全 文 ：收稿日期:2015-01-20
基金项目:安徽中医药大学科学研究基金(2015fy003)
作者简介:高家荣(1964-) ，男，硕士，主任药师，研究方向:中药新药研发;Tel:13075537705，E-mail:zyfygjr2006@ 163. com。
道地产补骨脂-肉豆蔻药对中 7 个指标成分同时
测定及其化学成分的初步鉴别
高家荣1，杨晓旭2，吴 溪1，魏良兵1，韩燕全1，宋俊梅2
(1. 安徽中医药大学第一附属医院 /国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽 合肥 230031;2. 安徽中
医药大学药学院，安徽 合肥 230038)
摘要 目的:同时测定道地产补骨脂-肉豆蔻药对中 7 个指标成分含量，并对其化学成分进行初步归属和鉴定。
方法:高效液相色谱法测定条件:Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm ×2. 1 mm，1. 7 μm) ;流动相为乙腈-
水，梯度洗脱;流速 0. 25 mL /min;进样量 2 μL;柱温 30 ℃;检测波长 254 nm。液质联用法测定条件:Waters HSS T3
色谱柱(100 mm ×2. 1 mm，1. 7 μm) ，采用电喷雾电离离子源;正离子模式检测:m/z 500 ～ 1 200，毛细管电压为 3. 0
kV;锥孔电压为 22 kV;离子源温度为 110 ℃;脱溶剂温度为 450 ℃;脱溶剂气体流速为 800 L /h;锥孔气流量 50 L /
h。结果:各指标成分在选定的浓度范围内线性关系良好，加样回收率为 95. 07% ～ 98. 16%，ＲSD 为 1. 23% ～
1. 97%。结论:该试验为道地产补骨脂-肉豆蔻药对的质量控制和深入研究奠定了基础。
关键词 道地产补骨脂-肉豆蔻药对;多指标成分;超高效液相色谱;四极杆飞行时间质谱;物质基础
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)09-1959-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 09. 039
Simultaneous Determination of Seven Chemical Markers and Preliminary Identification of
Chemical Constituents in Daodi Psoraleae Fructus-Myristicae Semen Chinese Drug Pair
GAO Jia-rong1，YANG Xiao-xu2，WU Xi1，WEI Liang-bing1，HAN Yan-quan1，SONG Jun-mei2
(1. First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine，State Administration of Chinese Medicine Preparation Three Labo-
ratories，Hefei 230031，China;2. College of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230038，China)
Abstract Objective:To study the simultaneous determination method of daodi Psoraleae Fructus-Myristicae Semen Chinese drug
pair for the seven ingredients，and Psoraleae Fructus-Myristicae Semen Chinese drug pair on the chemical composition of initial owner-
ship and identification. Methods:UPLC BEH C18 column(2. 1 mm × 100 mm，1. 7 μm)was used in the determination. The flow rate was
kept at 0. 25 mL /min，and 2 μL of standard and sample solution were injected in each run. The mobile phase was consisted of acetoni-
trile and water using a gradient elution. The UPLC /Q-TOF MS condition:Waters HSS T3(100 mm ×2. 1 mm，1. 7 μm) ;capillary volt-
age 3. 0 kV(positive ion mode)and 2. 5 kV(negative ion mode) ;Mass spectrometric detection was carried out on a Waters Xevo G2 Q /
TOF mass spectrometer equipped with an ESI source operating in both positive and negative ion modes. The parameters of the mass
spectrometer under the ESI mode were as follows:ion source temperature 110 ℃，cone gas flow 50 L /h，desolvation gas temperature 450
℃，desolvation gas flow 800 L /h. Ｒesults:The seven chemical markers in the selected linear range had good linearity. The recoveries
were in the range of 95. 07% ～ 98. 16% and ＲSDs were between 1. 23% ～ 1. 97%. Conclusion:It is suitable for the quality control and
further studies of the herb in vivo of daodi Psoraleae Fructus-Myristicae Semen Chinese drug pair.
