全 文 ：第 15 卷 第 2 期 生物化学与生物物理学报
1 98 3 年 3 月 A O T人 B IO C HIM IC A e t B IO P HY S ICA S IN IC A
Vl o
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1 5
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M aer h
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1 9 8 3
蓖麻蚕 (hP ilo : a m l’a cy n t h ia ; ic in i)后丝腺体甘氨酸转移核糖核酸
的全核昔酸顺序
李文琴 曹功杰 祁国荣 王德宝’
(中国科学院上海生物化学研究所)
摘 要
按照 S a n g er 等建立的前标记指纹图谱法 , 并采用稍加改进的电泳装置 , 测 定 了蓖 麻蚕
(几 lo sa 、 他 勺川从 a 八` 雨 )后丝腺体甘氨酸转移核糖核酸 (t R N A由 ,) 的全核普酸顺序。 它由 74
个核普酸组成 , 反密码子为 G C 。 每分子 t R N A GI , 含 T 、 价、 D 和 m l人各一分子” , 3 . 2 分子
m吧 和 约 0 . 4 分子 U m 。 与家 蚕 (B 口。妙二 , or ` )七R N A甲l y (反 密码 子为 G C )C 比较 , 蓖 麻蚕
tR N oA
l 仅在某些部位上修饰程度较低。 除此以外 , 两者顺序非常相似。
文中讨论了真核生物 tR N人lG y 的结构特征和均一性。
由于蚕在五龄后期其后丝腺体具有迅速合成专一蛋白质— 丝心蛋白的功能 , 因而它是一个很吸引人的研究体系 。 关于家蚕丝 心 蛋 白基 因及 R N A 基 因 的研究进 展 很
快以~ 司 。 F o ur n i er 曾收集了 1 978 年以前关于家蚕研究 (包括 D N A 和 R N A ) 的大量数据
并写成综述〔6] 。 家蚕丝心蛋白 m R N A 的一级结构 , 目前已有初步了解 , 它是由丝心蛋白
基因的核昔酸顺序反推得到的山 。 家蚕后丝腺体 S S r R N A 的一级结构 已 经发 表m 。 迄
今 , 这个组织 t R N A 的全核昔酸顺序被测定的有 : 七R N A之梦幻 、 七R N A护, , 1们 、 七R N A罗,比 ,和
t R N A p
h· 以 , ] 。
蓖麻蚕与家蚕同属鳞翅 目但不同科 , 它们具有极相似的生理特征 。 蓖麻蚕个体大 , 后
丝腺体粗 , 杂食性强 , 但丝质较差 。 为了探讨两种蚕丝心蛋 白生物合成的异同 , 我们选择
了蓖麻蚕作为研究对象。 洪国藩等测定蓖麻蚕后丝腺体 t R N A 五 1. 的核昔酸顺序的初步结
果已经发表以幻 。 最近 , 我们已经完成了蓖麻蚕后丝腺体 5 8 r R N A 的全核昔酸顺序以 J , 全
文即将发表。 本文报道 七R N A lyG 的全核昔酸顺序 , 它由 74 个核昔酸组成 , 反密码 子 为
G OO
, 与家蚕反密码子为 G O O 的 t R N A卯, 结构相比 , 除 了具 较低 修饰程度 外非常相
似。
测定 R N A 顺序的方法发展很快 , 近年来出现了各种“ 直接阅读” R N A 顺序的方法。
本文 1 9 81 年 9 月 3 日收到。
. 本所吴仁龙 、 辜祥荣 、 冯亚雄 、 竺来发和第四 军医大学钱微 , 军事医学科学院秦那德等曾先后参加部分工作。 本
所庄熙孟同志协助拍照 , 特致谢意 。
. 本文采用下列缩 写符号 : T , 胸普 (酸 ) ;价, 假尿昔 (酸 ) ; D , 二氢尿普 (酸 ) ; m 1 A , 1一甲基腺普 (酸 ) ; m犯 , 5一甲基胞
着 (酸 ) ; U m , 2口一 0一甲基尿昔 (酸 ) ; U . 、 A 价 为未知结构的 U 、 A 的衍生物。
1阳 生物化 学与生物 物理学报 1 5卷
