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陈雪峰 ,王　岳＊
(陕西科技大学生命科学与工程学院 ,陕西西安 710021)
摘　要:选取三种不同润湿性的固体材料:粗沙 、PA6和玻璃渣作为培养基质 ,分别以水 、BG11(含氮)和 BG110 (不含
氮)作培养液 ,通过测定发菜细胞的生物量变化及胞外多糖含量来确定最优培养条件 。实验结果表明 ,在培养足够长
的时间下 ,以 BG110作培养液 ,润湿性适宜的粗沙作固体培养基质较为适宜 。
关键词:发菜细胞 ,固体培养基质 ,润湿性 ,培养液 ,胞外多糖
StudyonthegrowthofNostocFlageliforme
onsolidbed-materialswithdiferentwetability
CHENXue-feng, WANGYue＊
(CollegeofLifeScienceandEngineering, ShaanxiUniversityofScienceandTechnology, Xi an710021 , China)
Abstract:TheN.flageliformecelwascultivatedonthreesolidbed-materialswithdiferentwetability, whichwere
sand, PA6 andglassresidue.Addedwater, BG11 andBG110 , thenthechangesofbiomassofN.flageliformeand
extracelularpolysaccharidewereinvestigatedtodesignthesuitablemedium.Theresultsindicated thatif
N.flageliformecelwascultivatedforareasonabletime, BG110 andmoderatewetabilityofsandwerethesuitable
medium.
Keywords:N.flageliformecel;solidbed-materials;wettability;medium;extracelularpolysaccharide
中图分类号:TS201.3　　　　文献标识码:A　　　　文 章 编 号:1002-0306(2010)05-0218-03
收稿日期:2009-06-04　＊通讯联系人
作者简介:陈雪峰(1964-),男 , 教授 ,从事食品加工工艺及食品新材
料制备方面的研究。
　　发菜是一种陆生菌 [ 1 ] ,生长在干旱 、半干旱地区
的部分荒漠草原和荒漠地带 ,具有很强的固氮能力 ,
对改良荒漠土壤结构具有重要意义 。发菜在其生长
过程中会向胞外分泌大量的多糖物质 ,发菜多糖具
有很高的亲水性 ,有利于发菜在干旱环境中的生长 ,
并能对其起到保护作用 [ 2 ] 。但由于发菜生长缓慢 ,资
源有限 ,为了能使野生发菜得到恢复 ,保护资源和环
境 ,有关发状念珠蓝细菌的大规模栽培一直受到关
注 。近年来 ,人们在发菜的分布 、生态 、生理生化及
人工液体培养途径等方面作了大量的工作。但对于
发菜细胞固体培养的研究却较少 ,仍然未有系统详
实的了解。于瑞红等认为 ,固体材料的表面性能对
生物细胞的粘附 、铺展 、增殖 、分化 、功能表达有很大
影响 [ 3 ] 。其中润湿性便是固体表面极为重要的一种
性质 ,但其如何影响发菜细胞的生长人们还不得而
知 ,有关这方面的研究也很少 ,本实验通过选择不同
润湿性的固体基质以及不同的培养液 ,对发菜细胞
生长状况及培养液中分泌的多糖含量进行了初步研
究 ,以期为发菜细胞的人工固体培养提供基础数据 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
发菜单体细胞 　发状念珠蓝细菌 (Nostoc
flageliforme)采集于宁夏银川贺兰山东麓 ,将发菜原
植体经光合活性恢复 ,匀浆法分离单体细胞 , 纯化
后 ,收集细胞 , 重新悬浮于新鲜 BG11培养基中 ,备
用;固体培养基质　选取粗沙(粒径 >0.83mm)、玻璃
渣(粒径 >0.83mm)和 PA6(尼龙 6)三种不同润湿性
的固体培养基 ,用水洗涤干净 ,烘干 ,添加量以平铺
至 Ф90mm培养皿 5mm高度为宜 ,即粗沙和玻璃渣
每培养皿用量 60g, PA6每培养皿 30g;培养液　考虑
到发菜生长环境比较恶劣 ,并且自身具有固氮能力 ,
选取水 , BG11(含氮)和 BG110(不含氮)三种培养液
进行固体培养 。
1.2　实验方法
1.2.1　固体基质接触角的测试　润湿性是固体表面
极为重要的性质 ,所谓润湿性是流体在固体表面扩
展或粘附的趋势 [ 4] 。固体表面的润湿性一般用表观
