全 文 ：遗 传 学 报 , 1 0 ( 4 ) : 2弓7一 2 5 3 , 1 9 8 ,
流以口 G . 朋打` . 翻 . 1“
蓖麻蚕核糖体 R N A 基因外转录
间隙区 ( E T S ) 部分顺序
甘人宝 王 琦 储美瑾 徐敏 李载平
(中国科学院上海生物化学研究所 )
根据 rR N A 杂交定位的结果 , 分离了带有外转录间隙区 ( E T s ) 的蓖麻蚕 rR N A 基因次
级克隆 p人 lR l 的 加 , 1H一 tP, I片段 。 利用部分酶解法作了较精细的内切酶谱 , 侧定了各片段
的大小 。 由 加。 1H 犷 端 ,对该片段进行了顺序分析 ,在已测定的 ` . 扭叨细 I片段的 21 , 个核
昔酸顺序中 , 酶切位点的识别顺序的定位与部分酶切法的定位结果一致 , 片段中可能存在 4
个反向重复顺序 。
阐明真核生物基因上与表达的调控有关的顺序是 当前分子生物学研究的一个宜要领
域 。 研究 m RN A 和 5 RN A 基因表达的必需顺序已取得显著进展 ,但是在 rR N A 墓因
还很不清楚。 核糖体 r RN人 基因 ( r D N A ) 是一个多拷贝的基因 , 在核仁上重复串联着
数百个基因单位 , 这些基因的表达在细胞分裂和细胞功能的调节控制上处于十分重要的
地位 。 近几年来对非洲爪蟾` , · , , · , . , 、 果蝇【1 0) 、 家蚕 【1 , , 、 小鼠 t` · , ` ·划 等核糖体 r RN A 基因的研
究表明每一个基因单位由 2 85 、 1 85 、 5 . 85 r RN A 编码的基因 、 内转录间隙区 ( r s) 、 外转
录间隙区 ( E T s ) 、 非转录间隙区 (N T s ) 组成 。 不同种属生物的 2 85 、 18 5 、 5 . 8 5 r RN A
基因大小是相对保守的 ,而非转录间隙区及外转录间隙区随生物种属变异较大 .t1 ,ol
我们已克隆了蓖麻蚕 ( lA acl “ , r ic 厉 ) : D N A (待发表 ) ,并作了基因单位的酶切图
谱闭 , 进行了 1 85 、 5 . 85 、 28 5 : R N A 在基因单位上的杂交定位 (待发表 ) 。 我们分离了含
有 E T s 区的 p A lR l aB o H卜P,t l片段 ,作了较为精细的内切酶谱 , 并侧定了 刀俐 IH 一沼以
片段 2 19 个核昔酸顺序。
材 料 与 方 法
p A lR l r D N A p A lR l 克隆株是将蓖麻蚕 rD N A 中的 4 . I K b 的 习` 阴 H l 酶切片
段与 P BR 32 2 重组而成 (待发表 ) , 重组质粒 D N A 基本上参照 oC lm an .l] 等法制备 , 用
B ijr 一 , 8 破碎细胞 , 经尿素经基磷灰石柱层析分离 , 电泳鉴定纯。
限翻性内切蔺 石` 。 R l 、 aB o H I 、 几 tI 、 lA ul 酶均由本室工具酶组提供 , 内切酶与
D N A 经 3 7℃ 24 小时保温 , 电泳鉴定 ,无杂带产生 。
每 备衬细卜 I ( G C G C , 价 aI 同功异源酶 ) ` , , , B,P 6 7 1 ( G ACT , M b ol 同功异源酶 ) , B,P z l l
舀
( G G C
,
H二m 同功异源酶 ) ` 3] , 以上 3 种是从我国的菌株中提取的内切酶 , 均由本所二
本文于 19 82 年 5 月 3 日收到 .
