全 文 ：中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2014, 36(10): 1375–1381 DOI: 10.11844/cjcb.2014.10.0160
收稿日期: 2014-05-09 接受日期: 2014-07-02
福建省自然科学基金(批准号: 2011J01121)、福建省农业科学院科技创新团队建设(批准号: CXTD-2-17)和福建省农业科学院科技创新团队项目(批准号:
CXTD-2-1317)资助的课题
*通讯作者。Tel: 0591-87573019, E-mail: huangml618@163.com
Received: May 9, 2014 Accepted: July 2, 2014
This work was supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province (Grant No.2011J01121), the Development of Technology Innovation by Fujian Acad-
emy of Agricultural Science (Grant No.CXTD-2-17) and the Project of Technology Innovation by Fujian Academy of Agricultural Science (Grant No.CXTD-2-1317)
*Corresponding author. Tel: +86-591-87573019, E-mail: huangml618@163.com
网络出版时间: 2014-09-26 15:02 URL: http://www.cnki.net/kcms/doi/10.11844/cjcb.2014.10.0160.html
朵丽蝶兰二氢黄酮醇4-还原酶基因DtpsDFR的
克隆与表达分析
钟淮钦1,2,3 黄敏玲1,2,3* 吴建设1,2,3 樊荣辉1,2,3 林 兵1,2,3
(1福建省农业科学院作物研究所, 福州 350013; 2福建省农业科学院花卉研究中心, 福州 350013;
3福建省特色花卉工程技术研究中心, 福州 350013)
摘要 二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reduetase, DFR)是花色素苷合成途径中的一个
关键酶。该研究利用RT-PCR和RACE技术从朵丽蝶兰‘满天红’深红色花瓣中克隆获得一个DFR基
因, 命名为DtpsDFR。该cDNA序列全长1 286 bp, 编码378个氨基酸。氨基酸序列分析表明, Dtps-
DFR编码的蛋白与Bromheadia fi nlaysoniana、文心兰、大花蕙兰、石斛兰等兰科植物的DFR蛋白
同源性均在76%以上, 含有1个FR_SDR_e特征结构域, 存在NADPH结合基序和底物特异性结合基
序, 属于NADB_Rossmann超家族; 系统进化树显示, DtpsDFR与Bromheadia fi nlaysoniana的DFR蛋
白亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果显示, DtpsDFR基因的表达量随着花的发育逐渐降低,
凋谢期微量表达; 在花瓣、萼片中的表达量高于唇瓣, 在叶片和根中微量表达。
关键词 朵丽蝶兰; DFR基因; cDNA克隆; 基因表达
Cloning and Expression Analysis of Dihydrofl avonol-4-Redutase
Gene DtpsDFR in Doritaenopsis Hybrid
Zhong Huaiqin1, 2, 3, Huang Minling1, 2, 3*, Wu Jianshe1, 2, 3, Fan Ronghui1, 2, 3, Lin Bing1, 2, 3
(1Institute of Crop Sciences, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China;
2Flowers Research Center, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China;
3Fujian Engineering Research Center of Characteristic Floriculture, Fuzhou 350013, China)
Abstract Dihydrofl avonol 4-reductase (DFR) is a key enzyme in anthocyanin biosynthesis. In this study, the
full-length cDNA sequence of DFR gene was obtained from bright red petals of Doritaenopsis hybrid Queen beer ‘Red
Sky’ using RT-PCR and RACE techniques and designated as DtpsDFR. The cDNA sequence was 1 286 bp, encod-
ing a deduced polypeptide of 378 amino acids. Amino acid sequence analysis indicated that DtpsDFR protein shared
more than 76% homology with DFR protein from Bromheadia fi nlaysoniana, Oncidium, Cymbidium and Dendrobium.
