全 文 ：第 1 7卷
1任 8 6年
第 1期 东 北 农 学 院 学 报
; j」 J ou r n al of N or t he as t Ag ri u cl tu r alC olle g e
V ol
.
1 7
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.
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M
a r e
h 1 9 8 6
黑穗醋果酵母菌的筛选 (初报 )
杨向群 李英俊 崔成东
(微生物教研 室 ) ( 果品加工教研室 )
周 因咨、之户
(果树育种教研室 )
本文 作者从 1 9 8 3年开始进行黑豆酵母菌种的筛选工作 。 甘 已选 出的十二株酵母
菌进行 多次驯养及生理实验 , 初步选育 出四株发酵速度快 、 产酒度高 、 原果香味浓
和酒香纯正 的黑豆酵母菌林 。
黑豆果酒 , 又 名 黑 加 仑 酒 , 是 黑 豆
( R `b e s n f g r u m L . ) 加工的一个重要产物 。
酿酒是微生物的活动过程 。 选用发酵力强 、
产酒度高 、 醋香味浓的优 良酵母 , 才能酿造
出优质果酒 。 而且 , 只有选用同果实相应的
酿造酵母菌 , 果酒方能表现出固有的浓馥果
香 、 悦怡酒香的独特风味 。
目前 , 酿造黑豆果酒 , 一部分厂家仍采
用 自然发酵 , 存在着发酵周期长 、 杂菌多 、
质量不高等缺点 ; 一部分厂家是借用葡萄酒
酵母进行发酵 , 明显影响酒质 。 迄今 , 我国尚
未分离出黑豆酵母菌 。 据资料报道 , 国外只
有日本 、 波兰 、 法国等少数国家分离出来并
已应用 。 因此 , 分离筛选黑豆酵母菌成为 目
前黑豆果加工中的重要课题 。
笔者从 1 9 8 3年开始进行黑豆酵母菌的分
离筛 选 工作 。 两年来 , 分离出 12 株 酵 母
菌 , 经生理实验初步筛出 4 株黑豆菌种 。
黑豆酵母菌的分离筛选
本文于 1 9 85 年 1 0 月 2 0 日收到
(一 ) 材料
1
. 以本院园艺实验站果 园种植黑豆果
的土壤 、 黑豆果的叶片 、 黑豆果果皮为分离
材料 。
2
. 采用的培养基 :
① 乳酸豆芽汁蔗糖培养液 。
份) 豆芽汁蔗糖琼脂培养基 。
③ 越汁 (或麦芽汁 )琼脂平板培养基 。
(二 ) 方法
取黑豆果皮少许 , 或土壤 10 克 , 或叶
片少许 , 放入一管乳 酸豆 芽 汁蔗糖培 养液
4 0东 北 农 学 院 学 报 第 1 7 卷
中 , 保温 28 一 30 ℃ , 培养 24 小时 , 用无菌
吸管取培养后的培养体 0 . 1 毫升注入另一管
乳酸豆芽汁蔗糖培养液中 , 再培养 24 小时 ,
用悬滴法或制水浸片镜检 , 用划线法 , 分离
上述加富培养体 , 获得独立菌落 , 反复纯化
获得纯培养 。
获得纯培养之后 , 再用分 级离 心 法纯
化 , 直至获得纯菌株 。
黑豆酵母菌是发酵型的酵母菌 , 为了获
得发酵型 , 进一步采用酿造酵母菌分离法 。
操作过程 : 将一接种环酵母菌放入 2 毫
升无菌水中 , 充分振荡 , 用吸管取 0 . 05 毫升
菌液至趟汁琼脂平板培养基上 (用乳酸调至
p H 4 )
, 用刮刀涂抹 , 放置 1 5 分钟 , 使酵母
菌沉积在培养基表面 , 然后翻转培养皿 ,在培
养皿盖上贴 2一 3 张圆形滤纸 , 注入 2 毫 升
焦性没食子酸溶液 , 立即用乙烯树脂片密封
整个培养皿 。 在 25 ℃ 下经 2 一 3 天 后发酵
性酵母菌即形成巨大菌落 。 挑取少许菌落保
藏 , 待作生理发酵实验 。
5
.
