｙ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ＩＳＭＥ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０１２， ６：
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［６４］　 Ｚｈａｎｇ ＣＨ， Ｌｉ ＳＦ， Ｙａｎｇ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ｌｉｆｅ⁃ｌｏｎｇ ｃａｌｏｒｉｅ⁃ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｍｉｃｅ． Ｎａ⁃
ｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２０１３， ４： ２１６３
［６５］　 Ｆｉｅｒｅｒ Ｎ， Ｌａｕｂｅｒ ＣＬ， Ｒａｍｉｒｅｚ ＫＳ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ
ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ， ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ
ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ａｃｒｏｓｓ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ． Ｔｈｅ
ＩＳＭＥ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０１２， ６： １００７－１０１７
［６６］　 Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ＭＬ， Ｓｗｅｃｋｅｒ ＷＳ， Ｊｒ Ｊｅｎｓｅｎ ＲＶ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈａ⁃
ｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｆｏｒａｇｅ⁃
ｆｅｄ ｈｏｒｓｅｓ ｂｙ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ４ ｇｅｎｅ ａｍ⁃
ｐｌｉｃｏｎｓ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２０１２， ３２６： ６２－６８
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ｈｉｋｅｒｓ ｏｎ ｉｎｔｅｒｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌ ｄｕｓｔ： Ｃａｔｃｈｉｎｇ ａ ｌｉｆｔ ｉｎ Ｃｈａｄ．
Ｔｈｅ ＩＳＭＥ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０１３， ７： ８５０－８６７
［６８］　 Ｋｕａｎｇ ＪＬ， Ｈｕａｎｇ ＬＮ， Ｃｈｅｎ ＬＸ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ
ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ａｃｉｄ ｍｉｎｅ ｄｒａｉｎａｇｅ． Ｔｈｅ ＩＳＭＥ Ｊｏｕｒｎａｌ，
２０１３， ７： １０３８－１０５０
［６９］　 Ｐｅｉｆｆｅｒ ＪＡ， Ｓｐｏｒ Ａ， Ｋｏｒｅｎ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｈｅｒｉ⁃
ｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｕｎｄｅｒ ｆｉｅｌｄ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉ⁃
ｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， ２０１３， １１０： ６５４８－
６５５３
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ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ
Ａｒｃｔｉｃ ｓｏｉｌｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｉｅｓｅｌ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ．
Ｔｈｅ ＩＳＭＥ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０１３， ７： １２００－１２１０
［７１］　 Ｚｈａｎｇ ＱＳ， Ｗｉｄｍｅｒ Ｇ， Ｔｚｉｐｏｒｉ Ｓ． Ａ ｐｉｇ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕ⁃
ｍａｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ． Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ， ２０１３， ４： １９３－
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Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，
２０１１， １０８： ４６８０－４６８７
［７３］　 Ｓｔａｕｂａｃｈ Ｆ， Ｂａｉｎｅｓ ＪＦ， Ｋｕｎｚｅｌ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｈｏｓｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ａｓｓｏ⁃
ｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｎａｔｕ⁃
ｒａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１３， ８（８）： ｅ７０７４９
［７４］　 Ｍｏｓｈｅｒ ＪＪ， Ｂｅｒｎｂｅｒｇ ＥＬ， Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃａｃｙ
ｏｆ ａ ３ｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ
ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓａｍ⁃
ｐｌｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１３， ９５：
１７５－１８１
［７５］　 Ｔａｎｇ ＸＭ， Ｌｉ ＬＬ， Ｓｈａｏ ＫＱ， ｅｔ ａｌ． Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａ⁃
ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｒｅｅ⁃ｌｉｖｉｎｇ ａｎｄ ａｔｔａｃｈｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ
Ｍｅｉｌｉａｎｇ Ｂａｙ， Ｌａｋｅ Ｔａｉｈｕ， ａ ｌａｒｇｅ ｅｕｔｒｏｐｈｉｃ ｓｈａｌｌｏｗ
ｌａｋｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ． Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１５，
６１： １－１０
［７６］　 Ｄｅｎｎｉｓ ＫＬ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｂｌａｔｎｅｒ ＮＲ， ｅｔ ａｌ． Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ
ｐｏｌｙｐｓ ａｒｅ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｍｉｃｒｏｂｅ⁃ｉｎｓｔｉｇａｔｅｄ ｆｏｃａｌ ｉｎｆｌａｍｍａ⁃
ｔｉｏｎ ａｎｄ ａｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ＩＬ⁃１０⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ．
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１３， ７３： ５９０５－５９１３
［７７］　 Ｐｉｎｔｏ ＡＪ， Ｒａｓｋｉｎ Ｌ． ＰＣＲ ｂｉａｓｅｓ ｄｉｓｔｏｒｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ａｒ⁃
ｃｈａｅａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａｓｅｔｓ．
ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１２， ７（８）： ｅ４３０９３
［７８］　 Ｘｉｏｎｇ ＪＢ， Ｌｉｕ ＹＱ， Ｌｉｎ ＸＧ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ
ａｎｄ ｐＨ ｄｒｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ｌａｋｅ ｓｅｄｉ⁃
ｍｅｎｔｓ ａｃｒｏｓｓ Ｔｉｂｅｔａｎ Ｐｌａｔｅａｕ． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ⁃
ｇｙ， ２０１２， １４： ２４５７－２４６６
［７９］　 Ｍａｒｃｈｅｓｉ ＪＲ， Ｓａｔｏ Ｔ， Ｗｅｉｇｈｔｍａｎ ＡＪ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ
２５５３ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｓｅｆｕｌ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｔｈａｔ
ａｍｐｌｉｆｙ ｇｅｎｅｓ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ １６Ｓ ｒＲＮＡ． Ａｐｐｌｉｅｄ
ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９８， ６４： ７９５－７９９
［８０］　 Ｒｏｅｓｃｈ ＬＦ， Ｆｕｌｔｈｏｒｐｅ ＲＲ， Ｒｉｖａ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎ⁃
ｃｉｎｇ ｅｎｕｍｅｒａｔｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒａｓｔｓ ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．
Ｔｈｅ ＩＳＭＥ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２００７， １： ２８３－２９０
［８１］　 Ｓｔｅｅｌｍａｎ ＳＭ， Ｃｈｏｗｄｈａｒｙ ＢＰ， Ｄｏｗｄ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｐｙｒｏｓｅ⁃
ｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｆｅｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ
ｈｉｇｈ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｈｉｎｄｇｕｔ ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ ｉｎ ｈｏｒｓｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎ⁃
ｔｉａｌ ｌｉｎｋｓ ｔｏ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌａｍｉｎｉｔｉｓ． ＢＭＣ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
２０１２， ８： ２３１
［８２］　 Ｒｏｓｓｅｌｌｏ⁃Ｍｏｒａ Ｒ， Ａｍａｎｎ Ｒ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ
ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２００１， ２５：
３９－６７
［８３］ 　 Ｗａｎｇ Ｙ， Ｑｉａｎ ＰＹ． Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
１６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ
ＤＮＡ ａｍｐｌｉｃｏｎｓ ｉｎ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ，
２００９， ４（１０）： ｅ７４０１
［８４］　 Ｊｅｓｕｓ ＥＣ， Ｓｕｓｉｌａｗａｔｉ Ｅ， Ｓｍｉｔｈ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍ⁃
ｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｏｆ ｂｉｏｆｕｅｌ ｃｒｏｐｓ ｇｒｏｗｎ ｏｎ
ｍａｒｇｉｎａｌ ｌａｎｄｓ ａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｐｙｒｏｓｅ⁃
ｑｕｅｎｃｅｓ． ＢｉｏＥｎｅｒｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１０， ３： ２０－２７
［８５］　 Ｇｕｏ Ｆ， Ｊｕ Ｆ， Ｃａｉ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆ⁃
ｆｅｒｅｎｔ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａｎｎｏ⁃
ｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉ⁃
ｃａｌ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１３， ８ （ １０）：
ｅ７６１８５
［８６］　 Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ Ａ， Ｐｒｕｅｓｓｅ Ｅ， Ｓｃｈｗｅｅｒ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ
ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ
ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ ｎｅｘｔ⁃ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ⁃ｂａｓｅｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１３， ４１： ｅ１， ｄｏｉ： １０．
１０９３ ／ ｎａｒ ／ ｇｋｓ８０８
［８７］　 Ｗａｎｇ Ｑ， Ｇａｒｒｉｔｙ ＧＭ， Ｔｉｅｄｊｅ ＪＭ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｉｖｅ Ｂａｙｅｓｉａｎ
ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｏ
ｔｈｅ ｎｅｗ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔａｘｏｎｏｍｙ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００７， ７３： ５２６１－５２６７
［８８］　 Ｌｉｕ ＺＺ， ＤｅＳａｎｔｉｓ ＴＺ， Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＧＬ， ｅｔ ａｌ． Ａｃｃｕｒａｔｅ
ｔａｘｏｎｏｍｙ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｐｒｏ⁃
ｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００８， ３６： ｅ１２０， ｄｏｉ： １０．１０９３ ／ ｎａｒ ／ ｇｋｎ４９１
［８９］　 Ｆａｂｒｉｃｅ Ａ， Ｄｉｄｉｅｒ Ｒ． Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｕｓｉｎｇ
１６ｓ ｒｒｎａ ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００９， ２： ７４－９２
［９０］　 Ｍｅｙｅｒ ＡＦ， Ｌｉｐｓｏｎ ＤＡ， Ｍａｒｔｉｎ ＡＰ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｄ⁃ｔｏｌｅｒａｎｔ ａｌｐｉｎｅ ｓｏｉｌ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｅｎｓｕ ｓｔｒｉｃｔｏ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００４， ７０： ４８３－４８９
［９１］　 Ａｌｍ ＥＷ， Ｏｅｒｔｈｅｒ ＤＢ， Ｌａｒｓｅｎ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ⁃
ｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅ ｄａｔａｂａｓｅ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏ⁃
ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９６， ６２： ３５５７－３５５９
［９２］　 Ｂｒｏｓｉｕｓ Ｊ， Ｐａｌｍｅｒ ＭＬ， Ｋｅｎｎｅｄｙ ＰＪ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， １９７８， ７５：
４８０１－４８０５
［９３］　 Ｐｒｕｅｓｓｅ Ｅ， Ｑｕａｓｔ Ｃ， Ｋｎｉｔｔｅｌ Ｋ， ｅｔ ａｌ． ＳＩＬＶＡ： Ａ ｃｏｍ⁃
ｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｏｎｌｉｎｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｈｅｃｋｅｄ ａｎｄ
ａｌｉｇｎｅｄ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ
ＡＲＢ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００７， ３５： ７１８８－７１９６
［９４］　 Ｇｉｏｎｇｏ Ａ， Ｄａｖｉｓ⁃Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＡＧ， Ｃｒａｂｂ ＤＢ， ｅｔ ａｌ． Ｔａｘ⁃
Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ： Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｃｕｒｒｅｎｔ １６ｓ ｒｒｎａ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｒａｐｉｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｔ ｓｉｘ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｌｅｖｅｌｓ． Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，
２０１０， ２： １０１５－１０２５
［９５］　 Ｗｅｒｎｅｒ ＪＪ， Ｋｏｒｅｎ Ｏ， Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ
ｔｒａｉｎｉｎｇ ｓｅｔｓ ｏｎ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
１６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｕｒｖｅｙｓ． Ｔｈｅ ＩＳＭＥ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０１２， ６：
９４－１０３
［９６］　 Ｓｃｈｌｏｓｓ ＰＤ， Ｇｅｖｅｒｓ Ｄ， Ｗｅｓｔｃｏｔｔ ＳＬ． Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ
ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｒｔｉｆａｃｔｓ ｏｎ
１６Ｓ ｒＲＮＡ⁃ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｉｅｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１１， ６ （ １２）：
ｅ２７３１０
［９７］　 Ｍｉｚｒａｈｉ⁃Ｍａｎ Ｏ， Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ＥＲ， Ｇｉｌａｄ Ｙ． Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ
ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｓｈｏｒｔ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｓ： Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｄｅｓｉｇｎｓ．
ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１３， ８（１）： ｅ５３６０８
［９８］　 Ｏｎｇ ＳＨ， Ｋｕｋｋｉｌｌａｙａ ＶＵ， Ｗｉｌｍ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｄｅｎｔｉ⁃
ｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ
ｕｓｉｎｇ ｓｈｏｔｇｕｎ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ａｍｐｌｉ⁃
ｃｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１３， ８（４）： ｅ６０８１１
作者简介　 张军毅，男，１９８２年生，博士研究生． 主要从事高
通量测序和宏基因组学研究． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｂｌｏｃｋｓｈａｒｏｎ＠ １６３．ｃｏｍ
责任编辑　 肖　 红
３５５３１１期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 张军毅等： 基于分子标记的宏基因组 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因高变区选择策略