全 文 ：第5 1 卷 第5 期 生物化学与生物物理学报 V o l .51 , N o . 5
1 9 8 3 年 9 月 A C T A B I CC H I M I C A e七 B IO P H Y S I C A S I N I C A eS P . , 1 9 8 3
蓖麻蚕 (外ilo sa m l’a cy nt 入l’a r ic in i) 后部
丝腺体 55 r RNA 的核普酸顺序
曹功杰
竺来发
李文琴
祁国荣
辜祥荣
王德宝
(中国科学院上海生物化学研究所)
摘 要
本文用凝胶直读法 、 末端鉴定法以及前标记指纹图谱等几种方法相配合 , 测定了蓖 麻蚕
( P h么l o s a , 必 e夕、 th他 “ e落。 i )后部丝腺体 5 5 r R N A 的核普酸顺序 : ( P P )GP CC A A C G U C C A U A
C C A CG U U G A A A A C A C CG G U U C U CG U CC G A U C A C CG A A G U U A A G C A A C G U C G G G C G C
G G U C A G U A C U U G G A U G G G U G A C C G C C U G G G A A C A C CG CG U G U U G U U G G C U U o a
。 并
比较了蓖麻蚕和家蚕 、 果蝇 5 8 r R N A 结构上的差异 , 讨论了真核生物 55 r R N A 结构的保守
性 。
阳 r R N A 存在于生物细胞核糖体的大亚基中 , 它在生物体的蛋白质合成中 , 具有重
要的生物功能 。 因此 , 科学工作者广泛地开展了 5 r R N A 的结构与功能的研究山 。 到目
前为止 , 已经测出 5 r R N A 一级结构的有六十多种 , 其中真核生物有三十多种味幻 。 在昆
虫纲中 , 果蝇 (D : os 叩 h`玩 、 乙, go 韶` e吟 41L 和家蚕 (B口阴石妙 。耐 ) 5LJ 的 58 r R N A 的一级
结构 已经测定 。
55 r R N A是一种单一分子 , 分子量不大 , 较易纯化 , 没有修饰核昔 , 核昔酸顺序测定
也较方便 。 同时 , 它具有较为保守的一级和二级结构 。 比较各种生物阳 r R N A 间顺序同
源性 , 可推测它们 之间的亲缘关系 。 因此 , 它是最适宜于进化研究的一种生物大分子 。
蓖麻蚕是我国科学工作者成功地从印度引进驯化的 昆虫 。 和家蚕比较 , 它的丝质差 。
但是 , 蓖麻蚕食性广泛 , 饲养方便 , 在我国有些地区 , 可利用丰富的野生植物资源进行何
养 , 有一定的经济价值。 为此 , 我们开展了蓖麻蚕核酸的研究 。 我们 已经用前标记指纹图
谱法测定了蓖麻蚕后部丝腺体甘氨酸转移核糖核酸的全核昔酸顺序 6[J 。 本文报道结合使
用前标记指纹图谱法和 D o n i s 一k e l l e r 等用酶部分酶解凝胶直读 t7 , , S at n l e y 和 V a s s i l e n k o
末端鉴定〔8 ,等方法 , 测定出蓖麻蚕后部丝腺体 58 r R N A 的核昔酸顺序。
材 料 和 方 法
1
. 五龄蓖麻蚕 为 白黄种 , 由中国农业科学院蚕业研究所 , 广东蚕种繁殖试验场
本文 1 9 8 1 年 1 1 月 2 5 日收到 。
本实验由中国农业科学院蚕业研究所 、 广东蚕种繁殖试验场提供实验用蚕 , 本所庄熙孟帮助摄影 , 杨新颖协助打
点法分析 , 谨致谢意。
生 物化学 与 生物物 理 学 报 15 卷
提供。
2
.笼麻蚕后部丝腺体 5 5 rR N A的 “协全标记和 R N a seT l 、 R N a se A全酶解指纹图
讲及其城基组成确定 参照前文报道的方法进行 te, 。 , 。
3
.
5
r R N A 的制备 取五龄盛食期蓖麻蚕后部丝腺体 , 按照 辜祥荣 等人 的 方
法山 ,制备小分子 R N A 。 然后用磷酸单醋酶处理 , 除去 泞末端磷酸。 反应条件为 : 小分子
R N A 6 毫克 , E . oC 配碱性磷酸单醋酶 (s ig ma 产品 ) 1
.