5一 3 . 1 。
3
, 发酵汁为黑豆 果什 加入适 量培 养
液 。 以酒石酸钾调整 p H ,用砂糖调整糖度 。
果汁需加热 杀 菌 ( 60 一 65 ℃ , 30 分钟 ) , 或 用
K
:
5 0
5 杀菌 。
4
. 将冰箱中保存的分离 出 来 的 纯 酵
母 , 接种到 固体斜面培养基上 , 在 26 一 28 ℃
下培养 48 小时 , 进行活化处理 , 然后分别
接入培养液中进行驯养 , 使之增强耐糖 、 耐
酸能力 , 并进行多次发酵增加酒精抵抗力 ,
以此稳定和提高菌种的优 良特性 。
按 p H 值由高到低 、 糖度由低到高的梯
度进行驯养 (见表 1 ) 。 每级保持温度 25 一
2 8 ℃ , 培养 24 小时 , 然后吸取 2 毫升 , 分
别接入下一级试管中 。 经五级以上驯养 , 菌
株在试管内发酵良好 , 证明适应该环境 。 再
反复将菌液接入调正过的果汁中 , 分次加入
适量酒精 , 以增强菌株耐 乙醇能力 , 尔后按
5%量接入待发酵汁中进行发酵实验 。
黑豆酵母菌的发酵实验
表 1 . 培养液可 丁容性固 形物及 p H 值
级别 可溶性固形物 (% ) p H
对 已分离出来的纯粹酵母 , 需要进行发
酵力与酒精得率 , 乙醇 、 二氧化硫的抵抗力
以及发酵产物 (如甘油 、 乙醛 、 挥发酸等 )
鉴定 。
笔者初步对 产 酒精度 、 有机酸 、 挥发
酸 、 挥发脂等主要指标进行了测定 。
(一 ) 材料与方法
1
. 分离的菌 株 8 3一 A , 8 3一 B , 8 4
一 3 , 84 一 4 等 12 株菌 , 以轻工部食品发酵
所选育 出的优 良葡萄酒 酵母 12 03 为对照 。
2
. 培养基 ① 斜面培养基 : 马 铃薯
培养基 ; ② 液体培养液 : 蔗糖 10 一 20 % , 蛋
白陈 0 . 5% , N H 、 C l 0 . 2 % , K o H P O 4 0 . 5% ,
N a C I 0
.
1%
, 微量 C a C I: 和 M g S O 4 。 以黑
豆果汁调整酸度 。 使含糖 8一 15 % , p H 为
一级
二级
三级
四级
五级
l 8
2 0 3
.
5一 3 1
(二 ) 结果与分析
将分离筛选出的 12 株菌种分为 两 组 ,
先后分别进行四批 以上实验 , 初选出 4 株黑
豆酵母菌 。 其主要测定数据如下 :
.l 第一批实验
(1 ) 第一组选出 2 株菌种 (以下相同 ) ,
见表 2 。
发酵前果汁可溶性 固形 物 含量 18 % ,
p H 为 4 . 6 , 发酵结束时 , 残留糖和产 酒 度
与对照相近 。
第 1期 杨向群等 :黑穗甭某酵母菌的筛选 (初报 ) 4 1
.发酵汁的理化指标分析
(发酵第 5 1天测 定 )
知表 2 .发酵 汁品温 、 糖 度及酒精含量 变化 表
一一 .一一 ~一一 . ., . . .侧 . . . . . . . . . . ~ .~ . . .时 间菌 株 项 目 第三天 第五 天 第八天室 温 菌株 总酸( % ) 挥发酸( % ) 残糖( % ) 酒 精度(二 / v )
2 3 C
“ 2 4 C
。 2 3 C
.
C K 1
.
59 0
.
0 9 9 9
.
8
品 温 ( . C ) 2 4
1 1
。
0
2 5
9
.
0
2 3
CK 可溶性固形物 (% )
;听 精 度 (孕石)
8
.