但是无论哪一种直读法都可能存在一定误差 , 同时也难以对付含修饰成分较多的 七R N A ,
因而经典的指纹图谱法仍是一种有效技术。 蚕是比较易于制备体内同位素标记 R N A 样
品的材料 , 故我们采用前标记指纹图谱法测定了 七R N驴 l’ .的全核昔酸顺序。
方 法 和 结 果
一 、 旅麻蚕后丝腺休 t R N A O l l 的分离纯化
参照 助五妙 和 8诫拯 方法以 01 对五龄第二天 、 第四天蓖麻蚕 (白黄种 )份二次注射无载
体 ” P一磷酸二氢钠 (北京 4 0 1 研究所产品 ) , 按辜祥荣等山 ,方法抽提五龄第五天的后丝
腺体中 3 , P 标记的小分子 R N A 。 用含 7卫 尿素的 1 0沁聚
丙烯酞胺凝胶电泳进行分离 , 结果 见 图 1。 其 中带 3 为
; 七R N A G扮 (比强每徽克约为 2 ~ 4 又 1 0 4 d P功 ) 。 参照 P “ t ie
一 的方法哪 ,从凝胶条带抽提出 . ,-P 七R N A曲 , 从接受 ” H一甘
氮酸量山 ,或从指纹图谱中非 t R N启夕l y 酶解产物的杂点含
量计算 , t R N A G珍 纯度约为 8 0多 , 可用于结构测定。 如果
第一次凝胶电泳分离效果较差 , 可用 20 多凝胶进行第二次
纯化。
图 1 ” P 标记的蓖麻蚕后部
丝腺体小分子 R N A 的分禽
( 10 % 来丙烯陇胺凝胶电泳)
带尔长日N A GI ,
二 、 t R N A曲 完全醉解产物的分离及片段顺序鉴定
: 将 ” P 一七R N oA ly 分别用 R N as6 T : 和 R N ` 拍 A 完全 酶
` 解。 酶解产物按照 S a n g e r 等山 , 建立的方法 , 并采用稍加
改进的电泳装置进行双向纸 电泳分离山 J , 分离图谱分别见
图 2 和图 3 。 各放射 自显影点用晶体闪烁计数器计数 , 以
计算它们之间的克分子比 , 然后进行洗脱 , 经 R N创拍 T, 酶
解 , 用双向薄层层析确定酶解产物的核昔酸 (包括修饰核昔
酸 )组成山 , , 0J 。 表 1 和表 2 分别总结了酶解产物的鉴 定 结
果 。
用重叠法得到含修饰成分的片段及末端片段顺序如下 :
(1) 5’ 端六核普酸顺序的确定: T l e 7 和 A e g 的组成分别 为刃 p 和 尹 p + O p , 故
泞端为姆0 。 在 A 一3 和 T 二-1 1 中 , 除了常见核昔酸外, 在 G p 和 G p 之间有一组分 (见图
匀 , 参照文献报道幽 , 该位置为碱稳定二 核昔酸 U m o 或 Om U , 由于所 有真核生物
任出汰曲 的 5, 端第 4位常为 2, e o一甲基喻陡核 背酸 Cm P 或 Um p山幻 , 而家 蚕后 丝 腺体
场困人曲 为 U m P山 J , 故推断 A e s 为 A Um o , T厂 1 1 含 O A U m OG 。 进 一 步 分析 A U功O
含量 (表 l) 和里厂 1 1 的组成数据 (表 2 )发现 , A U m o 或 U m O 含量均过低 , 前者只 0 . 4 分
子 , 后者为 0 . 35 分子 ;若考虑 A招 (表 l) 有 0 . 6 分子 人U , 而 T i es l l 中存在 0 . 4 分子 U , 则
幼派A G I , 的 5’ 端第 4 位 U m 只 含 40 ~ 肠多 , 而未 修饰 的 U 占砧~ 60 多。 故 T i we l l 为
O A U OG 与 OA U m OG 的混合物 , 两 者 比例 约为 6 : 4 。 与 GP O 重 登得 到 5, 端顺序为
. 白黄种蓖麻蚕先后由中国农业科学院蚕业研究所 (镇江 ) , 广西蚕业指导所和广东蚕种萦殖试脸场提供 , 特致
古意 。
2 期 蓖麻蚕 (Ph 伽 8 a仍沁 。卯认妇 月成州) 后丝腺体甘氨酸转移核糖核酸的全核普酸顺序 16 9
飞
、 .J
去
乌
图 2 ” P 标记的蓖麻蚕后部丝腺体 七 RN护j 1
的 N R a阳 A 全酶解产物的双向电泳分离
第一向 , 醋酸纤维素纸电泳 , PH S
.
