全 文 ：分子植物育种 , 20 07 年 ,第 5 卷 , 第 6 期 ,第 83 9一 842 页
M o le e ul ar P lant B er
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20 07
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8 39一 84 2
研究报告
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S S R 标记及形态性状鉴定红刺玫和月季杂交 F I 后代
罗玉兰 张冬梅 `
上海市园林科学研究所 , 上海 , 20 232
* 通讯作者 , 川 m o s l Z@ 即b u .co m
摘 要 运用传统杂交方法 , 以红刺玫为父本 、 现代月剩锦寒 1 号 ” 为母本进行远缘杂交 , 获得 6 株杂交 F ;
后代 。 本文利用形态学观察与 S SR 分子标记相结合对 5 个单株进行杂种鉴定 , 结果确定为红刺玫和锦寒 1
号的杂交后代 ,其中杂 5一 2 和杂 5一 4 与父本聚为一组 , 杂 5一 1、 杂 5一 3 和杂 5一 6 与母本聚为一组 。
关健词 红刺玫 , 月季 , S SR 分子标记 , 杂种鉴定 , 形态性状
Id e nt iif e a t i o n o f F
I H如ir d s D e ir v e d fr o m ht e C o m b in at i o n s o f R o s a an d
M o d em oR
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ot ht e gr o uP o f
“ B or c a d e C o ld l
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仃a lst
红刺玫 (R os a, m u l毋O ar hT nU b . var
.
ca ht ay e
n s is
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.
et iW .ls )又名粉团蔷薇 , 属野蔷薇的变种 , 半常
绿灌木 ;花粉红 , 数花或多花成扁平伞房花序 ; 株形
紧凑 , 枝繁叶茂 , 花团锦簇 。 20 01 年在延安路高架上
试种成功 , 红刺玫表现出生长势和抗逆性强 、 花量
大 、 花期长等优势 , 是一个很理想的改良现代月季品
种的野生资源 (张冬梅 , 2 0 05) 。 但野生红刺玫单瓣 、花
朵小 、 色彩单一 、 观赏价值较低 , 如直接应用于城市
美化 , 效果不理想 。 因此通过红刺玫和月季杂交 , 引
入品种月季的优良性状 , 以创造变异 , 选育出抗性强
又具有较高观赏价值的优 良刺玫月季品种 。
杂交利用时杂种的真假鉴定显得非常重要 , 因
为利用属间或种间杂种一定要充分了解杂种的真实
性 ,才能提高育种利用的有效性 。 以往人们主要通过
观察后代的植物学特征 、 生物学特性 、 生态习性 , 测定
抗性生理指标等从中选出优 良月季材料 (熊佑清 ,
200 2 ; 郭润华等 , 2 0 0 6 : 黄善武和葛红 , 19 5 9 ) , 或通过
染色体鉴定 (马燕和陈俊愉 , 1 991 ) , 但由于月季染色
体小 , 也给杂种鉴定带来一定的困难 。 随着分子标记
的发展 , 利用分子鉴定植物杂种的真实性 , 可以从
D N A 分子水平上获得最直接的证据 。 S S R 标记由于
具有共显性 ,丰富的多态性 ,重复性和稳定性好 ,操作
简单等特点 , 已成为目前用于鉴定真假杂种的最有效
的方法之一 (劳放业等 , 2 00 6) 。 本文主要采用 s s R 分
子标记鉴定结合形态学观察鉴定红刺玫和月季 `锦寒
1 号 ”杂交 F , 代的真实性 , 通过分析 , 明确杂种与父母
本的亲缘关系远近 , 并从中试图找出亲本的显 、 隐性
基因 , 为强化目标基因奠定基础 ,最终缩短育种周期 。
基金项 目: 上海市科委青年科技启明星计划 (04 QM X 145 9) 和上海市绿化管理局项 目(xz 05 02 09) 资助
分子植物育种
Mo l e eula rP lan tB re
ed in g
为一个位点 , 将每一扩增条带视为一个性状 , 将电泳
图谱上清晰且可重复出现的条带记为 ,’l ,’ 同一位置
没有条带记为“ O” ,这样按照带的有无构建多态性条
带 个 数 和 材 料 之 间 的 二 进 制 矩 阵 。 并 利 用
NT s y s
一
cP 2
.