DtpsDFR protein contains a FR_SDR_e domain, a NADPH binding motif and a substrate specificity binding site,
belonging to the NADB_Rossmann superfamily. Phylogenetic analysis clearly showed that the DtpsDFR was more re-
lated to DFR proteins in Bromheadia fi nlaysoniana. The result of quantitative RT-PCR analysis indicated that expres-
sion levels of DtpsDFR gene gradually reduced with the development of fl ower, micro-expression in faded period. The
transcript level was higher in petals and sepals than in lips, micro-expression in leaves and roots.
Key words Doritaenopsis hybrid; DFR gene; cDNA cloning; gene expression
1376 ·研究论文 ·
朵丽蝶兰(Doritaenopsis hybrid)为兰科(Orchidaceae)
朵丽蝶兰属 (Doritis), 是蝴蝶兰 (Phalaenopsis)与朵丽
兰(Doritis)杂交形成的杂交属[1]。虽广义上仍属于蝴
蝶兰属[2-3], 但其花色更加丰富艳丽, 花期更长, 具有
更高的观赏和经济价值, 成为商业应用最多的杂交
种类之一[1], 市场份额占商品蝴蝶兰一半以上。进一
步利用朵丽蝶兰进行品种改良成为了蝴蝶兰育种的
热点, 探讨其花色形成分子机制具有重要的意义。
花色素苷是类黄酮生物合成的产物之一, 在关
键酶基因和调节基因等的调控下, 影响着植物叶、
花和果实中红色、紫色和蓝色等颜色的一系列变
化, 其生物合成是目前研究最为清楚的植物次生代
谢途径之一[4]。二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol
4-reduetase, DFR)在花色形成中发挥关键作用, 是将
二氢黄酮醇催化为花色素反应的第一个关键酶, 属
于DFR超家族的还原酶[5]。DFR在辅助因子NADPH
的参与下, 可选择性地将底物二氢堪非醇(dihydro-
kaempferol, DHK)、二氢栎皮黄酮(dihydroquercetin,
DHQ)和二氢杨梅黄酮(dihydromyricetin, DHM)还原
为相应的花色素苷, 从而合成不同的花色素, 呈现出
各异的物种色彩[6-7]。在矮牵牛和兰花中, DFR不能
有效还原DHK, 但能有效催化DHQ和DHM, 最终导
致矢车菊素和飞燕草素在花瓣中的积累, 而无天竺
葵色素合成[8-9]。目前, DFR基因已从矮牵牛[10]、非
洲菊[11]、番茄[12]、葡萄[13]、百脉根[14]、茶叶[15]、石
斛兰[16]、马铃薯[17]和牡丹[18]等不同的植物物种中克
隆获得, 且在花色改良上已被应用[19-21]。
目前, 从分子水平上对朵丽蝶兰花色形成机理
的研究国内鲜有报道。本实验从朵丽蝶兰品种‘满
天红’深红色花瓣中克隆获得DFR基因cDNA全长,
并分析其编码氨基酸序列及其在花发育进程、不
同组织中的表达特性, 旨在为进一步了解朵丽蝶兰
DFR基因的生物学功能奠定分子基础, 为研究花色
的形成与代谢机理及应用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
以福建省农业科学院作物研究所花卉研究中
心种质资源圃保存的朵丽蝶兰品种‘满天红’(花瓣、
萼片与唇瓣颜色均为深红色)为供试材料。取盛花
期花瓣, 用于基因克隆; 取小花蕾(直径0.5~0.6 cm)、
大花蕾(直径1.6~1.7 cm)、始花期和凋谢期花瓣, 用
于花发育过程的表达分析; 取萼片、唇瓣、叶片及根,