遗 传 学 报 1 0 卷
室 DN A 结构组提供 。
5
`一 , ,
P
一 r D N A 标记 重组质粒 p A lR l D N A 经 B a二 H l 酶切后按 M
axm
和 e il b e rt 。 , ,
方法标记 。 [ r一印 1 ^ 钾 (比活为 2 0 0 0一 3 0 0 o e i / m M ) (孔。 Riad o hc 画司 。 以 r e , 为 n e r -
bB am E
n g la n d )
o
碱性磷酸醋酶 (上梅试剂二厂 ) , 多核着酸激酶 (北京生物物理所 ) 。
标记的 r D N A 片段分离
l
· 标记的 r D N A B a m H I一凡 t l 片段 上述 5勺印 标记的 p A R l l r D N A 及 p B R 3 2 2
D N A 经 凡 tI 酶切 , 用 6外 聚丙烯酞胺凝胶电泳分离 ( 39 : 1 ) 。 电泳缓冲液 50 m M T isr -
翻酸 一 l m M E D T A aN : , 声 .8 3。 自显影后用两种方法从电泳凝胶上回收标记 r D N A 片
段。 第一 , 浸抱法 : 将含有标记的 r D N A 片段的凝胶切下 , 用 .0 5M N H 弓A c 、 oI m M
M g ( A
e
)
: 、 l m M E D T A
、 l 多( w / v ) s D s 10拌 g /m l t RN A , 5 0℃ 浸泡过夜 , 乙醉沉淀回
收〔1] 。 第二 , 电泳法口 , : 由自显影定位 ,在所需分离片段前 4一 , 毫米处挖出一块约 20 x 3~
凝胶 , 把透析袋折成簸箕形 , 加人少 t 电泳缓冲液 , 置于水平电泳糟上电泳 , 20 0 v 约半
小时 , 吸出透析袋中的溶液 , 乙醉沉淀回收。
2
. 标记的 r D N A aB m H I一才坛 I 片段 将分离得的 5’ 一 ,午 B a o H I -几d 片段 , 用 lA ul
不完全酶切 , 经 8务 聚丙烯酞胺凝胶电泳分离 , 可得到主要是约 2 19 b p 的 5’ 一 ,午一 B a 。
H l
一 A l u l 片段。
化学降解 按 M ax am 和 iG lbe rt 方法训 。 但由于 , , 一 3午一 r D N A aB o H I子“ I 片段较
大 , 约有 6 7 0 b p , 当用阱部分降解 c 和 c + T 时在我们的实验条件下降解时间偏短 ( 7
分钟 ) 较好 , 麟和硫酸二甲醋 , 国产试剂 ,经重蒸精制。
顺序分析扭胶 含 .8 3M 尿素 , 丙烯酞胺单体与双体为 19 : 1 , 顺序分析 用 10 外 、
15 务 凝胶电泳 , 电泳缓冲液为 10 0m M T isr 一翻酸一 Zm M aN 正D T A p H .8 3 , 尿素 (上海
试剂一厂 )经重结晶 ,去离子后使用 。
放射自显形 顺序分析凝胶自显影时加增感屏 (上海医疗电镀厂 )置于 一 20 ℃ 低温
冰箱曝光 , x 光片为上海感光胶片厂 n 型底片 。
蔺切片段大小侧定 p B R 3 2 2 D N A 经 石` 。 IR 或 B a m H I 酶切后 , 标记 5 ` 末端 , 再
分别用 乃d 、 H ac l l l 等酶切 , 可得到各种已知大小的标记片段 , 用作标准。
结 果 与 讨 论
蓖麻蚕 rR N A 基因全单位的克隆 p人lR n (待发表 ) , 经 P, I 酶切可得到 1 . 1 K b 的
重复单位 (见图 l )。 PA lR l 克隆株是 由 r D N A B a o H I酶切片段 ( 4 . I K b ) 与 p B R 3 z Z
孟组而成。 最近 r DN A 与 1 85 和 2 85 r RN A 杂交结果表明 r D N A 中很大一部分是不
杂交的。 p A lR r D N A B a o H I -乃 d 片段 (约 6 6 o b p ) 不与 18 5 及 2 8 5 r RN A 杂交而与
叨 s 杂交 (待发表 )。 依此推断该片段可能为外转 录 间隙 区 ( xe et m习一 tr an cs ir dbe 一 sP ac er ,
E T S ) 定位的区段 。
图 ( 2 ) 为 B` 。 H r一sP lt 片段的分离流程 。 我们采用了浸泡法及电泳法从聚丙烯酞胺
凝胶回收标记 D N A 片段。
(一 ) p A川1 r D N A B a m H I一aP lt 片段内切醉谧
.记.l.-e
!
