全 文 ：第 12卷 第 3期
2 0 0 4年 7月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco-Agriculture
Vo1．12 No．3
July， 2004
植物细胞质雄性不育分子生物学研究进展
孔祥海
(龙岩师范高等专科学校 龙岩 364000)
摘 要 阐述了植物细胞质雄性不育相关的线粒体嵌合基因结构、起源、作用机理及其离体表达，花粉发育特异基
因表达，导致植物细胞质雄性不育因素，植物细胞质雄性不育恢复育性等方面分子生物学研究进展，简介了现代基
因工程构建细胞质雄性不育系的策略。
关键词 植物 细胞质雄性不育 嵌合基因 特异基因 基因表达
Research aflvanee in the molecular biology of cytoplasmic male sterility in plants．KONG Xiang-Hai(Longyan Normal
Colege，Longyan 364000)，CJEA，2004，12(3)：35～39
Abstract The progress on the molecular biology of cytoplasmic male sterility in plants is summarized in this paper，in—
cluding the structure，OH。gin，action mechanism，and the out-of express of chimeric gene；the other factors which cause
cytoplasmic male sterility emerging；the expression of specific gene in the development of poUen；fertility restoration；the
scheme of composing cytoplasmic male sterility by gene eng ineering re~．alches．
Key wolds Plant，Cytoplasmic male sterility，Chimeric gene，Specific gene，Gene express
植物不能产生正常的花药、花粉或雄配子称为雄性不育(Male sterility)，植物雄性不育可分为遗传性和
非遗传性两大类，遗传性雄性不育根据遗传背景划分为细胞核雄性不育、细胞质雄性不育或胞质雄性不育与
核质互作型雄性不育。植物雄性不育在杂交育种中可以免去人工去雄的繁杂工作、提高杂交种子纯度和保
证杂种 1代的增产效应而倍受青睐。
1 细胞质雄性不育的特性
细胞质雄性不育是一种不能产生有活力或可育花粉的母性遗传现象，其遗传方式不符合孟德尔规律。
细胞质雄性不育是高等植物普遍存在现象，目前已在近 200种植物中发现细胞质雄性不育现象，其中有
50％以上为自发形成，约 20％发生在种内杂交过程中，其余在种间杂交过程中产生。细胞质雄性不育显著
特点是在其有性生殖过程中雄配子败育，表现为形态结构在后期小孢子内壁加厚过程受阻，小孢子大量破
坏，不能形成饱满的花粉粒如洋葱；生理生化方面花药中蛋白质合成途径被破坏，蛋白氮总量显著下降，醇溶
性氮(特别是酰胺态氮)含量大幅上升 j¨，而它的雌配子发育不受任何影响。由于它在杂交育种中具有突出
优势，同时又是遗传学研究中核、质问相互作用的重要理论课题，而引起有关研究人员的广泛兴趣 j，近年来
取得可喜的研究进展，分子生物学研究表明细胞质雄性不育的产生与植物线粒体基因组中嵌合基因(Chim—
eric gene)有关，还涉及核、质相互作用、环境因素以及线粒体基因表达的调控等多种因素。
2 线粒体嵌合基因
线粒体嵌合基因结构。目前通过比较限制性内切酶水解线粒体基因组的DNA所得到的物理图谱研究