8 单位 , 10 m万 T r证H CI p H 7 . 8,
o
.
l m皿 E D T A一 N灿 。 砧℃ 保温 3 0分钟 , 置于干冰中停止反应 。 立刻加二甲苯蓝 、 嗅酚
蓝和尿素 , 在含有 7卫 尿素的 1 0界 聚丙烯酞胺平板凝胶中电泳 (4 50 x 2 5 0 x Zm m ) 。 凝
胶放在萤光板上于紫外灯下观察 , 割取 5’ 脱磷的 55 r R N A 条带 , 参照 M ax a m 和 iG l b er 七
的方法抽提制备样品备用〔川 。
不脱磷的 5 r R N A 也按上法凝胶分离制备 。
4
.
5’ 末端标记凝胶直读法 参照 D o n i s - k e l or 等的方法川 , 并改变反应温度及时
间 , 进行 55 r R N A 的 5` 末端 3, p 标记 。 5` 脱磷 5 r R N A S~ 1 0微克 , 溶于 15 微升 1 0 m M
T ir -s H CI p H 7
.
5
,
0
.
l m万 E D T A 一N a , , l m万 精胺中 , 于 50 ℃ 保温 3 分钟 , 速冷后加入
, ” 护 A T P (0 . 1~ 0 . 2毫居里 , 3 0 0 0 居里 / m m ol e) , T ` 多核昔酸激酶 (中国科学院生物物
理研究所产品) 0 . 5~ 1 单位 , 石种 1 2 6o m万 T r is 一 H 0 1 p H g . 0 , 50 m万 gM C I ,
,
2 5 m M 二
琉基赤醉醇 。 反应总体积 2 5 微升。 在 40 0 保温 2 0 小时。 冷冻干燥 , 再用含 7 M 尿素的
2 0外聚丙烯酞胺平板凝胶电泳纯化 6 ,-8 -P 58 r R N A。 从凝胶 中洗脱样品并分管进行部分酶解。 酶解是按照 D o in s一 le ler 等人 7tJ方法在尿素缓冲液 中降解的条件。 反应体积
2
.
5微升 , 酶的用量 : R N as e T 工为 0 . 6 单位 /微克 R N A 和 5 单位 /微克 R N A ; R N as e A
为 0 . 5 毫微克 /微克 R N A 和 5 毫微克 /微克 R N A , 在 5 0 ~ 5 o5 C 保温 1 5 分钟后 , 两种不
同酶量反应液混合上样。 R N as e U : (S a kn y 。 产品 )为 0
.
1 单位 /微克 R N A , 分别在 50 ~
5 ℃ 反应 巧 分钟和 60 分钟。 两种不 同反应时间的反应液混合上样 。 甲酞胺降解条件
为每 2 微克 R N A 加入 6 微升重蒸甲酞胺 , 封管 , 沸水中煮 30 分钟 。 以上酶解 、 甲酞胺降
解以及未降解的对照样品加到一块含 7 万 尿素 2 0外 聚丙烯酞胺平 板凝胶 ( 45 0 x 2 5O x
o
.
s m m )的不同样品槽 (宽 s m m ) 中电泳 , 用二 甲苯蓝及澳酚蓝作指示剂 , 电泳后 , 自显
影 , 直接读出 G , A , Y (嗜咤 )核昔酸顺序。
6
.
3’ 末端标记投胶直读法 5 5 r R N A 用 T ` R N A 连接 酶 (本所 制备 ) , 5’ 一韵-P
p o p 进行 3’ 末端标记 , 标记方法参考 P ea 七七ie 的方法山 , 。 3’ 一 a8犷 5S 扭 N A 的纯化 、 部分
酶解以及凝胶电泳分离同 6 , 末端直读法一样。 其中 , 部分酶解中增加使用 R N a s e p h y M
( -P L ib oc h
e m加 al s , in o . 产品 , 由美国洛克菲勒大学 I er n o Y . 0 . S u n 赠送 ) , 酶量为 1 单
位 /微克 R N A 和 0 . 2 单位 /微克 R N A , 缓冲液同其他酶一样 , 在 50 ~ 5宁C 保温 1 5 分 钟
后 , 两种不同酶量反应液混合上样。 这样可直接读出 G , A , O , U 核昔酸顺序 。
6
. 末端鉴定 法浏 定 55 r R N A 序列 参照 S协 ln ey 和 V as isl e n幼 方法闭 , 州 p 的
鉴定方法有所不同 。 5 r R N A (O . I O D ) 放在指纹管中 , 抽干 , 再加入 5 微升重蒸甲酞胺 ,
封管 , 沸水加热 6 分钟 , 然后 , 开管在真空干燥器内用油泵抽去 甲酞胺 。含有各种大小片段
的样品用 T ` 多核昔酸激酶 , 下一 3 ,犷A T P 进行标记 (条件同直读法 )O用含 7皿 尿素 1 2外 聚