Key words Daodi Psoraleae Fructus-Myristicae Semen Chinese drug pair;Multiple chemical markers;Ultra performance liquid
chromatography(UPLC) ;Quadrupole-time-of-flight mass spectrometry(Q-TOF MS) ;Chemical material basis
“药有个性之特长，方有合群之妙用”，补骨脂
与肉豆蔻作为温肾暖脾、涩肠止泻药对配伍，最早出
自宋·许叔微的《普济本事方》，时称“二神丸”〔1〕。
现临床常用中药复方二神丸、四神汤、四神丸等均含
有该药对，且在方中发挥主要药效作用〔2〕。补骨脂
中含有多种活性成分，其中香豆素类、黄酮类及单萜
酚类化合物是其主要活性成分。肉豆蔻中主要成分
为挥发油、脂肪油、苯丙素和木脂素等，近年来对于
肉豆蔻化学成分的研究国内外均有报道，发现了新
的新木脂素类化合物，并且有学者陆续发现肉豆蔻
及同属植物中均含有黄酮类成分。
本实验选取香豆素类化合物补骨脂素、异补骨
脂素，黄酮类化合物补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨
脂宁，单萜酚类化合物补骨脂酚，木脂素类化合物去
氢二异丁香酚，采用 UPLC-PDA技术，建立同时测定
道地产补骨脂-肉豆蔻药对中 7 个指标成分的分析
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方法，并通过 UPLC /Q-TOF MS 技术得到多种成分
的分子量、元素组成及质谱碎片信息，旨在为多指标
成分评价道地产补骨脂-肉豆蔻药对质量提供依据。
1 仪器与材料
Waters Acquity UPLC 系统(Acquity UPLC QSM、
Acquity UPLC Sample Manager FTN、Acquity UPLC
PDA Detector 以及 Empower 2 工作站) ;超高效液相
串联四级杆飞行时间质谱联用仪(美国 Waters 公
司) ;Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm × 2. 1
mm，1. 7 μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100
mm ×2. 1 mm，1. 7 μm)色谱柱;采用电喷雾正、负离
子模式，数据采集采用 Masslynx 4. 1 软件;0. 22 μm
微孔滤膜(上海安谱科学仪器有限公司) ;BP211D
电子分析天平(德国赛多利斯公司) ;KQ3200B 型超
声波清洗器(昆山市超声仪器厂)。
补骨脂素(批号:110739-201115)、异补骨脂素
(批号:110738-201012)、去氢二异丁香酚(批号:
111838-201001)对照品均购自中国食品药品检定研
究院;补骨脂甲素(批号:JL140615002)、补骨脂宁
(批 号:JL140624004)、补 骨 脂 乙 素 (批 号:
JL140118008)、补骨脂酚(批号:JL140411012)对照
品均购自上海将来实业股份有限公司，7 种对照品
的质量分数均 ≥ 98. 0%，供含量测定所用。实验
用补骨脂、肉豆蔻药材由安徽中医药大学第一附属
医院药房提供，均为道地药材(四川产盐补骨脂，批
号:1401051222;海 南 产 麸 煨 肉 豆 蔻，批 号:
1402151652) ，经安徽中医药大学第一附属医院李立
华主任药师鉴定均为合格药材。乙腈(色谱纯，美
国 Tedia公司) ;水为屈臣氏蒸馏水;其余试剂均为
分析纯。
2 方法与结果
2. 1 7 个指标成分的同时测定
2. 1. 1 供试品溶液的制备:称取盐补骨脂 24 g、麸
煨肉豆蔻 12 g，置 500 mL 圆底烧瓶中，用 8 倍量
60%乙醇水浴回流提取 2 次，每次 1 h，合并提取液，
浓缩至 50 mL，精密吸取浓缩液 0. 5 mL 置蒸发皿
中，水浴蒸干，残渣加甲醇超声(150 W，40 kHz)溶