来鉴别雄性不育系、保持系及恢复系育性恢复株的线粒体基因及其表达特征，而获得与细胞质雄性不育有关
的线粒体 DNA序列，在一些作物中已获得几个关键序列，如玉米(cms—T、cms—S)、油菜(cms—Pol、cms—Ogu、
cms—Nap)、高粱(cms—A3)、水稻 cms—Bt)、菜豆 cms—Ci)和向日葵(CFD_S—Pet1)的植物线粒体嵌合基因DNA片
段(见图 1) 。玉米“cms—T”中嵌合基因 T—urfl3是通过 2个互为补充方法析出，即通过与T型细胞质线粒
体特异转录物家族杂交鉴定出1个线粒体 DNA片段，序列分析表明该基因区包含 2个开放阅读框即T-urfi3
和与T-urfi3共同转录的or1221；通过诱导和培养“cms-T”线粒体突变使之恢复育性。在这些突变体同源
*世界银行贷款“贫三”项目资助
收稿 日期：2003—02-16 改回 日期 ：2003—03—18
中 国 生 态 农 业 学 报 第 12卷
重组中缺失了T—urfl3阅读框来确定的，其结构含有与atp6基因5’侧翼区、rrn26基因3’侧翼区非常相似的
序列以及部分 rrn26基因的编码区(见图 1)。
簦墨查
(A)玉米 (cms—T)
rm263-侧翼 rm26编码区
(B)玉米 (cms—S) R重复序列
(C)油菜 (cms·PoI)
{L．-_[ 到
(D)油菜 (cms—Nap)
(E)油菜(cms—Ogu)
(F)水稻(cms—Bt)
RI episome atp9
orfB编码区 v trnfM
Q 型 I卜__
15％点突变 nad5c
_I l !璺丝
trn
(G)高粱 (~ms—A3)
(H)菜豆(ems—Ci)
(I)向日葵(cms—Pet1)
5’atp9
— — — —工 五豆二卜_
图 1 9种作物线粒体基因组与细胞质雄性不育相关的嵌合基因区域(仿Sdmable and Wise)
Fig．1 The CMS chimeric gene region in mitochondrial genome of nine crop
线粒体嵌合基因。关于线粒体
嵌合基因的起源有2种观点，一种观
点认为嵌合基因是线粒体基因组发
生重组形成的，其原因多数研究者
认为线粒体基因组是 1个裸露的共
价闭合环状 DNA分子，其特点是具
有活跃的重复序列可在分子内与分
子问重组，在已知线粒体 DNA结构
中的基因排列均不相同，其复制方
式虽与核基因组相似，但时间是在
期，复制起始点是它随机附着在
线粒体内膜上位置，易因其线状交
叉发生重组；且在线粒体环状 DNA
中有一些短的同源序列，这些成分
之问进行重组结果产生一些小的亚
基因组环状分子；线粒体基因组与
核基因组也有同源 DNA序列共同
存在，它们之间可相互转移_1引；此外
线粒体增殖是通过已有的线粒体生
长后以间壁分离、缢缩分离和出芽
的方式进行，同时它还 能彼此融
合 J，在此过程中也极易发生重组。
而另一种观点认为嵌合基因是进化
的结果，比较雄性可育油菜“Cam—S”
和“cms—Pol”的线粒体基因组发现，紧靠 atp6基因上游处“cms—Pol”多出1个4500bp片段，该片段含有 1个与
atp6基因共同转录的嵌合基因，同时在 atp6基因上游缺少 1个约 1000bp片段。在普通油菜“Nap”中也发现
存在这个 4500bp片段，所不同是该片段在“cms—Pol”中表达，而在“Nap”中不表达，故研究人员认为“Nap”与
“cms-Pol”的共同祖先也具有该片段。由于“Nap”与“cms-Pol”的基因组之间有更近的亲缘关系，这似乎表明
这个4500bp片段在进化过程中从“Nap”传至“Pol”，然后在“Pol”与“Cam”分支时丢失了 ，故认为嵌合基因
是进化的结果。
线粒体嵌合基因的作用机制。许多细胞质雄性不育系统中发现的嵌合基因结构有共同点，即具有 1个