1e0 软件进行聚类分析 。
2 结果与分析
.2 1 杂种 F l 代表现性状
将 2 0 0 4 年得到的杂交种子低温沙藏后于 20 05
年 4 月 13 日播种 ,第一粒杂交种子于 5 月 1 日发芽 ,
杂交 F : 代成苗后 , 当年长势良好 ,并且开花 ,初步显出
了杂种优势。 为了保持形态鉴定的真实性 , 出苗后的第
一年对杂交苗形态的观察记录仅做参考 、进行初选 , 杂
合性的鉴定以第二年的观察记录为主 (见表 l) 。
红刺玫和锦寒 1 号的杂交子代依据生长势 、 抗
性 、 适应性从强到弱依次为 : 杂 5一 1 , 杂 5一 2 , 杂 5一 6 ,
杂 5一 3 , 杂 5一 4 和杂 5一 5 (死亡 ) 。 从杂交的目的(重瓣
型 、 花香型 )出发 , 只有杂 5一 3 和杂 5一 6 为半重瓣 , 是
我们所要选择的性状 ; 其余为单瓣且具有父本红刺
玫单瓣的特性 。
.2 2 S S R 分子标记进行杂种鉴定
以母本锦寒 1 号和父本红刺玫的基因组 D N A
为模板 , 用有多态性 2 对引物物进行 S SR 扩增 , 6
对引物可获得双亲的多态性 。 再以杂 5 的 5 株植株
的基因组 D N A 为模板 , 用筛选出的引物进行 S S R
扩增 , 图 1是其中 1对引物的扩增结果 , 从图中可以
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369
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12
几j,`,山
1 材料与方法
L l材料
2004 年 5 月以红刺玫作为父本 、现代月季 `锦寒
1号 ”作为母本进行杂交 ,共得到 4 6粒杂交种子 ,低温
沙藏后播种 ,最后得到杂种苗 6株 , 并对其进行编号 。
L Z 甚因组 D N A 的提取
参照文献 (顾红雅和瞿礼嘉 , 19 98 ; 文晓鹏和邓秀
新 , 2 0 02 )适当修改 。 取 0 . 1 9 叶片放入 1 . s mL 离心管中 , 加入 6 00 泌 C TBA 提取液 ( 75 m o比翻 s 一H e l ,
1
.
0 5 mo 比 N a C I , 1 5 un o ljL E D T A
,
1
.
5% C T A B )和
钢珠 , 然后对 叶片进行研磨 1 面n (仪器型号 :
B i o R o b o t P lant S
e ien e e )
,
6 5 ,C水浴 60 m i n ; 加入等
体积的氯仿 :异戊醇 (2 :4 1) , 轻轻倒置混匀 10 而 n ,
12 00O r /n五n 离心 10 m in , 吸取上清液转至另一离
心管 ; 在重复抽提一次 ; 加入等体积的异丙醇 , 轻轻
颠倒混匀 , 一20 ℃冰箱中放置 30 m in , 10 00 r/ m i n 离
心 s m in 后析出 D N A ;加 75 %酒精清洗两遍 , 风干 ;
加 ddl p 充分溶解 。 紫外分光光度计检测 D N A 浓
度 , 稀释到 50 呵林L , 然后 一20 ℃保存备用 。
13 P C R 扩增
扩增在 PT c 一 10 仪器 (M J , u s )A 上完成 。 P c R
扩增体系及扩增条件参照文献 (B ar d ar et .al , 2 0 04) ,
采用 10 汕 的反应体系 : l o x p C R B u fer (含 Z un o比
M户 , 0 . 1 un o比 dN T p , 0 . 5林mo 讥 irP m e r , 0 . 4 U aqT酶 (鼎国生产 ) ,及模板 D N A 。 扩增程序为 : 95 ℃预变性
5 m in
, 然后 94℃变性 1 m in , 退火温度 1 m in , 72 ℃ 延
伸 1而 n , 35 个循环 , 最后 72 ℃延伸 30 m in , 4 ℃保存 。
s R 引物按等文献 (劝叻 9, 2 003 ;乔玉山等 , 2 0 04) 报道
的序列 由上海英俊生物技术有限公司合成 。
L 4 P C R 产物的检测
采用 6%变性聚丙烯酞胺凝胶电泳检测 P C R 扩
增产物 , 30 V , 电泳 Z h 。 电泳结束后取下凝胶进行
银染显色 , 先用 ddH 20 洗一次 , 10 m in ; 染色液为
.0 5% 的 A酬 0 3 , 染色时间为 10 而 n ; 水洗两次 , 每次
不超过 1 m in ; 显色液为 10 m g/ m工 的 N as p 3 , 1 . 5% 的
N ao H 和 0 .今场的甲醛溶液 ; 最后保存在 .0 75 % 的 Na -
C O ,溶液中 ,在紫外透射仪上观察 、 拍照 。
L S 数据统计分析
S S R 是共显性标记 , 同一引物扩增产物中电泳
迁移率一致的条带被认为具有同源性 。 每个引物作
168
15 8
图 1 hR 73 引物对杂种及其亲本的 S S R 扩增结果
注烤箭头所指的是父本的特异性条带 ,介箭头所指的是新条带
Fig 叮e 1 A m Pl iif e a it o n er s ult o f hR 73 irP m e sr in F : h沙ir d an d
N o :et 呼 址 ft 别r o w het m田t e sr of fa ht ;er 争 eR hgt a n D w het
n e 、 v m a r k e sr
s sR 标记及形态性状鉴定红刺玫和月季杂交 F : 后代
I d enit i f eait o n o fF
: H yb i rd sD ei rv edo f rm ht
e Co m b ina iton s
o fRo a san dM以l em RO s e
表 1杂交父母本以及 F : 代的主要形态特征
T ab l
e 1Ma in eha r
c t es ro fF l h yb i rdan d Pa ren t
形态特征 锦寒 l 号
Mo p rh o l o i gc a l eha r
et e rB o ra edo e el dl
株高(c m )8小 0 2 1
Pl an t h ei gh t ( em )
花色 粉红色
F IO weo r el o u ri Pn k
花径(c m )7. 小 8. 0
Fl o wi d er田爪
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花瓣数 l卜巧
Peat l n u m jb改
花期 5一9 月
Fl o ren s e e e eMa y
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S印 t.