用于不同组织的表达分析。材料剪取后迅速投入液
氮速冻后, 存入–70 °C冰箱保存。
大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存; RNA提
取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司; 实验
所用其他试剂及试剂盒购自宝生物工程(大连)有限
公司; 引物合成及测序均由上海生工生物工程技术
服务有限公司完成。
1.2 总RNA的提取和cDNA全长的克隆
采用多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取总
RNA。使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis
Kit反转录试剂盒合成cDNA第一链用于RT-PCR扩
增, 反转录引物序列见表1。
根据GenBank中石斛兰(登录号: FJ426271)、大花
蕙兰(登录号: AF017451)和文心兰(登录号: AY953937)
等兰科植物的DFR基因序列设计一对保守区特异引
物DFR-F、DFR-R(表1), 以反转录的cDNA第一链为模
板进行PCR扩增。扩增程序为: 94 °C 5 min; 94 °C 30 s,
57 °C 30 s, 72 °C 60 s, 35个循环; 72 °C 10 min, 4 °C保存。
根据DFR基因保守区测序结果, 设计3′端顺
式特异引物DFR3′(表1), 与通用引物AUAP(表1)配
对进行PCR扩增, 退火温度为58 °C。在已获得的
DFR基因序列的基础上, 设计两个5′端反式特异引
物DFR5′-1和DFR5′-2(表1), 以 反 转 录 的cDNA第
一链纯化、加尾液为模板, DFR5′-1配对通用引物
AAP(表1)进行第一轮扩增, 以第一轮PCR产物稀释
一倍液为模板, DFR5′-2配对通用引物AUAP进行第
二轮扩增, 退火温度为58 °C。
根据拼接获得的DFR基因cDNA全长, 设计
全长引物DFRO-F和DFRO-R(表1), 进行DFR基因
cDNA全长克隆, 验证已获得的序列。
PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, 回
收纯化后连接到pMD19-T载体上转化, 挑取阳性克
隆, PCR验证后送样测序, 获得基因序列。
1.3 序列分析
使用GenBank中的BLAST进行基因与推导的氨
基酸序列的检索与结构功能域预测; 利用DNA MAN
和Primer 5.0进行序列拼接及氨基酸序列比对等; 利
用BioXM 2.6对序列进行氨基酸组成、等电点等分
析; 利用ProtScale、TMHMM Server 2.0、SignalP 4.1、
PSORT和Prosite预测蛋白亲疏水性、跨膜区、信号肽、
亚细胞定位和磷酸化位点; 利用SOPMA分析蛋白二
钟淮钦等: 朵丽蝶兰二氢黄酮醇4-还原酶基因DtpsDFR的克隆与表达分析 1377
级结构; 利用MEGA4.0软件中的Neighbor-Joining(邻
位相连法, NJ)法构建系统进化树等。
1.4 实时荧光定量表达分析
根据已获得的DFR基因序列设计一对特异引物
RTDFR-F和RTDFR-R, EF1a为内参基因(表1)。采
用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit试剂盒合成cDNA
第一链, 内参基因EF1a检测cDNA完整性后–20 °C保
存备用。荧光定量PCR反应体系为20 μL, 其中cDNA
模板1 μL(反转录原液稀释10倍)、2×SYBR Premix
Ex TaqTM II 10.0 μL、10 μmol/L上下游引物各0.8 μL、
50×ROX Reference DyeII 0.4 μL、ddH2O 6.0 μL。在
ABI 7500荧光定量PCR仪上完成测定。
2 结果
2.1 DtpsDFR基因全长cDNA克隆与序列分析
根据GenBank中其他植物DFR基因保守序列设
计一对特异引物DFR-F和DFR-R, 以朵丽蝶兰‘满天
红’花瓣总RNA反转录的cDNA为模板, 进行PCR扩