,
. ” 几月 “ “ ” 氏。 -l p几“ 月“ 1 .1 1仙 , l
I !
产卜- , p人甩一 .一 4 _ I K b IH硬召l、Jd工、,竹日奇工H硬由
11戈.召. 口 . ` . . 口口 . 户口 曰 口 . 口口 .
口 ` 户 口
沪 沪 尹
啄豆三阅 曰 、二N4亩工之、书d亩卜笠由
1卜笠亩
F运
图 l 蓖雇蚕 r D N A 限制性内切阵谱
R .e tr i e it o n ma
p s o全 t h . s i lk w o r m 志 ,配附 价万树 r D N A
肠用 H l一 ~ aB , 1H
尸汤1产 翻月尸
如。 H l 的切
乃才 I gB
. H I d咭峨
亡曰
刀s P Z 1 1
杏{
.6 ,转 滩丙姗酸胺蔽胶电沐分离
6
.
,肠 OlP y鱿 r , I幽记。 洲
cl “ t r o P抽 r o is
A细 I 酶切 IA “ I d谊以
8沁聚丙烯酞胺凝胶电泳分离
8外 P o l y ac r y l抓 id e g e l
e lce t r oP h
o r es认!
一
.
图 2
F谊 . 2 S e h em e o t t l: e
p A R l l B d用 H l一 P,t l
、
aB用 H l一才 l u l 片段分离流程
p r e p a r a ti o n o f ht e p A R I I aB勿 H l一 Ps一1 a n d B a阴 H l一才 Iu l f r a g m e n .
遗 传 学 报 1 0卷
日 3 p A IU 脚们H卜户川 片段部分醉解的放射自显形曲反应在 37 七 保砚 , 底物即 5 , 一 , P 标记的
p A nR加 . H卜P’t I 片段约 1徽克。 部分醉解后的样品在 8% 泉丙始陇胺搜胶 ( 3 9: 1)电泳分
离 ,放射自显影 。
^
.
1一弓. 肠p 6 7 1 的部分醉解 : 1 . 0 . 5单位 , 1 5分 ; 2 . 氏 5单位 , 30 分 ; 3 . 1单位 , 30分 ;
4
.
2草位 , ` 0分 。 5一 8 .石` . p : I 的部分醉解: , . 0 . 2单位 , 2 0 分 ; 6 . 0 . 5单位 , 6 0分 ; 7 . 1 . ,
单位 , ` O分 ; 8。 3单位 , ` O分 。 9 .标记的片段 。 10 一 12 . p右3R 2 的醉切片段作标准 ,分别
为 7 9、 3 75、 7 5 4碱荃时 .
B
.
1一嘴. 才l碗 部分醉娜: 1. 0 . 5单位 , 10分 ; 2 . 1单位 , 30 分 ; 3 . 2 单位 , 6 0分 ; 呜. 4 单
位 , 6 0分。 5一 7 . 肠户 2 11 部分. 娜 : 5 . 1单位 , 10 分 ; `一 2 . 5 单位 , 30 分 ; 7 . 5单位 , 6 0
分。 8 . 标记片段作对燕 . ,一 1 . p B R32 2 的璐切片段作标准 , 分别为 79 、 375 、 7到玻谷
对。
劝` . 3 A . Ot “ 己io a f . p b y o f 山. , 团如 . ,曰的。目 pRA 月 石. . IH 一尸“ 兀 加 g m时 , 甘d目 id s以曰
t 37 ℃ , 比. . “ . p le, d e c tr o户 ot . d . 二 8肠 脚妞, `印加面 d e g le .
人 . 1一 4. tB杯 7 1: ( 1. 0。 s u , 15面 n . 2 . 0 . 5 u , 加面。 . 3. l u , 加而 n , 4 . Zu , ` om i n ) ·
5一 8 . 拼 . p : I: (5 . 0。 Z u , 2 0 . 如 . ` . 0。 5 . , `0. 云. 井 7 . 1. 5 u , 60m加 . 8 . u3 , ` 0而 n ) .
