全 文 ：第 16卷 第 6 期 生物化学与生物物理学报 V d . 16
1 9 8 4年 1 1月 A CT A B I O C H I M I C A e t B I O P H Y S I C A S I N I C A
,
N 。
1 9 8 4
蓖 麻 蚕 r DNA 的 十 字 结 构 ’
靳嘉瑞 赵慕钧, , 杨冠珍 李载平
(中国科学院上海生物化学研究所 )
摘 要
单链核酸酶— 5 1 酶在超螺旋 p B R 32 上有专一的切点 。 这是因为在 p B R 3 2 超螺旋分子上邻近的反向重复顺序所形成的十字结构具有单链区能为 8 1 酶作用。 真核细胞基因— 蓖麻蚕 r D N A 的完整重复单位插人 p B R 322 所组建的质粒 p A R 11 , 其超螺旋分子的顺序上也
有 1S 敏感区 。 用 1S 酶和 P 。任 酶双酶切可以产生特定长度的片段。 p A R 工V 是带有 p A R 工1
E co R工( 2) 一aB m H 工(2 )片段的次级克隆 ,超螺旋 P A R 工V D N A 经 1S 酶和 sP lt 酶双酶切所显
示的 5 1 酶切点与 p A R 工U 一致 。 由于对 1S 酶的相对敏感度不同 , 在 p A R I n 和 p A R 工V 分
子中原有的 p B R 3 2 上的 5 1 酶切点被掩盖 。 真核细胞 D N A 的十字结构在染色质水平上的功
能意义有待进` 步探讨。
超螺旋闭环分子中邻近的反向重复顺序可形成比较稳定的十字结构 。 十字结构顺序
的顶端是单链区 , 因此该单单链区可以为某些对单链特异的核酸酶如 5 1 酶作用 , 使环状
D N A 成为线状分子 〔月 。
这一反向重复顺序所形成的十字结构在热力学上是相当稳定的 , 所 以 将大 肠 杆 菌
C O IE 质粒中具有反向重复顺序的片段切下与 p B R 3 2 质粒重组的超螺旋分子 , 仍能在该
位点产生十字结构特征而对 5 1 酶有专一的敏感性 。 这表明用 1S 酶切法可 以简便地探测
可能存在的十字结构〔骊 。
真核细胞 r D N A 是有反 向重复顺序 〔机 “ 加 , 我们用带有蓖麻蚕 r D N A 片段的重组质
粒 , 研究 r D N A 上是否有能为 1S 酶识别的十字结构 , 同时结合限制性内切酶酶切图谱分
析 , 确定 5 1 酶切点的位置 。
方 法
质粒 D N A p B R 3 2 2 D N A 和带有蓖麻蚕 r D N A 片段的重组质粒 , 以及 D N A 的分
离 , 制备方法同前 41L 。
酶切 5 1 酶为西德 B oe 五ir n g or M a n n ile i m 厂产品 。 所用限制性内切酶皆为本室
工具酶组提供 。
反应条件 4 0 m 万 醋酸钠 ( p H 4 . 6 ) , 5 0 m M N a C I , 1 m M Z n 0 12 。 3 7 O C 保温 , 所
加 5 1 酶量为 s u /补 9 D N A 。 加入 10 m M E D T A 停止反应 。 酚抽提二次 , 乙醚四次 , 乙
醇沉淀 D N A 。 然后将 D N A 溶于 T ir s一H OI ( p H 7 . 4 ) 缓冲液中 , 进一步可做限制性内切
本文 1 9 83 年 5 月 7 日收到 。
任 中国科学院科学基金资助的课题 。
料 上海科技大学进修致帅。
卜-1,.吸`.夕-`、
生物化学 与生 物物 理学 报 1 6 卷
酶酶解反应 。
电泳 用 o
·
7 ~ 1
·
4外琼月瞒凝胶 , 电泳舞冲液为卯 m涎少` 马 89 m万 硼酸 , .2 6
m万 E D T A , p H 8 . 3 。
杂 交 p A R l l l 质粒经 sP 缸 酶切后 电泳分离 r D N A 片段
, 用 。叮标记做为探针 , 与
已经转移至硝酸纤维素膜上的 D N A 样品进行杂交旧 。
结 果
一 、 p习R 3翻 超螺旋分子 5 1 醉切点的专一性
5 1 酶是单链核酸酶 , 当与 BP R 3 2 2 D N A 保温时 , 由子 5 1 酶的作用 , 使超螺旋 D N A
成为线状分子 。 图 1 显示的电泳结果 , 表明闭环分子 ( oF r心 )保温 6 分钟基本捎失 , 而开
环分子 ( F份m n )增加 , 线状分子也有所增加 。 保温时间延长 , 则超螺旋闭环分子消失 , 而
线状分子强度明显增加。
为了证明在我们的实验条件下 , 5 1 酶作用在超螺旋 D N A 分子上的切点有专一性 , 我
们在 5 1 酶与 p B R 32 D N A 保温后 , 再用 CE O R工酶进行第二次酶切 。 已知 p B R 3 2 上只
有一个 E co 孤 切点 , 如果 p B R 32 D N A 顺序上有一个专一的 5 1 酶切点则在 E Oo R I作用
后可能出现二个具有特定长度的 D N人 片段 。 如图 2 所示 , 二条新带大小为 3 . O K b 和
1
.