接触角来衡量 。
接触 角 (ContactAngle, CA)测定 在 德 国
Dataphysics公司生产的 OCA20光学视频接触角测量
仪上进行 ,注射针中液体注射速度为 0.5μL/s,注射
体积为 3.0～ 5.0μL。测定温度在室温下进行 , 25℃,
DOI :10.13386/j.issn1002-0306.2010.05.085
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水是去离子水。
样品制备:测试材料至少要提供 1cm2 平面才能
进行测试。取相同来源的玻璃片一块替代玻璃渣进
行接触角测试 ,取相同来源的具有光滑平面的同一
卵石块替代沙粒测试接触角 , PA6用甲酸溶解少许
涂在蒸发皿上制成薄膜 ,粘贴在玻璃片上进行接触
角测试 。样品测试前均洗涤干净无污染物 。
1.2.2　发菜细胞的固体培养　将液培的发菜细胞洗
涤 、离心后 ,先用 BG11作培养液稀释 ,取 5mL稀释
液分别滴加于粗砂 、玻璃渣和 PA6培养皿内 ,并补加
BG11培养液至 15mL,同等方法再以 BG110 和水做
培养液进行培养。加盖置于光照培养箱内培养 ,光
照强度 90μmol· m-2 · s-1 ,光暗比 12∶12,温度白天
25℃,夜晚 10℃,每 2d补少量水即可 ,使固体基质材
料表面保持湿润 。
1.2.3　生物量的测定 　采用叶绿素含量法 ,间接测
定发菜细胞生物量 [ 5 ] ,蓝细菌液中的叶绿素含量按下
式计算 [6 ] :Chla(μg/培养皿 )=40 ×13.9 ×A665 ×
V甲醇 /V样
1.2.4　发菜胞外多糖含量测定　待测培养液上清液
可装入透析袋(透析分子量 8000～ 14000),用蒸馏水
透析 48h除去小分子杂质 。采用苯酚-硫酸法 [7 ]来
测定单位重量叶绿素对应的多糖含量 ,计算公式如
下:G(多糖 /叶绿素 , mg/mg)=U/D
其中:U为每培养皿多糖量;D为每培养皿叶绿
素量。
2　结果与分析
2.1　固体基质材料润湿性
所谓接触角 ,是指液体在固体表面上形成液滴
达到平衡时 ,在气 、液 、固三相交界处 ,气 /液界面和
固 /液界面之间的夹角 ,用 θ表示 ,并且液体在固体
上的接触角越小 ,润湿性能越好 [ 8] 。由表 1可以看
出 ,所选定的三种固体基质材料都具有亲水性 ,润湿
性大小依次是玻璃渣 >沙粒 >PA6 ,即玻璃渣的润湿
性最好 ,沙粒次之 , PA6最差 。
表 1　不同固体基质材料的接触角
基质材料 玻璃渣 沙粒 PA6
θ(°) 10.3 24.4 44.7
2.2　粗沙基质上发菜细胞的培养
不同培养液下发菜细胞在粗沙上的生长曲线如
图 1所示 。粗沙培养的发菜细胞生长良好。以 BG11
为培养液的发菜细胞 ,接种后基本无延滞期 ,且呈线
性增长;而以 BG110 和水做培养液的发菜细胞在培
养的前 20d,生长趋势较相似 ,且均有短暂的延滞期 ,
不同的是在培养 30d后 , BG110中的发菜细胞生长明
显加快 ,培养 40d后能达到甚至略高于 BG11的细胞
培养量;而水中的发菜细胞虽呈增长趋势 ,但生长速
度要明显低于前两种培养液。
2.3　PA6基质上发菜细胞的培养
发菜细胞在 PA6上的生长曲线如图 2所示 。
PA6上的发菜细胞生长较好 。以 BG11为培养液的
发菜细胞 ,在培养的前 30d,生长速度较快 ,但培养
30d后生长趋于平缓;BG110 中的发菜细胞在培养
图 1　不同培养液对粗沙基质上发菜细胞的影响
20d后 ,生长速度明显加快 ,后期可达到甚至略高于
BG11的细胞培养量;以水做培养液的发菜细胞虽呈
增长趋势 ,但其生长量远不及前两种培养液 ,且培养
40d后 ,生长曲线趋于直线 ,生长趋于缓慢 。
图 2　不同培养液对 PA6基质上发菜细胞的影响
2.4　玻璃基质上发菜细胞的培养
发菜细胞在玻璃上的生长曲线如图 3所示。可
见 ,发菜细胞在玻璃基质上叶绿素含量基本没有增
长 ,而且在培养 10d后叶绿素含量呈下降趋势 ,观察
发现 ,培养 30d后 ,发菜细胞开始发生严重的黄化 ,
致使原有的叶绿素含量逐渐减少 ,直至完全黄化 。
图 3　不同培养液对玻璃基质上发菜细胞的影响
图 4　不同固体培养基质对发菜细胞的影响
(下转第 362页)
2.5　不同固体基质上发菜细胞的培养
以生长最好的 BG110 为培养液 ,发菜细胞在不
同固体基质的生长曲线如图 4所示。可见 ,发菜细
胞在适中的润湿性的粗沙基质上叶绿素含量有明显
增加 ,生长速率最快 ,表明选择粗沙为固体培养基质
比较适合 。在弱润湿性的 PA6上虽不及粗沙上的生
长速率 ,但仍然呈现缓慢增长 。而在强润湿性的玻
362　
检测虎杖中的白藜芦醇 [ J] .应用化学 , 2002, 19(6):585-587.