丙烯酞胺平板凝胶 (10 0 x 2 50 x 0 . 5 m m )进行分离 , 为了得到所有片段 , 于不同时间分三
5 期 蓖麻蚕 (P械 o sa, 沁 c尹 ht 记 石改瓜 )后部丝腺体 55 r R N A 的核普酸顺序 40 7
次上样。 放射自显影 , 抽提各带中的 5’ 一昭-P 多 (寡 )核昔酸 , 再用 R N as e T , 全酶解。 酶解
样品点在 D E A E卜纤维素纸上 (D E 8 1 ) , 在 pH 3 . 5 缓冲液 (5多 乙酸 , 0 . 5界 毗健 ) 中电泳
( 20 0 伏 , 2 小时 ) , 自显影 , 从各条带末端 p N p , 排出核昔酸序列 。
7
. 浏 rR N A 3’ 末端及其顺序的鉴定 将 5’ 」 ,卜 p o p 标记 的 5 rR N A 样 品 用
R aN se 几 酶解 , p H 3 . 6 纸电泳鉴定出 ” ,卜 3 ,一M P , 即为 5 r R N A 的 3’ 末端 (oU 动 。 再
将 3’ 一 ,卜阳 rR N A 用 5 微升重蒸甲酞胺在 10 0 水浴中煮 3 0 分钟 , 进行迁移率变换分
析 (m o ib il yt 面台 a n a ly s泊 , 通称打点法 ) , 从自显影图推测 3’ 末端顺序为… … G GOU U oH 。
结 果 和 讨 论
一 、 蓖麻蚕后部丝腺体小分子 R N A 在 1 0外 聚丙烯酞胺凝胶电泳中的分离见 图 o1
最上面一条带为 s r R N A , 下面一些条带为 七R N A 。
二 、 全标记 5 5 r R N A 的 R N as e A 和 R N as e T : 全
酶解图谱的核昔酸片段的组成和克分子数见表 1 和表
2
。
RNa
s e A 全酶解片段 PG O (A l l )为 6 ` 末端 。 R N as e
T : 全酶解片段中也有 p G (T )S , 但是 , p G O , p G 的克
分子数都较低 , 这可能是由于同时存在 pGP 和 P GP
末端的关系 , 它们在第一向电泳时跑得很快 , 未能转移
到第二向 D E A工纤维素纸上 , 因此图谱中没有这 些
点。 另外 , T Z 点的组成无 o p , 并且 o p : U p · 1 : 1 , 应
为 3’ 末端 , 该点与文献 1[ 司 报道的图谱中 OU oU 日 位
置相同 , 并且我们从末端鉴定和打点知道 , 5 r R N A
3’ 末端为 G G O U oU H 。 因此 , 这一 点的片段 应为
O U oU
H , 并为 3 ` 末端。
在 R N as e A 酶解片段中 , G G口A A O 和 G A A A A O
片段较大 , 转移比较少 , 片段组成末能侧出。 在 R N as e , , , * 二二 * 。 * * 。 . ` _: , 、 ,l _,
~ ~
/ 、 , , 可 `夕 柑认 / ’ 产 ’ 认犯朋平朋均山 。 怀 ~ 的。 图 1 蓖麻蚕后部丝腺休小分子丁: 和 R N a s e A 酶解片段中 , 还有少量 A G , (场 C ) G , R N人 的分离
(G A习U , 还有些片段克分子数偏高 (特别是单和二 、 10 % 聚丙烯酞胺凝胶电泳
三核昔酸 ) , 可能是由于样品欠纯 , R N a se 叭 和 R N朗 e A 含有少量杂酶以及大小分子寡
核普酸转移效率差别等多种因素所致。 除此以外 , 其他全酶解片段与 5 5 r R N A 的结构是
一致的 。
三 、 泞末端标记部分酶解凝胶直读法阅读 55 rR N A 部分顺序可见图 2 , 这张图可以
阅读出阳 rR N A 的第 70 至第 8 7 核昔酸 , 由于没有使用区别 q U 的酶 , 因此 , 其中 8 个
啥陡核昔酸 (Y )是未知的 。 为了确定全部顺序 , 还采用末端鉴定法 , 这不仅重复核对 A , G
核普酸 , 而且使 q U 很好区别开来 。 图 3 为 5 r R N A 经 甲酷胺水解 , 5 ,.-s 卜标记 , 挽胶电泳分离的图谱 。 图 4 为该图谱中有关条带的 泞 末端 pN p 的确定。 根据这些 , 我们 即能
读出这段顺序为黔OU A G U AOU OU G A骡。
邱 r R N A 的其他部分片段也同样用这二种方法读出来 。
4 0 8生物化学 与 生物物理学报 5 1卷
表 !蓖麻蚕后部丝腺体 5 5 rR N A的 R NQ犯 A酶解产物
组 成 克 分 子 数
实 验 值 理 论 值
U 12
.