2 K b
, 这与位于 3 0 6 1 bP 的反向重复顺序所产生的吕1 酶敏感区是一致的比 幻 。
一
助.80.12
8 7 6 5 4 8 2 1
6 4 3 2 1
图 1 P B R 3粉 D N A班 酶切过程
1
. 对照 , 不加 5 1 酶 , 37 吧保温
30 分 钟 ; 2 ~ 8 . 加 5 1 酶后
3 7
o
C 保温 2 , 5 , 1 0 , 1 5 , 2 0 -
25
,
3 0分钟
图 2 p B R 3 2 D N 人 s1 酶 E e o R I
酶酶切电泳图谱
对照 , 不加酶 ;
CE正 I,
乙的 R工
P日七工
酶切 ;
2
. 习叨 B工酶切 ;
酶切 ; 盛 . 5 1海
5
.
5 1酶切
6 期 蓖麻蚕 r D N人的十字结构 61 7
价
R b
6
.
8一
3
.
9 — P s t I B a m HI
P
s t l
E e o R I (2)
B a m H I (2 )
奋
4 3 2 1
图 a3 pA IR工工 D N人 5 1 酶 、 P s tl 酶切电泳图谱
1 久 DN A Ec o R工, aB m H工酶切做为分子量标准 ;
2
`
pA B l l D N 人 B 翅田 E工 酶切 做为 分子量 标
准 ; 3 . stP l 酶切 ; 4
. 已1酶 P s t l 酶切 p A R l 工D N 人 5 1 酶切点示意图
如巨 K b
一 7 . 8
图 4
句 p A B 工1 D N A 阻 酶 P 挑 1 酶切片段
与饰工标记 山 N A 完整重复单位片
段杂交放射自显影图
1
.
5 1 酶切 p s t l 酶切 ; 2 . P : t l 酶切 ;
酌 p A R 工1 D N A 5 1 酶 P 的工 酶 切 ,
氏u比 er n 转移前电泳图谱
2 1
P人R l l l D N A 5 1 酶 H i n d l l l
酶切电泳图谱
b5酬图
1
.
5 1酶 H i dn l 工酶切 ; 2 . 8工酶切
百
肚 8 生物化学 与生 物物理学报 1 6 卷
二 、 蓖麻蚕 r D 万 A 完整重复单位上具有 5 1 酶的专一切点
p AR l 工是带有完整重复单位 r D N A 片段的克隆 , 播入产R 3 2 2 的 P时 I 位点。 先用
班 酶切的 p A R 11 超螺旋分子也能产生线状分子 , 再用 r 川吐酶切 , 可有新的酶切片段出
现 。 由新出现的酶切片段大小来判断 , 它是 lS 酶和 h 杠 酶切割 二D N A 所产生的新片段
(图 a3 ) 。 因此 , 能与 招叮 标记的 了D N A 进行杂交 (图 4) 。 由此可以说明 , 在蓖麻蚕 r D N A
完整重复单位上有 8 1酶的专一切点。 我们 已 知在醉 R l l l 中 , 插入的 r D N A 上没有班dn 工1 酶的切 点 , 只是在 p B R 32 上有一个现 n dl l l 酶切点。 因此 , 用 H i n d l l l 酶切
醉R l l l 时 , 产生一个全长的线性分子 。 而用 5 1 酶和压 n d l l 酶切时则除了保留有 p A R班 线性分子外 , 还有新的片段出现 (图 勘 。 计算 5 1 酶和 P s让 酶以及 5 1 酶和 H i n d l l l 酶
切的片段大小可以分析 s1 酶切点的位置。 推算结果见图 b3 , 切点大约位于 E o 0 R I (2) 一
B a m H工(2 )片段上 , 距离 E o IR (2) 切点约 0 . 4 K b 处。
三 、 r D N人 + 字结构区 D N A 片段的次级克隆蟀R I V 的 5 1 醉切点根据上述结果 , 我们将带有十字结构的 r D N A B的 R l (2) 一B a m H I ( 2) 片段切下插入
p B R 32 2
。 图 6 a 是 5 1 酶切后用限制性内切酶 aB m班 或 h 让酶切的 p A R IV 质粒电泳
图谱 。 对所得片段大小进行分析 , 结果进一步证实 了在 r D N A 上的 E o R I (2) 一B am H工
(2 )片段上确有一个 8 1 酶切点 。 切点位置和用 p A R I且 所得结果是一致的 (图 6 b ) 。
原有 p B R 32 上的十字结构在 p A R l l l 和 p A班V 质粒中则变得对 ,吕士酶不敏感。 5 1
酶和 h 证 酶或 5 1 酶和 B “ m H I 酶切后投有明显的 p B R 32 上的 5 1 酶切点出现 。
四 、 p人IR 质粒的 81 敏感区主要位于 p B R S娜刀N 人 分子
K b
7
.