解 30 min，加甲醇定容至 10 mL，0. 22 μm 微孔滤膜
滤过，即得补骨脂-肉豆蔻药对供试品溶液〔3〕。称取
盐补骨脂 24 g，按上述方法处理，即得补骨脂药材供
试品溶液;称取麸煨肉豆蔻 12 g，按上述方法处理，
即得肉豆蔻药材供试品溶液。
2. 1. 2 对照品溶液的制备:分别精密称取补骨脂
素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂宁、补骨脂乙
素、去氢二异丁香酚、补骨脂酚对照品适量，加甲醇
溶解定容，制成各对照品母液，冷藏，备用;再分别吸
取一定量对照品母液，加甲醇制成质量浓度分别为
补骨脂素 6. 4 μg /mL、异补骨脂素 5. 7 μg /mL、补骨
脂甲素 6. 0 μg /mL、补骨脂宁 5. 2 μg /mL、补骨脂乙
素 16. 5 μg /mL、去氢二异丁香酚 1. 5 μg /mL、补骨
脂酚 22. 4 μg /mL的混合对照品溶液。
2. 1. 3 色谱条件:Waters Acquity UPLC BEH C18色
谱柱(100 mm × 2. 1 mm，1. 7 μm) ;流动相为乙腈
(A)-水(B) ，梯度洗脱(0 ～ 3 min，3% A;3 ～ 15
min，3% ～30% A;15 ～ 35 min，30% ～ 85% A;35 ～
37 min，85% ～ 3% A;37 ～ 40 min，3% A) ;流速为
0. 25 mL /min;进样量为 2 μL;柱温为 30 ℃;检测波
长为 254 nm。
2. 1. 4 线性关系考察:分别精密吸取“2. 1. 2”项下
制备的混合对照品溶液 1、2、3、4、5、6 μL，进样测定
峰面积，以各色谱峰面积(Y)对其进样量(X)进行
线性回归，得回归方程，线性关系考察结果见表 1。
表 1 7 个对照品的线性关系考察结果
化合物 回归方程 相关系数 线性范围 /ng
补骨脂素 Y1 = 120000X1 + 426 0. 9998 6. 4 ～ 38. 4
异补骨脂素 Y2 = 170000X2 + 145. 27 0. 9998 5. 7 ～ 34. 2
补骨脂甲素 Y3 = 86161X3 － 208. 80 0. 9999 6. 0 ～ 36. 0
补骨脂宁 Y4 = 80118X4 － 233. 33 0. 9999 5. 2 ～ 31. 2
补骨脂乙素 Y5 = 130000X5 － 2483 0. 9999 16. 5 ～ 82. 5
去氢二异丁香酚 Y6 = 15446X6 － 28 0. 9999 1. 5 ～ 9. 0
补骨脂酚 Y7 = 730000X7 + 5991. 30 0. 9999 22. 4 ～ 134. 4
2. 1. 5 精密度试验:取混合对照品溶液 2 μL，连续
进样 6 次，补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补
骨脂宁、补骨脂乙素、去氢二异丁香酚、补骨脂酚峰
面积 的 ＲSD 分 别 为 0. 07%、0. 12%、0. 26%、
0. 14%、0. 17%、0. 80%、1. 25%，表明仪器精密度良
好。
2. 1. 6 稳定性试验:取同一供试品溶液 2 μL，在
0、2、4、8、12、24 h内进样测定，计算补骨脂素、异补
骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂宁、补骨脂乙素、去氢二
异丁香酚、补骨脂酚峰面积的 ＲSD 分别为 1. 38%、
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1. 15%、1. 45%、1. 20%、1. 17%、1. 25%、2. 12%，表
明供试品溶液中 7 种指标成分在 24 h 内稳定性良
好。
2. 1. 7 重复性试验:取同一供试品 6 份，分别按
“2. 1. 1”项下方法制备供试品溶液，在“2. 1. 3”项下
色谱条件测得补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、