结实率 高
R a t o ef s e ed H ihg
抗性 中
R s ei s加n L e eM edi u 幻。
杂 5一 1
H沙i rd s一 l
7 )0 10
杂 5 一 2
H yb i rd s
一 2
6小 0 0 1
杂 5一 3
H yb i rd s
一 3
杂 5一 4
H yb i d rs
一 4
53
尸碑 5
杂 5一 6
H y b i rd s一 6
0 6~8 0
红刺玫
R. m诚沙a r
0 0 ~4 10
粉红色
PID k
5. 5八 6
.
5
粉红色
Pink
3
.
5 、 4
.
5
粉红色
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5
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5 ~ 1 1月
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5一 11月
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粉红色
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5
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5
5一 11月
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.
N o v
低
o L w
强
S t ro n g
看出 : 杂交后代单株中大多数都包含了父本的特异
性条带 , 可确定为杂种 , 有的单株缺失了母本的特异
性带或出现了父母本都不具有的新条带 , 也可 以确
定为杂种 。 结合六个引物扩增结果来看待鉴定的 5
个单株确定为红刺玫和锦寒 1号的杂交后代 。
对 SS R 扩增结果进行聚类分析 , 结果见图 2 。 从
图中我们可以明显的看出母本锦寒 1 号和父本红刺
玫的 5 个杂交子代中 , 杂 5一 2 和杂 5一 4 与父本聚为一
组 ,杂 5一 1 、杂 5一 3 和杂 5一 6 与母本聚为一组 , 以 S SR
分子标记鉴定的杂交后代结果与形态鉴定结果相似 。
红刺玖 _
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3 讨论
.3 1 红刺玫野生资源的利用
已知的月季栽培品种有 25 00 多个 , 其中 80 %
是通过品种间的杂交得到的 , 但品种间杂交无法向
月季群体 中引入新遗传信息 (孙宪芝和赵惠恩 ,
20 03 )
。 因此要提高抗病虫害 、 抗早 、 抗寒 、 耐热等性
状 , 最佳 、 最直接的途径就是利用现代月季与蔷薇原
种进行远缘杂交 , 即陈俊愉教授经常提到的“ 野化育
种 ,’( 陈俊愉等 , 1995 )。 红刺玫野生种拥有现代月季所
不具备的优 良性状 , 因此 , 广泛开展红刺玫与不同的
现代月季进行远缘杂交对拓宽月季栽培种的遗传基
础 、 改良月季品种具有重要意义 。
到目前为止 , 还有很多蔷薇属种质资源迄今未
在国内外应用 , 参与创造现代月季的蔷薇原种也只
有 1小巧 个 , 只 占蔷薇原种总数的 1/ 10 (马燕和陈俊
0
.
14 0
.
19 0
.
2 3 0
.
2 8 0
.
33
C o e if e i e in
图 2 杂种及其亲本的聚类结果
F ig 万 e 2 D e n 山or g ar m o f e l u set r an a ly s is amo
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, hy b ir d an d
p ar e n st
愉 , 1 9 90) , 仍有大量的基因资源还没有或很少得到开
发利用 , 如将这些各具特色的遗传资源应用于现代
月季的育种 , 必将在培育月季新品种方面产生新的
突破 。
.3 2 刺玫月季杂种的分子鉴定
利用 S S R 分子标记 , 对锦寒 1 号和红刺玫的 5
个杂交后代单株真实性进行鉴定 , 6 对引物能很好地
区分杂交子代和父母本 , 其结果与形态鉴定结果相
似 。 因此 ,运用 S SR 分子标记 , 多引物结合在一定程
度上能准确地确定杂交后代的真实性 , 弥补了形态
学观察和细胞学观察的缺陷 , 同时即缩短育种的进
程 , 又提高了选择的效率 。
8 4 2
分子植物育种
Mo l ec l uar P l an tB r e
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