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数光谱法 [ J] .中国饲料 , 2004, 8:30-33.
(上接第 219页)
璃上培养的发菜在 10d后就出现黄化现象 ,说明该
培养基质不适合发菜细胞的生长。
2.6　胞外多糖含量的测定
粗砂及 PA6上发菜胞外多糖的含量如图 5所
示:培养 60d后 , PA6上培养的不同培养液中发菜多
糖含量差异类似于粗沙上培养的多糖含量 ,为 BG110
中多糖含量较高 ,其次是 BG11,水中多糖含量最低 。
但总的来说 ,粗沙培养的单位重量叶绿素对应的多
糖含量均要低于 PA6的;而玻璃培养的发菜细胞随
着培养天数的增加而不断黄化 ,所以暂无多糖测量
数据。
图 5　在不同固体基质上发菜细胞胞外多糖产量情况
3　讨论
发状念珠蓝细菌分布在荒漠 、半荒漠地区 ,水分
获得和失去的平衡对其在干燥环境的生长是很重要
的 [ 9] 。通过实验可得 ,固体材料较强(玻璃的接触角
是 10.3°)或较弱的润湿性 (PA6接触角是 44.7°)对
发状念珠蓝细菌细胞都是不利的环境 ,但弱的润湿
性相对于强润湿性则更利于发菜生长 ,只有适中的
固体材料润湿性(沙粒接触角是 24.4°)才是合适的
环境。因此 ,对发状念珠蓝细菌来说 ,生长较好的固
体材料应是粗沙 。
在固体基质一定的情况下 ,不同的培养液成了
发菜细胞生长的影响因子 。在粗沙和 PA6上 ,发菜
细胞在 BG110和 BG11培养液中生长速率均较快 。
在 BG11培养液中 ,发菜细胞生长基本无延滞期 ,且
培养的前 40d生物增长量均要明显高于 BG110 。毕
永红 [ 10]等通过发菜细胞液态培养的实验也得出 ,在
培养 16d左右时 ,氮元素的缺乏能显著降低细胞的
生长速率 ,这与本实验的结论一致。但本实验在继
续培养的后期 ,可得出 BG110 中发菜细胞生长量可
达到甚至超过 BG11。推测可能是 BG110中虽不含 N
元素 ,但发菜自身具有固氮特性 ,可以通过自身固氮
来获得生长所需要的 N元素 ,细胞经过一定的适应
后才导致后期生长速率加快。而以水做培养液的发
菜细胞生长相对缓慢 ,有延滞期 ,且后期生长曲线趋
于平缓 ,说明水相对于前两种培养液而言 ,并不利于
发菜细胞的生长 ,但由于发菜属于光能自养生物 ,
　　　　
所以在毫无养分的水中仍能缓慢生长 。
　　发菜在生长过程中向细胞外分泌胶状的多糖物
质 ,包裹于发状念珠蓝细菌细胞及藻丝体外 ,可保护
发菜细胞不受干旱 、高温 、紫外辐射等不利环境的危
害。从胞外多糖分泌的实验看来 ,粗沙上培养的发
菜细胞中单位重量叶绿素对应的多糖含量均要低于
PA6上的。这主要是粗沙更适合发菜细胞的生长 ,
在 PA6上培养的发菜细胞因要克服不适条件 ,需要
分泌更多的胞外多糖保护自身 ,所以多糖分泌量均
要高于粗砂上培养的 。但不同培养液中多糖分泌量
的趋势却大致相似 ,均为 BG110中多糖含量较高 ,其
次是 BG11, 水中多糖含量最低。分析认为在无氮
(BG110)的环境中 ,发菜自身需要消耗能量来固氮 ,
所以产生了更多的胞外多糖来保护自身 ,以至于多
糖分泌量略高于含氮条件下的量 。但在以水做培养
液的条件下 ,其多糖分泌均量明显低于前两者 ,可见
培养液中营养成分的缺失不利于发菜胞外多糖的合
成与分泌 。
综上所述 ,发菜细胞固体培养的最适培养基质
材料是粗沙 ,培养液选取 BG11和 BG110均可 ,但如
果培养时间超过 40d, BG110当为最适培养液 。
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