补骨脂宁、补骨脂乙素、去氢二异丁香酚、补骨脂酚
质量分数的 ＲSD 分别为 0. 20%、0. 27%、0. 55%、
0. 34%、0. 69%、0. 65%、0. 85%，表明该方法重复性
良好。
2. 1. 8 加样回收率试验〔4〕:分别称取盐补骨脂 24
g、麸煨肉豆蔻 12 g，6 份，分别置 500 mL量瓶中，加
入各对照品母液适量，按“2. 1. 1”项下方法制备供
试品溶液，按“2. 1. 3”项下色谱条件测定，计算得补
骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂宁、补骨脂
乙素、去氢二异丁香酚、补骨脂酚的平均加样回收率
分 别 为 95. 11%、97. 14%、96. 27%、97. 86%、
98. 16%、97. 92%、95. 07%，ＲSD 分别为 1. 23%、
1. 27%、1. 34%、1. 81%、1. 85%、1. 88%、1. 97%。
2. 1. 9 指标成分的测定:按照“2. 1. 3”项下色谱条
件，分别精密吸取混合对照品溶液、3 组供试品溶液
各 2 μL，进样测定，记录色谱图(图 1) ，通过对照品
比对鉴定色谱峰，标记出来的峰 1 ～ 7 号分别为补骨
脂素(17. 751 min)、异补骨脂素(18. 268 min)、补骨
脂甲素(23. 815 min)、补骨脂宁(24. 811min)、补骨
脂乙素(27. 099 min)、去氢二异丁香酚(28. 071
min)和补骨脂酚(32. 961 min)。
2. 2 基于 UPLC /Q-TOF MS 技术对补骨脂-肉豆蔻
药对醇提液的初步分析
2. 2. 1 供试品溶液的制备:同“2. 1. 1”项下操作。
2. 2. 2 对照品溶液的制备:同“2. 1. 2”项下操作。
2. 2. 3 液相条件:Waters HSS T3(100 mm × 2. 1
mm，1. 7 μm)色谱柱，流动相为乙腈-0. 1%甲酸溶
液，梯度洗脱(0 ～ 1 min，0% A;1 ～ 7 min，0% ～
60% A;7 ～ 10 min，60% ～ 100% A;10 ～ 14 min，
100%A) ;流速为 0. 3 mL /min;进样量为 2 μL;柱温
为 50 ℃。
2. 2. 4 质谱条件〔5〕:采用电喷雾电离离子源
(ESI) ，准确质量数用亮氨酸脑啡肽作校正液。正
离子模式检测:m/z 500 ～ 1 200，毛细管电压为 3. 0
kV，锥孔电压为 22 kV，离子源温度为 110 ℃，脱溶
剂温度为 450 ℃，脱溶剂气体流速为 800 L /h，锥孔
气流量 50 L /h。负离子模式检测:m/z 500 ～ 1 200，
毛细管电压为 2. 5 kV，锥孔电压为 22 kV，离子源温
度为 110 ℃，脱溶剂温度为 450 ℃，脱溶剂气体流速
图 1 混合对照品(A)、补骨脂-肉豆蔻药对(B)、肉豆蔻
药材(C)及补骨脂药材(D)的 UPLC图
1. 补骨脂素 2. 异补骨脂素 3. 补骨脂甲素 4. 补骨脂
宁 5. 补骨脂乙素 6. 去氢二异丁香酚 7. 补骨脂酚
为 800 L /h，锥孔气流量 50 L /h。补骨脂-肉豆蒄药
对的 UPLC /Q-TOF MS的正、负离子模式图见图 2。
2. 2. 5 质谱数据分析:质谱数据采用 Mass Lynx V
4. 1 软件进行峰提取、峰对齐及归一化等处理，将混
合对照品与供试品的指标成分进行匹配。结合文献
和本实验室 Mass Lynx 工作站 Exact Mearch(EMS)
软件质谱数据库检索，对已知化合物进行鉴定以及
未知化合物的初步鉴定〔6〕。除混合对照品外，其他
成分根据正准分子离子峰的精确分子质量，应用
Analyst QS 质谱分析软件在规定的误差范围内计算
可能的元素组成(误差 ＜ 5 ppm) ，确定化合物的分
子量和可能分子式通过高能量扫描时产生的碎片离
子明确碎片的元素组成，结合化合物的碎片峰信息、
归属信息〔7，8〕及各单味药已有报道的化学成分信
息，推测未知化合物色谱峰可能的化学式，结果见表
2。