5 ;
第二向 , D E人E 一纤维素纸电泳 , 7% 甲酸。
图 3 ” P 标记的蓖麻蚕后部丝腺体 七R N人价
的 R N创拍 lT 全酶解产物的双向电泳分离
分离方法同图 2 。
表 ; 蓖麻蚕后部丝腺体 t RN oA l 的 RN o s e A 的全酶解产物
3
M
哈 · J,
N O
. 顺 序 克 分 子 数 B N别犯 T ,全阵解产愉
实 验 值 理 论 值
1 U
, 沙 5 . 5 5 U , 价
2 A U 0
.
6 1 1
.
1人 : l 。 OU
3 A U m o 0
.
4 1
.
0人 : 0 . 6 5 U m C
4 G C 4
.
2 5 0
.
SG : 1
.
0 0
5 C
, 功怕 1 1 . 9 1 3 C , 功屹
6 A C 1
.
9 1 2
.
1人 : 1 . 3 0 : 1 . Om叼
人m `O l
7 e 功生A U 0 . 9 1 1 . 〕 3 : 1 . 0m l人 : 1 . 0 U
8 日G O 1 . 5 1 3 . 6G : l . OC : 1 . 0m `0
GG m叼 l
匀 尹 O 0 . 8 1 0 . 8闪 : 1 . 0 0
1 0 人G U 2 . 0 1 1 . 2A : 1 . 0口: 1 . 0U
G么U l
1 1 A G A人U 0 . 3 1 3 . OA : 1 . 0口: 1 . OU
1 2 G O G O 0
.
5 1 3
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Q3 : 1
.
0 0
1 3 e G U 2
.
4 2 6
。 今口: 2 。 ZU : 1 . OD
G G D 1
1 4 日召G T 0 . 7 1 3 . 石G : 1 . OT
决。
毒
咨
4
1帕 生物化 学与生物物理 学报 1 5 卷
表2 蓖麻蚕后部丝膝体 t RN A G扮 的RN os e T :的全醉解产物
N O
.顺 序 克 分 子 数 B N ase 马全酶解产物
实 脸 值 理 论 值
1 G 1 2 9 e
2 O G 2
.
3 2 1
.
3C :1
.
0(牙
3 以石 1 1 2 .以 ) :1 。 0 3
4 砂Om叼功叱籽 1 .4 1 2 .3z nOC :1 .0 0 :1 .0 3
5 CC A m 肠O口 0 .9 l 2 1 .01 : .OA :0 .8m叼 0 : .S G
6 UQ 2
.
5 2 1
.
4 U:1
.
0口
7 尹 0 .9 1 夕
8 D A G 1
.
1 1 0
.
gD :1
.
0A :1
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0 G
9 仪用Q 2 .0 1 2 .1 0 :1 。 O U:O .7 G
O UO G l
1 0 人 UG 一 l 1 .OA :1 .0 U:0 .留〕
1
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2
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2 0 :1
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0A :0
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35工 Jm C :
(C A m O G U) 0
.
S G0 :
.盛 U
1 2 A 人 G U0 .8 1 1 .7A :1 .O U0 : .S G
1 3 OA O 入阳 0
.
8 1 3
.峨X〕 :1 。 OA
1 4 功主人 IJ U以X 灯 0 .8 1 1 .4 m 1A :2 一O U: 3 .1 0 :0 .8 G
15 士冈e 1 .1 1 0 .S T :1 .妙1 : .20 :1 .叮
1 6 UJ IOA G 0
.
8 1 2
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IU:1
.