开放阅读框(OI )和 1个ATP合成酶亚基基因(线粒体内膜上 ATP合成酶有 9个亚基，其中4个亚基是由
线粒体基因组编码，其余亚基由核基因组编码)，二者紧密相邻，构成共同转录。但不同植物中细胞质雄性不
育的嵌合基因具有多样性。如在“C1TIS—Pol”中1个阅读框 orf224、atp6基因和 1个 4500bp片段构成油菜细胞
质雄性不育的嵌合基因。Forde(1980)等对玉米“cms-W”、“C1TIS—C”、“cms—S”、“C1TIS—Ep”类型线粒体进行离体
蛋白质翻译研究发现，在玉米“C1TIS—T”线粒体中存在 1个由T—urfl3基因编码的 13kD特异蛋白质，称为T-多
肽，而正常细胞质线粒体合成的 21kD特异蛋白质，T-多肽特点是表达受到恢复基因抑制；可与线粒体内膜
上许多复合物结合。Levings将克隆的 T-urfl3基因转移到大肠杆菌中获得表达发现，蛋白质位于大肠杆菌
菌膜上，细菌生长和呼吸受到毒素控制，且这种抑制作用与玉米型细胞质线粒体受到T毒素作用完全相似，
这表明 T-多肽本身是 1种毒蛋白，该基因在玉米“(21TIS—T”根、穗、叶和花中均有表达，在花药发育过程中花药
绒毡层细胞对T—urfl3基因编码的T一多肽毒性反应最敏感。而陈喜文等对线粒体基因表达的研究发现，可
育花粉中线粒体基因表达活跃，RNA浓度很高；蛋白质分析结果表明花中线粒体数目高于叶中，这说明花药
发育过程中需较多的、活性较高的线粒体。因此，Levings认为 T一多肽与线粒体内膜上特异蛋白发生结合，
第 3期 孔祥海：植物细胞质雄性不育分子生物学研究进展 37
影响了线粒体的活性。从嵌合基因共同结构来看，由于它含有 ATP合成酶的某个亚基基因，它编码的蛋白
质含有与ATP合成酶某个亚基相似结构，可以推测该蛋白作用部位是在 F0～F1 ATP复合物上，使酶活性受
损，结果线粒体合成 ATP数目减少，从而阻碍花粉正常发育，最终导致花粉育性改变；在形态解剖结构可表
现为绒毡层过度生长、高度液泡化、提早或延迟解体，最终导致细胞质雄性不育的形成。相反正常可育的植
物体花药绒毡层细胞能为花粉发育提供小孢子所需全部营养，适时分泌四分体解离所需的胼胝质酶，产生花
粉外壁前体物质，以保护花粉免受侵害。而其他作物中不同嵌合基因可能与不同编码 ATP合成酶不同亚基
的基因相关，如玉米“CTI1S—S”线粒体基因组中有 1个称为 R区的DNA重复区，该区包含 2个开放阅读框(见
图1)，若突变体在 R区重排可使花粉育性恢复。油菜线粒体基因组有几种与细胞质雄性不育相关的开放阅
读框，研究认为油菜“cms—Pol”与可育的“Cam”线粒体基因组中有 1个围绕 atp6基因的重排区域，即与细胞
质雄性不育相关的orf224／atp6基因位点，且仅存在于油菜“cms—Pol”中。进一步研究表明该基因位点在带育
性恢复基因植株与油菜“cms-Pol”植株中转录加工不同，而在油菜“cms—Ogu”的相关基 因是 orf138与
atp6 L1
，
“ cms-Nap”相关基因是 orf222与 atp6¨ 。在高粱“cms—A3”的相关嵌合基因开放阅读框中与 orfl07
均含有编码 ATP合成酶亚基基因atp9 L1 。季静等 认为在向日葵“cms—Petl”中atpA基因3’端插入 1个开
放阅读框 orf522，orf522与 atpA(编码 ATP合成酶a亚基基因)共同转录该 a亚基因的改变与向日葵形成细
胞质雄性不育有直接关系。Akagi等(1995)认为在水稻“cms—Bt”atp6基因第二拷贝的下游有一特异与细胞
质雄性不育相关的片段 orf79，它与雄性不育有关。Abade等(1995)认为在菜豆“cms—Ci”pvs中所包含的2个
阅读框 oH239和 orf98，前者与细胞质雄性不育相关。故进一步重点研究与线粒体基因组中负责编码 ATP
合成酶各亚基基因atpA、atp6、atp9、atpa相连的基因DNA片段是明确嵌合基因作用机理的关键。