增, 测序结果获得一条长度为275 bp的cDNA片段(图
1A), 编码91个氨基酸。经BLAST检索分析, 该序列
编码氨基酸属于NADB_Rossmann超家族(cl09931),
与文心兰、石斛兰等兰科植物的同源性达88%~91%,
初步确定此片段为朵丽蝶兰DFR基因的保守序列。
根据获得的保守区序列, 设计3′ RACE特异性
引物DFR3′与通用引物AUAP配对, 进行3′端RACE
PCR扩增, 测序得到长度为805 bp的3′端序列(图
1B)。根据DFR基因保守区和3′端序列, 设计2个5′
RACE特异反式引物DFR5′-1和DFR5′-2, 以cDNA第
一链加同聚物尾合成第二链为模板进行巢式扩增,
测序得到长度514 bp的5′端序列(图1C)。
根据获得的DFR基因保守区、5′端和3′端序列,
拼接出全长cDNA, 并设计一对全长引物DFRO-F和
表1 朵丽蝶兰DFR基因克隆及表达分析引物
Table 1 Primers used to isolate and analyze the expression of DFR gene in Doritaenopsis hybrid
引物名称
Primer name
引物序列(5′→3′)
Primer sequence (5′→3′)
作用
Function
DFR-F ACT CCC ATG AAT TTT CAA TCC For the conserved fragment
DFR-R AAC TCC CAA GCA GCC TTC TC
DFR3′ ACC CGA GTC AAA ATG ACC GGT TGG A 3′ RACE
DFR5′-1 TTA TGA AGG AAC CCA CCA CC 5′ RACE
DFR5′-2 GTG ATG AAA TTG AGG TCG CTC C
AP GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC(T)17 Reverse transcription
AUAP GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC 3′ RACE、5′ RACE
AAP GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC(G)10 5′ RACE
DFRO-F GGA AGA AAT GGA GGA TGA GAG For the cDNA of full-length
DFRO-R CAG TCA AAA TAT AAC CAC GC
RTDFR-F TTC AAT CCA AAG ACC CTG AGA AC For the expression of DtpsDFR
RTDFR-R TTA CGC TGC CTG ACC TCT TG
EF1a-F AGA CCA CCA AGT ACT ACT GCA C For the internal control
EF1a-R CCA CCA ATC TTG TAC ACA TCC
M: DL 2000 marker; 1: 保守区扩增产物; 2: 3′ RACE扩增产物; 3: 5′ RACE扩增产物; 4: 全长扩增产物。
M: DNA marker DL2000; 1: product of conserved region; 2: product of 3′ RACE; 3: product of 5′ RACE; 4: product of full-length.
图1 朵丽蝶兰DtpsDFR基因的PCR扩增结果
Fig.1 PCR amplification products of DtpsDFR gene in Doritaenopsis hybrid
(A) (B) (C) (D)M 1 2 3 4M M M
2 000
1 000
750
500
250
100
bp
1378 ·研究论文 ·
DFRO-R进行PCR扩增, 目的片段符合预期(图1D),
经BLAST比对确证其为朵丽蝶兰DFR基因序列, 命
名为DtpsDFR。该cDNA全长为1 286 bp, 具一个完
整的开放阅读框(第17~1 152个碱基), 共1 136个碱