9
.
L a b e l如 9 f r a曰. ent “ e o n tr o l . 10 se 12 . R . 粉i ct 己 血明 m二 o f p B R3 22 a, am kt, ,r o p e e d代 l萝 79 , 375 , 7 5书bp . B . l一月. 刁 l以 : ( 1 . 0 . 5 u , IOm i n . 2 . l u , 30面 n , 3 . 2。 -
` o m in . 咭. 4 u , ` 0. 加 ) . 5一 7 . B’ 户 2 1 1: ( 5 . l u , 10二运 . ` . 2 . 5 u , 30 n浦n ` 7 . s u , 60m in ) ·
8
. 肠阮 l li n ` 台. . . 以 . con 廿 01 . 9一 11 . R曰吐 r i tC闭 f r a g m o st o f 户执犯2 ” ~ 杨
r o p e d
v d y 79
,
3 75
,
7 54b p
.
为了进行顺序分析 , 对 r DNA 枷 IH 一P,I 片段作了比较精细喇脚酶谱 (见图 ’ a)部分酶切法是最近几年被广泛应用的一种快速 、简便的作酶切图谱的方法州气 _将 , , 末端
或 3’ 末端一端标记的片段 , 用不同的内切酶酶 l 及不同的反应时间部分酶切 , 计葬电泳
分离的各片段大小 , 就可编排出酶切图。 我们对 5’ 末端标记的 B . IH 一乃d 片段 , 用不
同 t 的内切酶 才l二 I 、 肠户2 1 1渭护 6 7 1 及 月 ”`邸 分别在 3 ,℃ 反应 1 0分钟 、 3 0分钟 、 6 0
分钟后终止反应 , 电泳分析 , 自显影结果见图 3。 枷 (A击 ) 部分酶切有两个切点 ,师川 ( G奴 ) 有 4 个切点 , B,P 6 7 ; (c’ ^ cT ) 有两个切点 , inH 。 ; (庆“ ) 有 7 个切点。 标记的标准分子制得是将 p B R 3 2 D N A 经 石活。 Rl 酶切 , 5’ 末端 标记 , 再用
B o IH 及 P,t l 酶切可得标记的 3 7 5及 7, 斗如 片段 ; pBR 3 2 经 aB o H I 酶切 , 5’ 末端
标记 , 继而用 “ 配 In 酶切可得到 79 如 片段。 5’ 一标记的 石念口R l明口用H l 片段 , 用 衬` d【【
酶切可得到 l刀如 片段。 依这些标准分子来测定上述部分酶切片段大小 , 可得表 1 的数
4 期 甘人宝等 : 蓖麻蚕核糖体 R N A 基因外转录间隙区( ET s) 部分顺序
粼豁输 农 l p A 狱I B州HI 一户时二片段的 . 翻性内切曲 . 切位 , 及幼切片段大小T’. ` 1. 1. R e s tr i e d o n 滋 t e , a n d t r a g m e n r s i z e s o f p ^ R ” 加用 H -I
P r t l f r a 官m e n t f o r s o m e r e s t r i c t i o n e n z y m se
纂多终狱…
限制性内切酶 酶切位点 D N A 片段大小 (碱基对 )
R e , tr i c it o
n
(从 B a , H l 切点计算 Si z e o f D N A f r a g m e n .
e n z y m e , 的碱基对数 ) ( b p )
s一 t e o f e n 认萝m e ,
( b p f r o m B a仍 H l o i l e )
才I u l
;
l o ^ l 0
2 2 0 B 2 10
C 呼呼0
Bt P 6 7 1
;
4 0 0 A 呼0 0
6 0 0 B 2 0 0
C 6 0
肠 P 2 1 1 l 36 A 3 6
2 S7 B 2 l
3 7 3 C l 6
4 2 50 D 17 7
E 斗8 3
阴” P . l ` l 10 0 人 10 0
2 14 0 B 呼0
3 2 0 7 C 6 7
呼 2 4 Q O 33
5 2 8 2 E 呼2
6 3 2 8 F 峪8
7 3 8 7 G 5 9
H 2 7 3
一伽荟
嘿
8% 聚丙始酞胺凝胶电泳分离
D N A 顺序的放射自显影
A u t o r a d i o g r a p h犷 o f D N A
s e q u e n c e s e p a r a tde b萝 8%
冈 ly a c r 7 l a m id e g e !