3C :1
.以 }:0 .9 A
鑫笋
圈 4 tRN A 由 , 的 T l以 1 和 启尸 3片段的 RN a se 几全酶解产物的双向分离自显影图谱
分离用橄晶纤维素薄板层析。 第一向溶剂: 异丁酸一 SM N只刃 H ( 6 :3 , V / V )层析由下而上。 第二向溶剂: 异丙醉 -浓盐酸-水 (7 0 :1 5 : 15 V八 /V )层析由左而右。
牵薰和 .苹鱼 i, “ ” 中前者略“ 于 ” 者 。 家蚕 NtR妙 的 ” ` 端第 ` “
. 实线表示 B N别拍 A 阵解片段 ,应线表示 B N 目” T l 醉解片段。 下同 。 乙
2 期 蓖麻蚕 (p 从沁。 , 记 c尹右从 a “ ` 川 )后丝腺体甘氨酸转移核糖核酸的全核普酸顺序 171
约有 2 0沁未修饰的 U (从文献 〔1。〕推算 ) , 而蓖麻蚕 七R N A lyG 为 6 0外 , 表示蓖麻蚕在该处
的修饰程度低于家蚕。
(2 ) G G D A G 顺序 的确定 : A 一1 3 组成分析指出存在 二分 子 G G U 和 一 分 子 G G D ;
T二 3 组成为 D p 、 A p 和 G p , 故含 D p 的片段顺序是
部位 , 见后文 ) 。
工石石D A G , (G G u 存在于 七R N A G I , 其他
t t 丁
(3 ) 含一分子 m叼 p 片段顺序的确定: A 一6 为二核昔酸 , 由 A O 和 A m OO 构成 ; T -l 6
组成为 o p , 砂伽 , A p 和 G p , 其中 o p 含量为其余三种的二倍 , 按照 R Na se 的专一性 , 该
4 4 去 4片段顺序可能是四画熙浏巫巫些 ; 考虑到 GO 是翩 A lG 的一种反密码 子 (见
图 6) , 同时 , 蓖麻蚕与家蚕 七R N A lyG 应有类似结构 , 故其排列是 G OO A m叼G 。
(4 ) 含多个 m叼p 片段顺序的确定 : A 一8 组成分析指出含 G G O 和 G G m叼 ; T l -4 中
m叼 : 0 : G 一 2 . 3 : 1 . 0 : 1 . 0 (其中砂。 : 0 一 7 : 3) 。 与家蚕相比较 , 以 m 6 0 为中心重叠得致
4 上片段顺序不硬夔旦里翌马但在 m叼 堆 中约 有 ” ” ” 为未 修饰 的 “ 。 (oG “ 存 在 ,
七R N A GI了的其他部位 , 见后文 )
(5) G G G T叩G 顺序的确定 : 除少数例外 , t R N A 分子中都具有 T闪 G 顺序 。 T -l 1 5
二 二 工为 T卿 , “ 4 为 GGT , 两片段重叠顺序是丽聊熙尸 这和NtR妙 的 “ Nase A 全
酶解产物有 功p 而无 TP (见 A一分析 ) 的结果完全相符。
(6 ) 0砂A U U CC C G 八核昔酸顺序的确定 : 在我们采用的薄层层析条件下 , 砂A p 的
位置紧靠 A p , 而稍偏下阁 。 午7 组成为 G p , m 1 A p 和 U p , 用 R N a s e 叭 再 酶解得 到 G P,
故顺序为 Gm 1 A U (区别于扮 1 0 中的 G A U ) 。 T l se 1 4组成 m 1 A p : U :P O:P G p 一 1 . 4 : 2 .价
3
.
1 : 0
.
8
, 即为 (砂A U刃a) G , 按 m1 A 重叠结果为 Gm 1 A U (U Oa ) G , 如后文所分析 , 根据氢
J键配对规律 , 该片段顺序为毛石项刃UC OC G
。
于一一 ~一 - 一 - - 一介
(7 ) 3, 端 GOA 0 0 A oH 顺序的确定 : 在 R N a se T: 酶解产物 T -l 13 中无 Gp , 即为 3’ 端
片段 , 其中 O:P A p ~ 3 : 1 , 因此除 C C A oa 末端外其 泞 邻位还应存在 O p 和 A p 各一分子。
考虑到在绝大多数 七R N A 三叶草结构中 , 3’ 端起第 5 个核昔酸需与 5’ 端的第 1 个核昔酸
氢键配对 , 故末端顺序为 。石大。右A oH
个 T
三 、 t R N A oly 的 R N a B e T : 部分酶解产物的分离鉴定和全核普酸顺序的确定
为了将上述含修饰成分片段以及其他全酶解片段重叠得到 七R N oA ly 的全核昔 酸顺
序 , 我们采用经典的部分酶解方法以7J 。 但部分酶解条件和产物的分离方法有所改变。 部
分酶解参考 D o n 让卜K e l e r 等哪」条件进行 : 5 微升反应液含 50 、 10 微克 朋卫` t R N A曲 , 2 0
m万 柠檬酸钠缓冲液 , p H S , 1 m M E D T A 一N a , , 7万尿素 , 0 . 0 2 5多二甲苯蓝 , 0 . 025 多澳
酚蓝和 10 单位 R N a se 几 , 于 石O~ 毖℃ 保温 巧 分钟 , 产物用 1 0多聚丙烯酞胺凝胶 (40 x
1 5 火 0 . 1 厘米 )分离 , 放射自显影后 , 割下所需条带 , 并转移至 20 外 凝胶平板中 (40 x 25 x
0
.