基, 编码378个氨基酸; 序列含16 bp的5′非编码区和
134 bp的3′非编码区[含22个poly(A)]。推测其编码
蛋白的分子量为43.23 kDa, 理论等电点为6.52。该
cDNA序列GenBank登录号为KF263660。
2.2 DtpsDFR基因编码蛋白结构分析
利用ProtScale分析结果表明, DtpsDFR蛋白在
9~26、74~88、186~200、358~375等氨基酸位置存
在多个可能的疏水性区域, 总体来说, 整个肽链中亲
水性氨基酸残基的数量多于疏水性氨基酸残基, 推
测DtpsDFR具有亲水性; TMHMM跨膜结构预测表
明, 位于DtpsDFR蛋白的360~378处存在1个跨膜区
域, 位于疏水区内; SignalP 4.1预测表明, DtpsDFR蛋
白没有信号肽, 不属于分泌蛋白; PSORT分析发现,
DtpsDFR蛋白定位于质膜, 说明朵丽蝶兰DFR蛋白
可能属于胞质蛋白。
利用SOPMA对DtpsDFR蛋白多肽链的二级结
构预测。由图2可见, DtpsDFR蛋白以α-螺旋(α-helix)、
无规则卷曲(random coil)为主, 延伸链(extend strand)
为 辅, 分 别 为45.65%、35.09%和12.40%, β-转 角
(β-turn)所占比率最低为6.86%, 验证了DtpsDFR属于
稳定蛋白。Prosite预测分析发现, DtpsDFR蛋白含8
个蛋白激酶C磷酸化位点、8个酪蛋白激酶II磷酸化
位点、2个N-酰基化位点和1个cAMP和cGMP依赖
性蛋白激酶磷酸化位点。众多磷酸化位点的存在说
明, DtpsDFR蛋白的功能中可逆磷酸化调控起重要
作用。
2.3 DtpsDFR基因编码蛋白同源性分析
将朵丽蝶兰DtpsDFR基因完整开放阅读
框编码的蛋白序列与其他植物DFR蛋白进行同
源性多重对比分析(图3), 该序列与Bromheadia
fi nlaysoniana(AAB62873)、石斛兰(CAR64530)、文
心兰(AAY32600)和大花蕙兰(AAC17843)等兰科植
物的同源性达76%~86%, 与其他非兰科植物DFR
蛋白的同源性在62%~72%之间, 并含有该家族同
源基因相似的中央编码区, 具有典型的DFR蛋白
功能结构域。DtpsDFR编码蛋白9~304位氨基酸具
有类黄酮脱氢酶/还原酶FR_SDR_e结构域, 属于
NADB_Rossmann超基因家族, 该结构域中分布着
NADPH活性位点和底物特异性结合位点。由图3可
见, DtpsDFR蛋白N-端存在一个由21个氨基酸残基构
成的NADPH结合位点“VTGASGYVGSWLVMKLL-
RKGY”, 该序列在不同植物中高度保守; 还存在一
个由26个氨基酸构成的底物特异性结合区“TVN-
VEEHQAPVYDESSWSDLNFITRV”, 决定其底物的
特异性, 该序列在不同植物中有明显的变化。同时,
DtpsDFR氨基酸序列在134位与145位的氨基酸分
别为N(天冬酰胺)和E(谷氨酸), 说明其还原底物为
DHK。
为了进一步了解DtpsDFR与其他植物DFR蛋白
间的进化关系, 采用MEGA5.05软件的NJ法构建系
统进化树(图4)。结果表明: DFR蛋白的进化基本符
合植物分类学分类, 即单子叶与双子叶植物分属于
各自的聚类簇。在单子叶植物中, DtpsDFR与同属
兰科植物的Bromheadia fi nlaysoniana、石斛兰、文
心兰和大花蕙兰的DFR蛋白处于同一亚类, 亲缘关
系最近; 与同为单子叶植物的小麦、玉米等禾本科
作物亲缘关系最远, 聚为不同亚类。在双子叶植物
中, 杜鹃花与菊花聚为一个亚类, 甜樱桃与月季聚为
同一亚类。
2.4 DtpsDFR基因的表达分析
利用实时荧光定量PCR技术检测DtpsDFR基因
在花发育进程及不同组织中的相对表达量。由图5
可知, 在花瓣中, DtpsDFR基因随着花瓣的发育相对
表达量逐渐降低, 花朵完全开放后, 花色素逐渐停止
α-螺旋(蓝色); 无规则卷曲(紫色); 延伸链(红色); β-转角(绿色)。
alpha helix (blue); random coil (purple); extended strand (red); beta turn (green).