线粒体嵌合基因离体表达。通过对线粒体嵌合基因离体表达产物的比较可排除核基因表达产物作为转
录调控因子对线粒体基因组转录、翻译等表达过程的影响，进而探讨线粒体嵌合基因表达产物与细胞质雄性
不育的关系。有关这方面的研究始于 Levings将克隆的r．urf13基因转移到大肠杆菌中获得表达，并分析鉴
定出T—urfl3为 13kD的特异毒性蛋白，尔后 Sarria R．等L1纠用纯化的菜豆黄花苗线粒体进行离体表达，观察
到oH239蛋白在加入 1种蛋白酶(该蛋白酶在离体条件下对翻译产物有水解蛋白功能)抑制时产生积累，而
在不育营养器官中未检测到 oH239翻译表达产物的原因是 oH239多肽在植物体或细胞内快速周转所致。
蔡陈棱等L5 在水稻、萝 卜等作物找到与细胞质雄性不育相关的多肽。另有研究表明一些植物线粒体 DNA
序列转录产生的RNA编辑过程中碱基 C转变为A，从而产生新的起始或终止密码子最终改变预期的与细
胞质雄性不育相关的开放阅读框序列。但目前研究人员尚未找到不同细胞质雄性不育植物线粒体体外合成
产物中共同差异带，这表明不同细胞质雄性不育植物或同种植物不同细胞质雄性不育类型之间的不育机理
均可能不同。Conley C．A．等报道线粒体功能发生障碍可使绒毡层细胞发育受阻，从而导致细胞质雄性不育
的产生。线粒体发生功能障碍后如何影响花药或花粉发育过程及其生理生化代谢途径等细胞质雄性不育产
生的分子机理尚待进一步研究。
3 导致细胞质雄性不育的其他因素
细胞质雄性不育中的核质互作。目前研究人员已在许多植物核染色体中找到控制线粒体基因组结构和
基因表达方式的基因，如玉米细胞核中的基因rf1表达产物 RF1(恢复因子)作用在 T-urfl3转录后的剪接过
程，使T一多肽在细胞中浓度降低 80％，而另外 1个基因COX工转录的大小、数目也受到核基因的影响，其核质
互作表现为花药组织细胞中缺少肌动蛋白，不能形成小孢子正常细胞骨架而导致花粉败育；水稻中线粒体基
因atp6转录后成熟过程同样受到核基因的影响l1 ·”]。核基因的作用方式各异，且其本质和功能及机理尚未
明晰，但它们均影响线粒体基因组结构和表达方式，即在细胞质雄性不育的表型产生中发挥重要作用。
细胞质雄性不育中的环境因素。影响细胞质雄性不育表型的环境因素很多，如光照、温度和光周期等。
Murai K．等(1995)报道 1种光周期敏感细胞质雄性不育(Photoperiod—sensitive cytoplasmic male sterility，
PCMS)的异质小麦即 cr-N26，它在长日照条件(光照 15h或更长)下表现出完全不育，短日照条件(<15h)下
则表现为高度雄性可育。Ogihara Y．等(1997)认为异质小麦雄性不育的发生是光照时间影响其核基因的表
达，进而诱导线粒体基因组结构和基因表达方式的改变，导致细胞质雄性不育的产生。徐乃瑜等 通过 D2
型细胞质的粗厚山羊草(Aegilops crasa)一中国春、牡山羊草(A．juvenalis)一中国春和瓦维洛夫山羊草
中 国 生 态 农 业 学 报 第 12卷
(A．vavilovii)一中国春分别与普通小麦品种连续回交核置换获得异质细胞质雄性不育品系，对这些品系小
穗原基形成始期进行 24h长光照处理其花粉高度不育或完全不育；而小花分化期进行 15．5h长光照处理导
致花粉败育不实的作用已大大降低，故认为 15．5h长光照可能不是临界光长，小花分化期也可能不是发育的
临界分化期，这种异质小麦光周期敏感细胞质雄性不育实质是在一定环境条件下与核、质和光周期三者问互
相作用密切相关。“cr-N26”与 Aegilops crasa Southern杂交结果表明，线粒体 atp6、coxni、o1425等基因结构
存在差异，说明核染色体携带有调控线粒体基因组结构的基因；Northern的杂交结果显示异质小麦线粒体