0
84一 3
8 4一 4
1
`
67
1
.
4 9
0
.
1 0 2
0
.
1 0 1
2
.
3 1
1
.
8 5
2
.
0 连
1 2
。
3
1 1
.
4
8
.
3 1 0
.
0 1 0
.
4
品 温 ( “ C ) 2 4
1 t
.
0
2 5
9
。
0
2 3
注 : 测总酸含量采用中和法 , 用挥发酸蒸馏装置蒸馏
后 再滴定测挥发酸 ; 警林试荆法测残糖 ; 以 蒸馏法测酒精
(下同 〕 o
83一 A 可溶性固形物 (% )
酒 精 度 (% 》
7
。
5
7
。
3 9
.
0 1 0
.
0
l钻 涎轰 ( . C )
8 3一 B 可溶性固形物 (% )
洒 精 度 (% )
2 4
1 2
.
0
2 5
1 0
。
0
2 4
8
.
5
7
.
1 8
。
3 9
。
5
.2 第二批实验
(1 ) 第一组 原料为黑豆果 , 破碎后加
水量 40 % , 调正糖度为 18 % (可溶性 固 形
物 ) , 7月 18 日接入菌种 , 在室温 23 一 25 ℃
下发酵 (见表 5 ) 。
注 : 为及时简便掌握含糖量变化 , 本实验用手 持糖量
计侧定发酵汁可溶性固形物含量作为参考值 ( 下同 ) 。
表 5 . 发酵过程 中糖分 及酒精含量
九第天第八天第六天第四天第二天
川度(精酒
株一K菌一C(2 ) 第二组选出 2 株菌种 (以下相同 )
见表 3 , 表 4 。
表 3 . 发酵汁糖度及酒精含量 变化
( %
,
V /V )
一一 .- ~ . . ~ . ~ . ~ . ~ . ~ ~ - ~ - - . - 口_ 时 间_7月 2 0 日 2 2 日 2 4 日 2 6 日 2 7 日项 日
可溶性固形物
( v /
v )
10
.
5 12
.
5 1 0
,
5 1 0 0
9
.
7 1 2
.
3
菌 株 项 日
8月 1 5 日
第
五
天
日
1 6 日
第
17 日
第
七
天
期
1 9 日 可溶性固形物
8 3一 A ( % )
酒 精 度 气v / 劝
1 3
.
5
1 3
.
0
1 1
。
10
10 5 1 2
。
5 1 1
。
0 10
.
5
9
.
0 ] 2
.
8
如第十五天九第天
八天
可溶性固形物
C K 洒 精 度
可溶性固形物
8 3一 B ( % )酒 精 度 ( v / x-)
1 0
.
0 1 3
.
0 1 1
.
5 1 0
.
9
。
0 1 0
.一一 ~ . 一一一注 : 第四 天 测后加糖 。9 4一3 可溶性固形物洒 精 度仑盈一 4 可溶性固形物洒 精 度 6
.
3 6
。 1 1 2
、
0 1 1
。
2 1 0
。
5
7
.
5 9
.
4 9
.
8
1 3
.
2 12
.
0 1 4 0 1 0
.
5 8
。
4
3
.
4 1 0
.
8 1 2
.
3
1 0
.
0 7
.
7 1 1
.
0 9
.
0 8
.
4
6 6
.
8 1 0
.
8 1 1
.
4
注 : 室温 24 一 26 “ C , 第六天测后加砂糖 。
本组实验对照菌株前期发酵速度快 。 总
酸挥发酸含量同对照相近 , 残糖量低于对照
书精度稍高于对照 。
发酵速度相近 , 83 一 B酒精度稍低于对
照 。
(2 ) 第二组 果汁可溶性固形物调正为
21 %
, p H 、 3 . 6 , 按 5% 量接入菌液 , 在室
温 2 2一 26 ℃下发酵 (见表 6 、 表 7) 。
筛选出的 84 一 3 、 83 一 4 二株 菌 种与对
照菌相比测定指标基本一致 , 酒精度略高于
对照 。
透2 东 北 农 学 院 李 报 第 1 7卷
表 6 . 发酵汁糖度 变化 表 8
. 发酵 汁含糖量 变化情况
( 以 固形物含量 %计 )( 以 可溶性固形物 %计 )
时一 _~ 竺一一生一 . C K8 4一 3只 4一 4。 。 菌 株.汤场 1 1是 J_ _ _ _ _CK8 3一人 8 3一B 8 4一 38 4一 4一一一 一 -一一一尸~ ~ 一 一~ - - -一~ 第二天第 三天
第四夭
第五 天
第六天
第七天
第九 夭
1 5 5
1 1
.