15 厘米 )进行第二次分离。 将抽提得到的纯的部分酶解片段 , 用 R N ase 叭 完全 酶解 ,
7 12 生物化学 与生物物理学报 15卷
按图 3 条件进行双向电泳 , 根据所得指纹图谱 , 对照图 3 中各点位置 , 并参考表 2 中片段
分析结果 , 得到相邻片段信息 , 从而重叠得 七R N A G ly 的全核昔酸顺序 , 见图 5 。 蓖麻蚕后
丝腺体 七R N A ol 的二级结构见图 6 。 图中二处括号说明 : 5’ 端第 4 位存在约 40 多U m ; 第
48 ~ 48 位三个砰O 中含 30 沁未修饰的 0 (见讨论 ) 。
图 5 蓖麻蚕后部丝腺体甘氨酸转移核搪核酸的全核普酸顺序
顺序下的线条表示 ` 已N 人 1G , 用 丑囚朗。冲1部分酶解所得到的片段
^ ;’.
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图 6 蓖麻蚕后部丝腺体 tR N护 l’ 的二级结构
讨 论
包括本文报道的 讯N A lyG 在内 , 近年来测出一级结构的 七R N A曲 (包括同功受体及校
正 七R N启夕行)共 25 个。 幻 , 其中原核生物 18 个 , 真核生物 7 个。 原核和真核的 七R N oA l 相
比 , 其一级结构有明显的差别 。 而真核生物 七R N A曲本身 , 约有 70 多为恒定 或半 恒定
(即同为啥陡或嗓吟 )核昔酸 , 其中特别是 T价臂具最大的保守性 , 只反密码茎差别较大。
G u p协 等洲 认为 , 既然 T功臂与氮酞 t R N A 合成酶结合无关 , 因而可能在 t R N A Oly 中 〕冲
稗的保守核昔酸顺序具有其他的生物功能。
在已知结构的真核生物 七R N乃夕11 中 , 其反密码子有 GOO , 0 0 和 U . o 三种山 , (实际
上在已知结构的 2 0 多种 七R N A 中 , 反密码子第一位并不存在 A , 只有一篇文章报道 为
A’ 瀚) 。 若将反密码子为 e O O 的 tR N A曲 的一级结构加以比较 , 其结构均一性可达 80 汤
2 期 蓖麻蚕( p 从o l。 。 沁 印。场￡a 瓜`。 O后丝腺体甘氨酸转移核搪核酸的全核普酸顺序 1 73
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图 7 真核生物和动物的甘氨酸转移核搪核酸 (反密码子为 G C灯)结构的同源性
a
. 真核生物 ,字母表示具有相同的执普酸 。 b . 动物 ,字母表示稍有差别的几个核普酸。
压嚓岭 , Y一呛吮。
( 图 7 a ) 。
进而比较三种反密码子为 G OO 的动物 t R N oA ly 一级结构发现 , 它们之间的差异仅在
于 : ( 1) 修饰程度不同 (如第 4 , 6 和 9 位 ) ; (2 )两对卜U 与 G刁碱基对的互换 (第 6 与 6
位 , 第 2 5 与 4 3 位 ) 。 见图 7 b 。
如果考虑到三家实验室测出的家蚕 讯N材妙的一级结构在修饰成 分上也 有所 不 同
(见文献田1、 以0] 、 〔2 6] 和表 3 ) , 而蓖麻蚕 t R N A 。扮 与家蚕的差异也仅在于修饰程度上的
不同 , 表明这二种蚕虽同纲 、 同目而不同科 , 它们在进化上的地位是相同的。
表 3 蓖麻蚕和家蚕甘氮酸转移核糖核酸(反密码子G C C )中核普酸的修饰程度的差别州翻署千…参考文献本 文[ 1 0 ][ 9〕[ 2 6 ]
(1) 其中有 曲% U口 。
(2 ) 其中分别有少 t 未修饰的 U 或 G (从文献〔1 0] 的表 U 工中分析得到) 。
侈 ) 大约有 30 肠 的 0没有修饰。
(4) 未知的修饰尿啥咤。
1 7’ 生 物化 学 与 生 物物 理 学 报 1 5卷
参 考 文 献