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图 2 补骨脂-肉豆蔻药对的 UPLC/Q-TOF MS分析
A. 正离子模式图 B. 负离子模式图
表 2 补骨脂-肉豆蔻药对提取物正离子模式下的成分鉴定
峰号
保留时间
/min 分子式
分子量测量值
［M + H］+ /Da
分子量理论值
［M + H］+ /Da 偏差
/ppm 鉴定化合物 归属
1 6. 69 C11H6O3 187. 0395 187. 0397 1. 1 补骨脂素 补骨脂
2 6. 83 C11H6O3 187. 0395 187. 0398 1. 6 异补骨脂素 补骨脂
3 7. 93 C20H20O4 325. 1440 325. 1439 － 0. 3 补骨脂甲素 补骨脂
4 8. 36 C20H16O4 321. 1127 321. 1126 0. 3 补骨脂宁 补骨脂
5 8. 81 C20H20O4 325. 1440 325. 1442 0. 6 补骨脂乙素 补骨脂
6 9. 19 C20H22O4 327. 1596 327. 1601 1. 5 去氢二异丁香酚 肉豆蔻
7 10. 26 C18H24O 257. 1905 257. 1901 1. 6 补骨脂酚 补骨脂
8 7. 68 C21H27O6 375. 1820 375. 1883 1. 2 肉豆蔻异木脂素 肉豆蔻
9 9. 02 C10H13O2 165. 0915 165. 0912 － 0. 1 丁香酚 肉豆蔻
10 8. 19 C11H13O3 193. 0885 193. 1222 2. 0 肉豆蔻醚 肉豆蔻
11 8. 13 C12H17O3 209. 1179 209. 1180 0. 1 榄香脂素 肉豆蔻
12 6. 43 C15H9O5 269. 0447 269. 0451 － 0. 3 香豆雌酚 补骨脂
13 7. 75 C20H19O4 323. 1287 323. 1294 0. 4 新补骨脂异黄酮 补骨脂
14 9. 29 C20H19O4 323. 1292 323. 1294 0. 9 补骨脂色烯查耳酮 补骨脂
15 9. 37 C20H23O4 327. 1588 327. 1590 － 0. 8 去氢二异丁香油酚 肉豆蔻
16 7. 51 C20H17O5 337. 1070 337. 1073 0. 6 补骨脂色烯黄酮 补骨脂
17 7. 94 C20H19O5 339. 1238 339. 1236 0. 6 corylifol C 补骨脂
18 7. 47 C20H21O5 341. 1385 341. 1382 － 0. 4 corylifol B 补骨脂
19 9. 67 C21H23O4 339. 1596 339. 1595 0. 1 补骨脂查耳酮 补骨脂
3 讨论
由于 7 种被测化合物的紫外最大吸收波长均不
相同，通过阵列二极管检测器得到的各化合物光谱
图可知在 254 nm 均有吸收，在药对供试品色谱中基
本能兼顾各成分色谱峰的丰度，因此选择 254 nm为
检测波长。
中药具有多成分、多靶点协同作用的特点，通过
建立多指标成分的含量测定方法，实现对多个指标
成分的控制，有助于中药质量标准的更全面的控制。
本文建立 UPLC-PDA 同时测定道地产补骨脂-肉豆
蔻药对中 7 个指标成分含量的方法，经方法学验证
具有灵敏度高、重复性好等优点，结果表明该方法适
用于道地产补骨脂-肉豆蔻药对的质量控制，为完善
和丰富该药对及含该药对的中药复方的质量标准提
供了科学依据。
实验采用 UPLC /Q-TOF-MS 技术对道地产补骨
脂-肉豆蔻药对提取物中的化学成分进行了分析测
定，在高效分离的基础上，测定了精确分子量及可能
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的元素组成，并进一步测定了正离子模式下的二级
质谱，分析裂解碎片〔9，10〕。本实验为进一步分析道
地产补骨脂-肉豆蔻药对的物质基础提供了实验依
据。
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