基因表达方式与亲本小麦表达不同，如 o1425基因在异质小麦中转录后的片段为 ll00bp，而在 Triticum aes—
tivum和A．crassa中为800bp，这均说明线粒体基因组结构和基因转录方式的改变是核基因诱导的结果 j。
4 细胞质雄性不育中花粉发育期基因的特异表达
杂交动力学研究发现，玉米、油菜、烟草、拟南芥、紫露草和番茄等成熟花粉中有 15％左右的mRNA为
小孢子发育所特有，而负责转录这些 mRNA的基因则成为特异基因，它们可依据表达的时间分为早期基因
与晚期基因，早期基因一般在减数分裂后迅速被激活，如油菜 A3、A8、A9和Bp4，烟草 TA13、TA20、TA29和
6等；晚期基因则在小孢子有丝分裂后表达，如番茄 Lat51和 Lat52、玉米 Zml3及油菜 I3等，其表达部
位可为花药开裂处、绒毡层、花药壁和花粉母细胞，甚至是花瓣和心皮等，表达产物分别为脂转移蛋白、花粉
壁蛋白、果胶质裂解酶、抗坏血酸氧化酶和蛋白酶抑制剂等，且有资料表明这类基因的活性可能集中在营养
细胞内 。
5 细胞质雄性不育恢复育性
细胞质雄性不育恢复育性的价值在于育种中通过恢复其育性，使其具有优良性状的亲本而不会因雄性
不育或杂交造成丢失；这可从相反方面进一步弄清细胞质雄性不育机理。近年来研究人员用遗传学方法克
隆出1个育性恢复基因rf2之后，Wen L．Y．u副等利用它来恢复玉米“cms—S”的育性，然后通过比较“cms—S”
的败育花粉和育性恢复株可育花粉在 orf355 orf77位点转录物的积累结果发现，在 rf3育性恢复基因作用
下产生了新的较短的转录物，且在 rf3等位基因存在下新转录物与雄性育性共同分离，故认为等位基因对雄
性不育线粒体基因进行了编辑或调控。Howad W． 等研究高粱“cms—A3”时发现其 atp6基因在花药的编
辑量远低于保持系，而在苗期则相反，这表明该基因编辑量的增加导致育性恢复，即组织特异性的 RNA编
辑也使与细胞质雄性不育相关序列在小孢子形成期造成伤害。Bellaoui M．等l2。。运用细胞融合技术使油菜
“ CITI8一Ogu”恢复育性，而找到与恢复育性有关的基因 rf0。并进一步研究育性恢复基因 rfO与细胞质雄性不
育相关的蛋白orf138的关系实验结果推测，rfo基因产物使 orf138蛋白稳定性降低，导致该蛋白积累减少，
最终使油菜“cms-Ogu”恢复育性。根据已有的实验结果对细胞质雄性不育恢复育性的机理曾提出新陈代谢
学说与相互作用学说 2种假说，但在许多方面如基因及其表达产物生化特性的精确了解和克隆基因方法等
有待于进一步完善，以彻底明确其机理。
6 在育种中构建细胞质雄性不育系的策略
植物形成细胞质雄性不育过程中从线粒体基因组结构、嵌合基因的表达、绒毡层分泌的胼胝质酶以及各
种环境因素的调控等环节均可供人们利用。朱玉贤等 根据文献分析提出 3种可行策略：即将花粉或花药
特异启动子、细胞毒素基因以及转录终止子 3部分组装构建成嵌合基因并转化植物，细胞毒素的特异时空表
达能选择性地破坏与花药发育相关的某些器官或组织，阻断其发育进程，导致雄性不育。李竞雄等 总结了
基因表达载体构建的技术路线，李胜国 等将 TA29一barnase导人油菜和烟草获得雄性不育转基因植株，沈
革志等n们采用同样方法成功获得甘蓝雄性不育转基因植株；通过反义 RNA技术阻断与花粉发育有关基因
的表达以获得雄性不育植株，如chs基因的反义RNA基因与 CaMV35S启动子及花药特异序列串联成嵌合
基因，导人矮牵牛植株以获得雄性不育植株，将与致病性相关的B一1，3一葡聚糖酶基因分别与拟南芥A花粉发
育早期启动子A9或 A3融合，转化矮牵牛获得不同程度的雄性不育植株。这些方法和策略在其他植物，特
别是农作物的应用是否可行尚待进一步探索。
参 考 文 献
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