[1」 肠 u乒m咖 , Y . a n d s仙妞k i , Y . 叽e D N A 叫一 of B州瓦娜 ” “ 冲` 五br 血 g 边。 运 cl u id gn the 5’ 月a n物 g,功 B N A 仪心让嗯 , en 桩er in et r 佣` n g an d if b l o in rP 。切i n OC吐加 g 戏移 ion . 伽乙, 1 9 7 9 , 18 , 5 9 L〔 2 ] G嗯 e , L · P . ` n d M
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g舰 e O班血切 of a 五。功嗯助 oe 朋 a let anr int g a r r a y 吐 r e ps 幼廿 o us 。叮的山加 . an d am o印 h伽 戊吐山 g成呵 u朗 . · J · 刀如 . 口触协 . , 1 9 8。 , 玛拐, 94 4 4 .【3 I G巨r b 汀 , L . B . 幼 d G鳍 e , L . P . T了仙印 ir P it o n of a d o n ed 刀钦门御冷 刃比冲` 切困 A妙 g e刀 :e N uo leo it 面
成峋咖 oe 吐 切。 切双人 P卿 u卿 r a n d i切 p了 o吧拍 I n g 如 “ `r o . elC l , 1 9 7 9 , 18 , 8 1 7 .〔4 〕 日少鳍ue , K , U . 时 ia . 5, n a n互i gn 咧哑 eG ia g n a l aer l阅 iu r de f o了 即七i喊 yt o f 滋址 w二 m a h ` n 。 切因人
g 功 . i n h . o岭卯加 讯 ” 侧冲。 七急几即巧 P it o n 即日切互坦 . eC z乙, 1 9 80 , 幼 , 1 7 1 .
[ 5 」 氏四。 b , D . R . et al . H o功 o1 催浮 时 t b o 3, et IZ创匕 al 侧沟 u e n侧知 。 f t h e 1 8 5 r R N A o f B 侧的乙笋 ” k才撼 an d th e
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r R N人 of E战无劳初翔沁 句“ . 刀脚触初 配众酝丑“ . , 1 97 9, 7 , 1 1 0 .9
【6 〕 卫叨” 功吐 . A .咖叻饭切越 v e d川巨妞 场 e B哪玩娜 ” 扰片` L . is lk w 叮m : A ver i e w . 丑就沁从湘 , 1 97 9, . 1 , 2 8 3·〔 7 I K加` 夕a , H . e t al . N u c leO 桩de 咧~
。 f 5 8 ir lx 班幻ma l 丑 N A f or m ht e l朋切对 or s il k g助山 时 刀柳句公用切嗦. 了 . .曰哪彻仍 . 口 . 详比 ) , 1 98 1 , 8 . , 7 1 7·
【8 〕 K 叮 e n , U . et 幻 . 了、 。 刀 u e】eo t id e 叫一 af wt 。 ` I k g h n d a场刘nL e tB叹泊旧二 工mP il aC 幻onB for if b r of n即刀 t h . 曲 a dn f or 过幼` 饭汀 切囚 A st r u d 刀er . 哪孟, 1 9 7 7 , 1 1 , 5 6 1 ·
[ 9 〕 e 幻川 , J . P . ` n d K越比 , G . N u d 仪心d e 叫 u ecn of 及” 曦娜 协州 石
. 切盯 A分, y . N时帆 , 1 9 7 7 , 2 . . , 3 5 0 ·口刃 Z幽g a , M . C . a 刀 d s et j枷 , J . 人 . 乳 e n u d eo it d e 哟~
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