810
,工3
A 1
A 2
几0621
1
,山2
,上Q曰
1
,山月工
人 3
人 4
人 5
A 6
A 7
A 8
人 9
A 1 0
A l l
A 12
A 1 3
A 1 4
人 1 5
人 1 6
A 1 7
.
人 U
(犯
0
人 C
A A O
(G A )O
(A
ZG ) 0
G (〕O
G U
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(A G ) U
以犯 C
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体G , ) U
(A刃: ) U
GGO U
1
.
6
4
.
6
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.
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。
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9
1
.
2
]
.
0
6
.
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4
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.
7
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.
7 2
2
.
0
1
。
0
1
.
6
1
.
2
A U
G 0
0
人O
人人 O
G AO
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G U
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O么 U ; AG U
(孰王X ;
以〕U
GG A U
G人人G U
C (刑〕U
GGG A A O
G声 A A A C
表 2 蓖麻蚕后部丝腺体 5 5 r RN A 的 RN Q ” lT 酶解产物
编 号 组 成
T 1
T 2
T 3
1
, 4
T 5
T 6
T 7
T 8
T 9
皿 0
T l l
T 1 2
T 1 3
T 1 4
T 1 5
皿 6
1T 7
T王8
T 1 9
T 2 0
T Zi
一二二一一二一卜里上逻匕兰一
G 1 1 7
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.
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1
.
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1
.
0
0
.
6 0
0
.
5 0
O
。
72
2
.
1
0 9 1
0
.
4 6
0
.
9 7
0
.
7 6
0 8 9
0
,
8 9
5期 蓖麻蚕( 尸 hl o i。 , 沁 似咐 h必 r交伽匀后部丝腺体 5巳 r R N A 的核普酸顺序 40 9
图 2 5 ,-的 P标记的蓖麻蚕后部丝腺体 5 5
r R N人 的 R N ase 部分酶解产物的放射性
自显影图谱
2 0% 聚丙烯酸胺凝胶电泳分离
叭 , R N 别拍 lT 巩 , 丑N . 拍 场
五 , 朋ae 人 L , 甲酥胺降解。扭 J 无酶。
图 3 蓖麻蚕后部丝腺体 5 8 r R N A 甲
酞胺部分降解的产物 5, 末端 外 标记
后聚丙烯酞胺凝胶电泳分离的放射性
自显影图谱
卜,p,CUAG,Ppp
丹Ué”几
图 4 甲酸胺降解蓖麻蚕后部丝腺体 58 r R N A
的部分片段其 6 `宋端核普酸分析
河
刁区 O生物化学 与生物物理学报 1 5卷
图 5l 3e” P标记的蓖麻蚕后部丝腺体 6Sr RN A的
NR as e部分酶解产物的放射性自显影图谱
拙 %聚丙烯院胺报胶电泳分离
L
, 甲院胺降解 G , B N知拍 lT 人 , B N哪 巩 A + U , B N 别犯 户y M
O+ U
, 丑N 田拍 A 一E , 无酶。
, 食 .