5
8
.
0
6
。
8
6
.
6
6
.
6
6
.
6
18
。
0
1 5
。
0
1 7
.
4
1 4
.
6
10 月 9日
第 二 天
11日
第 四 天
1 9
.
48 1
.
0 18
。
8 5 1
。
7 1 9
.
4
1 5
.
6 1 4
.
0 1 4
.
7 1今. 5 1 4. 5
10
.
5 10
.
0 阿招 日 二 J饥 六 天 6 1. 5 15。 8 1 5、 8 6 1. 1 1 5. 8
8
.
0 7
。
7
1 4
.
5 1 3
.
5 1 3
.
0 1 4
.
0 1 3
。
0
6
.
8 6 5
6
.
8 6
.
5
16 日
第 九 天
1 7日
第 十 天 1 4
.
0 1 3
.
0 12
.
5 1 3
.
5 12
。
5
6
。
8 6
,
5
注 : 时间 9 月 6 日至 14 日 。
1 9日第十二天
2 1日
第十四天
1 1
。
5 1 1
.
0 1 0
.
3 11
,
1 1 1
。
4
1 1
.
5 10
.
8 10
,
0 1 1
。
0 1 1
。
4
表 了.
菌株
发酵汁理化指标分折 (9 月14 日 )
总 酸 挥发酷 残精 酒精度
( 鱿 ) 转化率(% )
注 : 原发酵汁调正为 21 % , pH 为 3 . 5。 10 月 7 日17 时接
种菌液 5 % 。 10 月 8 日除 84 一4 产泡沫较少外 , 其 他都产
很多泡沫 , 开始发酵 。
表 9 . 产 酒精量对比 ( 20 ℃ , v / v)
C K 1
.
1 4 0
。
28一
0
.
2 8 5 0 < 0
。
5 1 1
.
6 9 3
。
9
时 间 项 目
一
护尸即,9 4一 3 1 . 0 6
8 4一选 1 . 1 0
1 2
.
0
1 1
.
9
9 7
.
1
9 6
.
3
菌 株
C K 8 3一 A s J一 B 54一 3 5魂一 4
汁固形物 (% ) 14 。 O
酒 精 度
3
. 第三批实验
将 4 株菌种合为一组 , 仍 以 1 2 0 3葡 萄
酒酵母为对照进行发酵实验 , 观察其发酵力
及最高产酒度 (见表 8 、 表 9 ) 。
筛选出的菌株的发酵力均接近或超过对
照菌 。 产酒精达 16 度 以上 。
4
. 第 四批实验
将两组菌株分别接入待发酵果汁中 , 对
其发酵力进行观察测定 。
l( ) 容器 10 升玻璃下 口瓶 , 装入经热
力或药剂杀菌果汁 7 . 5 公斤 , 调 p H 为 3 · 5 。
(2 ) 原料 酿造葡萄 品 种一北植 18 号
(此时已无黑豆果 ) 。
(3 ) 菌种 接 入 83 一 A 和 84 一 2混 合
菌 (见表 10 ) , 接入 84 一 3 和 84 一 4 混合菌
(见表 1 1 ) , 接种量 5 % 。 其主发酵情况 如
表 1 0 。
1 4
.
0
1 1
。
0
1 3
。
0
1 4
.
1
.r之.`L第九天
1 0
.
5
1 6
.
5 1 6
。
6
果香味
浓酒香 tI味正
1 1
。
0
1 6
。
9
1 1
.
2 1 0
.
0
1 6
.