1 —6 . 0 —4 . 5 —
cE
o R I (2 ) 5 1
2 6
-
1
。
1 —
2 仓 盛 场`一汕11 `名)
图 6 a P A R工V D N A SI 酶巧 lt 酶 、 8 1 酶
aB m H工酶切电泳图谱
1
.
8 1 酶 卫眺工酶切 ;
2
.
5 1 酶 aB zn H 工酶切 ;
3
.
5 1 酶酶切 ;
盛 . 入DN A H i n dl lx 酶切 图 6b p A R工V D N A sl 酶切点示意图
6 期 蓖麻蚕 rD N A 的十字结构 以9
p ARI 是蓖麻蚕 rD N A Ps tl ( 1)一co R I () 1片段插入 p BR 3 2 2h 杠 、 E oR O工切点的重
组质粒 。 与 5 1酶保温 , 超螺旋 p A R I 分子经 5 1 酶切后可产生线状分子 , 其变化过程与
p B R 3 2 2 相同。 单独用 5 1 酶切 , 保温时间延长 , 线状分子的量增多 , 而不加 s1 酶的 p A IR
质粒 D N A 在保温过程中超螺旋 p A IR D N A 没有变化 , 线状分子的量不见增多 (图 7 ) 。 这
说明 pA R I 上有依赖于超螺旋的 1S 酶识别切点 。 经 1S 酶切后的线状分子再用限制性内
切酶酶切 , 应有新的片段产生 。 分析用 1S 酶和 8P 订 酶以及 1S 酶和 卫知。 R l 酶双酶切所得
的片段 , 表明在 p A IR 中 5 1 酶的切点位于 p B R 32 D N A 上 , 而在 r D N A 插入片段中投有
更为敏感 的 8 1 酶切点 (图 8 ) 。
图 7 p A R工 D N A S I 酶切过程
4 3 2 1
图 8 p A R工D N A S I 酶 E co R工酶切电泳图谱
1
. 对照 , 不加 5 1 酶 ; 2~ 7 . 加 5 1 酶
后 3 7O C 保温 2 , 5 , 1 0 , 1 5 , 20 , 2 5 分钟
1
、
5
.
5 1 酶切保温 1 0 , 3 0 分钟
2
、
4
.
5 1 酶切保温 10 , 3 0 分钟习叩R 工酶切
讨 论
一 、 超螺旋 D可A 分子中十字结构对 5 1 酶的敏感度不同
根据 p B R 32 D N A 全顺序分析的结果 , 已知它有三个邻近 的反向重复顺序 , 它们都
可能形成十字结构。 由它们对 5 1 酶的敏感性看来 , 总是位于 3 0 61 b p 的吕1 酶切点首先
被切 。 而在 p A R工1 中 , r D N A 的 5 1 酶切点就更为敏感 , 所以总是其中距 CE o R工(2) 向
B a m m 侧 0
.