10 劝 30 柑 0S 幼午 P林 X C决冉 C C UC C ^ U ^ C e 八 C G U Uc ^ ^ ^冉 C ^ C C G G U LCI u C G U C c G人 U C ^ C C G ^ AG U U A人 G C ^ 九C
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图 6 芭麻蚕后部丝腺体 58 r R N A 的全核普酸顺序及其与家蚕 、
果蝇 55 rR N人 的比较
5期 蓖麻蚕 ( P从lo sa, 沁 c妙 ht 公 ,奴。匀后部丝腺体 58 r R N A 的核普酸顺序
四 、 3’ 末端标记部分酶解凝胶直读法阅读 5 5 r R N A 顺序可见图 5 。 该方法 进 一 步
核对了前二种方法的结果 。
五 、 我们用上述方法测定了蓖麻蚕后部丝腺体阳 r R N A 的全结构。 并与家蚕 、 果蝇
的 5 5 r R N A 进行比较 , 见图 6 。 蓖麻蚕后部丝腺体 55 r R N A 为 1 2 0 个核昔酸 , 5’ 末端为
( p p ) pG
,
3’ 末端为 U oH 。 从图中可见蓖麻蚕 58 r R N A 与家蚕 55 r R N A 在结构上 非常
相似 。 核昔酸的差别有 7 个 : 1 7一。 (U ) , 2 4一 A ( U ) , 石3一U ( 0 ) , 6 1一 (A ) , 6 9一0 ( U ) , 1 0-6
G (A )
,
1 1 1刁 (A ) , 而与果蝇相比 , 核昔酸的差别却有 1 1 个。 蓖麻蚕 7 个与家蚕不相同
的核昔酸却有 6 个与果蝇在同一位置上的核昔酸是相同的 。
我所蔡名杰 1[ 幻研究了蓖麻蚕 55 r R N A 基因限制性内切酶的作用 , 并 对照 果 蝇阳
r R N A 基因的研究结果山 , 以及果蝇 、 家蚕 65 r R N A 的核昔酸顺序 , 推测 与蓖麻 蚕 5S
r R N A 基因限制性内切酶切点相应的 5 5 r R N A 的核昔酸顺序 , 和我们的实验结果是一致
的 (表 3 ) 。
表 3 三种昆虫 5 5 r RN A 基因的限制性内切酶切点与相应的 5 5 rR闪A 的核普酸顺序的关系
限制性内切酶 切 点 蓖麻蚕 〔川 家 蚕 果 蝇 [ 1 5 ] 5 5 r E N A中核普酸位置
M ob l 杏 + (G A U C ) + (G A U C ) + (G A U C ) (4 1 ~ “ )
G A q℃
有卜, I 杏 + (G (启 O ) 一 (G田 U ) + (G〔X〕C ) ( 6 6~ 6 9 )
G ( X〕 C
H
e a 11 1 小 一 (G G C U ) 一 (G GC U ) + (GG C C ) ( 11 6 ~ 1 1 9 )
(犯 C C
A l u l 杏
A G( 刀了
从结构的结果可知 , 蓖麻蚕与家蚕分属鳞翅 目的天蚕蛾科与蚕蛾科 , 但在进化上是非
常接近的 。 这与我们测定的蓖麻蚕后部丝腺体 七R N A lyG 的一级结构类似于家蚕后部丝腺
体 七R N A lyG 是一致的 。 而蓖麻蚕、 家蚕与果蝇比较 , 则差别稍大一些 , 但也只相差 9~
1 3外 。如果我们将已知结构的 3 0 多种真核生物 68 rR N A 进行比较 , 可以看到具有很大的
同源性 , 因此 55 r R N A 是非常保守的 。
图 7 是我们根据氢键配对规律以及一般使用的通式试土.G 1 7 ) , 排列的蓖麻蚕后部丝腺
体 55 r R N A 的二级结构。 此结构由五个基区 (以 8 表示 ) 以及七个非配对顺序 (以 L 表
示 )所组成 , 其中 L 3 与 L 6 为二个端部环 。 在 L 3 环处存在所有后生动物、 酵母 、 某些霉菌
等 6 5 r R N A 的保守四核昔酸顺序— G A U O (个别为 。 A U U ) 。 而在原核生物、 藻类和高等植物 5 5 r R N A 中, 该处则为保守的 G A A O 顺序 , 同时被认为它是在蛋白质生物合成中
通过与 七R N A 中的 G T功0 相互作用而行使功能助 , 。 由于真核生物起始 t R N A 在相同位置
上以不变的 G A yo 代替其他 七R N A 的不变的 G T叩顺序山 J, 因而推测真核生物阳 r R N 在
中的保守 G A U O 顺序与起始 t R N A 的 G A万O 互补圃 。 那么 , 在真核生物蛋白质生物合
成 中与延伸 t R N A 相互作用的分子是什么 ? 由于真核生物 5 . 8 5 rR N A 在 4D 位附 近含
有与原核 55 r R N A 相同的 G A AO保守顺序即 , 是否就是它扮演此一角色 , 有待 实验 证
实`
红2 生物化 学 与 生物物理 学报 15 卷
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图 7 蓖麻蚕后部丝腺体 5 5 r N A R的二级结构
今 考 文 献
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. 氏 r u ct u扮 a D d fu n c t i o n of 5 a n d 5 . s R N A . P角 9 . N Z记劫化 A初 R es . 皿改 . B诚 . , 19 78 ,
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E r dm a n
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V :A 伪U eC t i on of uP bl 铂五ed S a血 5 . 85 R N A se q明哪s a血 t h e l r pecr u 八幻 r 3 . y 讹比记 』` 幽刀留 . , 1 9 8 1 , 二 绍 5 .
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