据 , 以此画出 B a m H I一 p s t l 片段内切酶谱 (图 l ) o
(二 ) p A R l l r D N A B a m H I· .P r l 片段的部分顺
序
用 B a m H I S ’ 端标记的片段 , 进一步作了核昔酸顺
序分析 。
M ax 二 和 iG lbe rt 的化学降解法测定顺序 , 一般来
说 20 0一 3 0 0 b P 大小的片段较合适 , 5’ 一印B ` 。 H l一乃d 片
段约有 6 7 0 bP , 偏大些 , 按一般条件降解 , G 及 G + A
尚好 , 但 c 及 C + T 不理想 。 为此我们减少麟解时间
d
.
。产
g
口F
为 7 分钟 , 句
解得到 5’ 一件
可得到较好结果 (见图 4 ) 。 另一方面将标记的片段进一步用 IA “ I 不完全酶
B a m H I
一
lA ul 片段 。 对这两个标记片段进行顺序分析 , 现巳侧得从 B a o IH
酶切点起始的 2 1 9个核昔酸顺序 。 从测定的顺序中找到 2 个 lA “ ; . (A洗 T ) 切点 , 3 个
B,P
2 1 1 ( G奴 ) 切点和 。个 iH恤 ; (+co c)G 切点 , 与部分酶切结果相一致 。 我们将这段顺序贮存争计算机中 , 借助计算机寻得一些其它酶的切点 : 如从 aB m H I S ’ 一端起 ,
遗 传 10 粉
基在 3 7、 1 8 6位上存在 H Pna ( C c G G ) 切点 , 4 7 、 5 4 、 6 4 备、 2 0 9 位上存在 升 aI ( C G c G ) 切
备点 , 5 5位上存在 X o al l ( C G G C C G )
的是在这段测定的顺序中 , 可能存在
备切点 , 61 位上存在 称 d ( G T A C ) 切点等。
4 个反向重复顺序 (中心位点分别在 23 、 52 、
1 3 6 位 ) , 可能形成十字结构 ( c ur ic fo mr o cur uetr ) 1t,
, 见图 , 。 在相应的 rR N A
E T S 中 ,应可形成发夹结构。 它可能具有的生物意义尚不清楚。
感兴趣
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图 s p人 lR aB o H卜才 l以 片段 ( 2 19 核普酸 )顺序及其反向重复顺序
T h o p A皿 aB . 比一才 I二 1 f r a g m e o t ( 2 19 n u e l e o d e ) s闪 u e n e e a n d i o v e r t曰 r e paet
iB r snt id山 , 和 B ac h[ 习 等人对爪蟾 r D N A 的非转录间隙区及外转录间隙区的大部分
顺序测定 , 表明存在着长度为几十个核昔酸的大片重复区 。 果蝇核糖体 RN A 基因研究
指出 : D N A 复制位于 N sT 中山 .l,J 。 对丝状菌 (丹 y~ m 户vol 仰汤al “ m ) 研究表明 , 调节的磷蛋白与 r D N A 非编码间隙区相结合训 。 这些工作推测 N T s 是调控的重要区域 。
E T S 亦有大片重复区 , 是 : RN人 基因的 5’ 末端区 ,对于 r R N A 基因的调控及前体 r RN A
的加工有关。
为了阐明 r RN A 基因的调节控制及前体 r RN A 后加工过程 , 对于 1 85 : RN A 基因
的起始点 (即 E T s 的 3’ 末端区 )及前体 rR N A 转录的起始点 ( E sT 的 5’ 末端区 ) , 杂交
点及 sl 酶谱的工作正在进行之中 , 同时对 E T S 及 N T S 的顺序的分析也在进行之中。
, 考 文 狱
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碑 期 甘人宝等 :蓖麻蚕核糖体 R N 人 基因外转录间隙区 ( E Ts ) 部分顺序 2 5 3
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