图2 朵丽蝶兰DtpsDFR蛋白二级结构预测
Fig.2 Predicted secondary structure for the DtpsDFR protein of Doritaenopsis hybrid
50 100 150 200 250 300
钟淮钦等: 朵丽蝶兰二氢黄酮醇4-还原酶基因DtpsDFR的克隆与表达分析 1379
0.05
100
75
97
100
99
100
50
43
97
100
34
56 Bromheadia finlaysoniana AAB62873
Dtps. ‘Queen Beer’ AHA36975
Oncidium hybrid cultivar AAY32600
Cymbidium hybrid cultivar AAY17843
Dendrobium hybrid cultivar CAR64530
Iris×hollandica BAF93856
Lilium hybrid division BAB40789
Triticum aestivum BAD11019
Zea mays NP 001140905
Rhododendron simsii CAC88859
Chrysanthemum x morifolium AEN69001
Citrus sinensis AAS00611
Vitis bellula AFG28176
Prunus avium AEO79982
Rosa hybrid cultivar BAH24302
Dtps: 朵丽蝶兰‘满天红’; Bf: 地生兰; Db: 石斛兰; Od: 文心兰; Cd: 大花蕙兰; Ir: 荷兰鸢尾; Cs: 甜橙; Ro: 月季; Ta: 小麦; 第一、第二条下划线分
别表示NADP(H)结合位点和底物特异性结合基序; 方框处表示DtpsDFR跨膜结构域。
Dtps: Doritaenopsis hybrid ‘Red Sky’; Bf: Bromheadia fi nlaysoniana; Db: Dendrobium hybrid cultivar; Od: Oncidium hybrid cultivar; Cd: Cymbidium
hybrid cultivar; Ir: Iris×hollandica; Cs: Citrus sinensis; Ro: Rosa hybrid cultivar; Ta: Triticum aestivum; The first solid-underline stands for NADP(H)-
binding site and the second solid-underline stands for substrate specificity site; Box stands for the DtpsDFR transmembrane domain.
图3 DtpsDFR与其他植物DFR氨基酸序列多重比对
Fig.3 Multiple sequence alignment of predicted amino acid sequence of DtpsDFR with other DFR proteins
图4 朵丽蝶兰DtpsDFR与其他14种植物DFR蛋白的系统进化分析
Fig.4 Phylogenetic analysis of DtpsDFR in Doritaenopsis hybrid with 14 other plant DFR proteins
1380 ·研究论文 ·
积累, 基因停止转录, 凋谢期只有微量表达。由图6
可知, DtpsDFR基因在花瓣、萼片中的表达量大于
唇瓣, 在叶片、根中仅微量表达。
3 讨论
DFR基因是花色素苷生物合成途径中后期表达
的第一个关键基因, 在不同花色的形成中起着重要
的调控作用[10]。本研究利用RT-PCR和RACE技术从
朵丽蝶兰‘满天红’深红色花瓣中成功克隆获得Dtps-
DFR基因, 其cDNA全长为1 286 bp, 编码378个氨基
酸, GenBank登录号为KF263660。DtpsDFR编码蛋
白为胞质蛋白, 具有典型的DFR蛋白功能结构域,
同时含有FR_SDR_e结构域和NADB结构域; N-端
存在一个NADPH结合的保守基序“VTGASGYVG-
SWLVMKLLRKGY”, 中间存在一个由26个氨基酸
构成的底物特异性结合区域。
在复杂的花色素合成过程中, DFR在不同植物
中特异地选择底物, 生成不同的花色素。而DFR对
不同底物的结合是由底物结合区的氨基酸序列所决
定的。Johnson等[22]发现, 底物结合区中的134位与
145位的氨基酸可直接影响酶的底物特异性, 大多
数134位为N(天冬酰胺)的植物均能以DHK为底物