4 K b 的 5 1 酶切点首先被切 。 这时 , p B R 3 2 中的 3 061 b p 处 1S 酶切点被
掩盖了 。 这种现象在 p A R工V 质粒 D N A 中也可见到 , 即 r D N A 的 5 1 酶切点掩盖了 p B R
32 2 上的 51 酶切点。 因此在 p A R I 上 , 虽然总是 5 1 酶切在 p B R 32 的 3 061 饰 处 , 但是
考虑到对 5 1 酶的敏感度的存在 , 我们不能认为 p A R工的 r D N A 插入片段上没有 1S 酶敏
感的十字结构 , 只能说这里没有比 p B R 3 2 的 3 061 b p 位点更为敏感 的 5 1 敏切点存在 。
最近 L n l ey 。 们报告对 阻 酶敏感的十字结构 , 由于反 向重复顺序不同 , 敏感度也不同 , 发
夹结构长的就更为敏感。 这和我们的结果是一致的。
生 物 化 学 与生物 物 理 学 报 1 6卷
二 、 真核细胞 DN A 的十字结构
带有真核细胞 DN人 片段的质粒是否有 吕1 酶的专一切点至今报道很少 , 我们的工作
是用蓖麻蚕 r D N A 片段插入 p B R 32 后所形成的重组质粒 。 5 1 酶切结果说明在超螺旋
的重组质粒中 r D N A 片段上确有十字结构。 最近用鸡珠蛋白基因的研究报告明 , 该基因
片段对 5 1 酶的切点不仅在重组质粒的超螺旋分子中而且在活跃的珠蛋白染色质 水 平 上
也得到证实 。 尽管 目前对在染色质水平上如何形成稳定的5 1 酶敏感区尚不清楚 , 但在体
内存在着这一结构就值得引起我们 的兴趣 。 真核细胞基因的表达调控是多水平的〔7, “ 〕, 可
能局部的螺旋结构也是参与基 因调控的。 近来就有报道 , 超螺旋分子如 p B R 32 , 酵母转
位因子 T Y I 的次级克隆 aP 。 、 P 3 , 在体外转录的效率较之开环分子高几倍 9[] 。
一般认为活跃工作的真核细胞基因 , 在染色质水平是易于为 D N a 吕e l 所切的〔10 。 换言
之 , 染色质的 D N as el 切点 , 位于活跃的基 因上。 考虑到珠蛋白染色质的 5 1 酶切点是邻近
于 D N韶eI 切点附近明 , 这些线索都提示我们真核细胞染色质上对 s1 酶敏感的十字结构
是个值得重视的问题 , 它们在体内存在的情况以及在基因表达上的功能意义有待我们进
一步阐明 。
郑仲承同志标记探针 , 庄熙孟 、 戴培桦同志协助摄影 , 一并致谢 。
参 考 文 献
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召`倪” 绍 , 1 9 76 , 1此 8拐 .
6 期 蓖麻蚕 r D N A 的十字结构 62 1
么
C R U C IF O R M S T R U C T U R E S IN
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S I L KWO R M A T Z’A C U S R IC却以
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(名人a叩人a乞Z公名￡么才肠 t e of B仍 e入e饥招公犷夕 , 过 ca 而饥协 名饥 、 a )
A B S T R A C T
A s i n g l e s七r a n d s p e e i fl e n u e l e a s e , n u e l e a s e 一 5 1 , e a n o l e a v e s u P e r e o i l e d PB R 3 2 2
D N A a t a s P e e i if e 5 1七e . T h e 5 1七e w a s fo u n d t o b e i n 七h e l o o P o f 七h e e r u e i fo r m 。七r u o七u r e i n
s u P e r e o i l e d D N A
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S u P e r e o i l e d P A R l l l D N A
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o f 毛h e r D N A g e n e o f 七il e o i l k w o r m A 云才a e琳 r 女乞几感 i n P B R 3 2 2 , e a n a l s o b e o P e o i 6服11y
o l e a v e d b y 8 1 n u o l e a 日e , s i n c e a几e r 5 1 n u c l e a s e 0 1e a v a g e fo l l o w e d b y p s七1 d i g e s 七i o n
fr 鳍m o n t s o f d e if n i七e s i z e s h a v e b e e n s o e n . A s u b c 10 n e o f p A R l l l h a v i n g 七h e E e o R I -
B a m H I fr a g m e n 七o f r D N A 一 p A R I V e x h i b i毛5 5 1 o l o a va g e ` 七e s s i m i l a r t o p A R l l l
.
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fr ag m o n 七 15 e o v e r e d u p i n p A R l l l a n d p A R IV
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T h e fu n e t i o n o f t h e e r u 喊 fo r m “七r u o -
毛u r e i n 七h e e h r om a 七i n o f e u k a r 了。七i c oe l l s 15 b e j n g s七u d i o d fu r 士h e r ·
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