4 1 5
.
7
扩 ),
姚度味形精物固汁酒风第十四天
表 10 . 83 一 A 、 84 一 2混合菌发酵情况
发酵 日期 室温
(
。
C )
品温 可溶性固形物
(
”
C ) ( % )
备 注
9 月 12 fl 2 3 2 3 1 9 , 3 接 种菌种液
1 3 日 2 3 2 6 13 . 0 酒帽上浮 , 气泡旺盛
14 日 2 2 2 4 8 , 6 测后第二 次加糖
1 5 日 2 3 2 4 1 0 . 6
1 6 日 2 2 2 3 g 。 0
1 8 日 2 1 2 1 7 。 8
2 0日 2 0 2 O 7 。 8
测酒精度 1 3 . ,
此时残糖 1 %左右
第 1期 杨向 群等 :黑德醋栗 哮母 菌的筛选 ( 初报 )
表 1 1 .4 8 一 3、4 8 一4 混合菌发酵情况
发酵 日期 室温
(
。
C )
品温 可溶 性固形物
(
“
C( ) % )
9月 12 日
13日
14 日
1 5日
1 6日
1 7日
8 1H
1 9日
14
。
5
9
。
5
备 注
接入菌种
酒帽上浮产气泡
第 二次加糖
对分离出的 2 1株黑豆酵母菌 株 , 多次
进行驯养 、 发酵实验 , 其中 83 一 A , 83 一 B ,
84 一 3 , 84 一 4 四株 , 都表现出发酵速度快 ,
产酒高 , 原果香味浓 , 酒香纯正的优点 , 主
要指标接近或超过对照菌株 , 是很有希望 的
黑豆酵母菌株 。
1 1
。
5
1 1
.
0
参 考 文 献
1 0
.
5 〔 1 〕
加25别从4韶朋231
2 2
2 1
。
5
2 3
2 1
。
5
9
.
0
9
。
0
2 0 日测酒度 1 4 . 1
度 , 此 时 残 糖
〔 2 〕— - - . 20 %左右主发酵结束 , 表现为酒帽下沉 , 品温与室温一致 , 气泡显著减少 。 然后进行酒渣分离 , 酒醛换瓶进行后酵 。(三 ) 结论与讨论 〔 3 〕〔 4 〕〔 5 〕
〔日〕微生物研究 法讨 论 会 编 : 《微 生 物 学 实 验
法》 , 科学出版社 , 1 9 5 1。
〔德 〕 H . J . 李姆著 : 《工 业微生物学》 , 科 学 出 版
社 , 1 0 7 5 。
魏永田编著 : 《 山葡 萄栽培与酿酒 》 , 吉林人 民 出 版
社 , 1 9 3 0 0
陈华癸主编 : 《 微生物学实验》 , 农业 出版社 , 1 9 6 2 。
肖永 澜 、 中国科学院微生物所 : 调味品酿造微生物
的实验技术 , 《中国酿造努 , 1 9 8 3年 , 2 卷二期 .
S E L E C r IO N O F Y E A S T S C O L L E C T E D F R O M
B I
J
A C K C U R R A N T S
Y a n g X i a n g q u n
,
L i Y i n g j u n
,
C u i C h e n g d o n g
a n d Z h o t E n
A B S T R A C T
S i n e e 1 9 8 3
,
w e s t a r t e d t h e s e l e e t i o n o f y e a s t s w h i e h w a s e o l l e e t e d f r o m t h e
B l a e k C u r r a n t s
.
1 2 k i n d s o f y e a s t w e r e a e e l i m a t e d a n d p h y s i o l o g i e o l e x p e r i
-
m e n t s m a d e r e p e a t e d l y
.
I t p r i m a r i ly i n d i e a t e d t h a t 4 s e l e e t e d y e a s t s f e r m e n t e d
钾 i t h h i g h e r s p e e d , p r o d u e e d m o r e a l e o h o l , a n d t h e P r o d u e t s P o s s e s s e d b o t h
o r i g i n a l f r u i t a n d p u r e a r o m a t i e f l a v o u r
.