合成天竺葵色素; Johnson等[9]发现, 兰属植物的DFR
不能有效还原DHK产生天竺葵素, 而使其缺乏橙色;
但Bromheadia fi nlaysoniana、石斛兰、大花蕙兰等
兰属的DFR基因中均存在134位的N特异氨基酸, 这
表明兰属植物的DFR底物特异性位点可能不是134
位的N位点。推测可能是由于DFR和F3′H竞争相同
底物DHK, 决定了DHQ和DHK的不同表达水平, 从
而呈现不同的花色[23]。本研究获得的DtpsDFR存在
134位的N特异氨基酸, 但朵丽蝶兰花色素主要成分
为矢车菊素, 天竺葵素含量极低, 这似乎与上面的
推测相一致, F3′H和DFR之间的竞争决定了DHQ和
DHK的不同表达水平。
朵丽蝶兰DtpsDFR氨基酸序列多重比较和系统
进化树分析发现, DtpsDFR与其他物种来源的DFR
具有较高同源性, 与Bromheadia fi nlaysoniana、石斛
兰、大花蕙兰和文心兰同源性均达76%以上, 进化
树聚类分析进一步证实了DtpsDFR蛋白与兰科植物
的DFR蛋白亲缘关系较近, 不同植物DFR按照种属
特征聚为一类。这些均证明了分离得到的DtpsDFR
具有DFR蛋白典型的结构特征和生物特性。
研究表明, 不同物种的DFR基因在花发育进
程及不同器官中的时空表达特性有所不同。Ina-
gaki等[24]发现, 裂叶牵牛突变株的DFR-B基因会造
成花色的多样性, 其mRNA在幼小的花蕾中大量
累积。Nakatsuka等[25]发现, 亚洲百合粉红色品种
‘Montreux’的DFR基因在着色的被片、花药、花丝、
雌蕊和红色鳞片中大量表达, 其表达量随着花的发
育而增加, 开花达最高; 而在黄色品种‘Connecticut
King’未着色的叶子、茎与白色鳞片中未检测到
DFR基因的表达。周琳等[18]利用实时荧光定量PCR
检测发现, 牡丹PsDFR1在花色素大量积累的花瓣
中表达量最高, 其次是萼片和雄蕊, 再次是叶片, 心
皮中表达量最低。本研究克隆获得的DtpsDFR基因
的表达量随着朵丽蝶兰花的发育逐渐降低, 花朵完
全开放后, 花色素逐渐停止, 到凋谢期仅微量表达;
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
1 2 3 4 5
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
1 2 3 4 5
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1: 小花蕾; 2: 大花蕾; 3: 始花期; 4: 盛花期; 5: 凋谢期。
1: small bud stage; 2: big bud stage; 3: early flowering season; 4: bloom
stage;5: wither period.
图5 DtpsDFR基因在花发育进程中的相对表达量
Fig.5 Relative expression quantity of DtpsDFR gene in
different growth periods of flowering
1: 花瓣; 2: 萼片; 3: 唇瓣; 4: 叶片; 5: 根。
1: petal; 2: sepal; 3: lip; 4: leaf; 5: root.
图6 DtpsDFR基因在不同组织中的相对表达量
Fig.6 Relative expression quantity of DtpsDFR gene in
different tissues
钟淮钦等: 朵丽蝶兰二氢黄酮醇4-还原酶基因DtpsDFR的克隆与表达分析 1381
DtpsDFR基因在花瓣、萼片中的表达量大于唇瓣,
在叶片、根中仅微量表达, 不同组织间的表达差异
显著。以上说明, DtpsDFR的表达具有一定的组织
特异性, 只在着色的组织中表达, 且表达量的高低与
花色素苷的积累相一致, 推测DtpsDFR可能在转录
水平上参与朵丽蝶兰花色形成的调控。
本研究成功克隆到朵丽蝶兰DtpsDFR基因全
长, 并对其编码蛋白结构、同源性及组织表达特异
性进行了分析。我们接下来的工作将构建DtpsDFR
基因原核表达载体和植物表达载体, 转化烟草或矮
牵牛, 通过基因过量表达、酶活性测定等技术, 进一
步验证其在花色苷生物合成中的功能, 为进一步明
确DtpsDFR基因在朵丽蝶兰花色形成中的分子调控
机理奠定了技术基础, 也为从分子水平上进行朵丽
蝶兰品质改良提供理论依据。
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