全 文 ：第 39 卷　第 2 期
2011 年 2 月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of No rthwest A&F Univer sity(Nat.Sci.Ed.) Vo l.39 No.2Feb.2011
短芒大麦钙依赖蛋白激酶基因的
克隆与功能分析 ＊
王呈玉1 ,张明哲2 ,吕世友2 ,李彦舫2
(1 吉林农业大学 资源与环境学院 ,吉林 长春 130118;2 吉林大学 植物科学学院 ,吉林 长春 130062)
[ 摘　要] 　【目的】克隆强抗寒性牧草短芒大麦钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent pro tein kinase , CDPK)基
因 ,分析其生理生化特性 , 为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定基础。【方法】采用 RACE-PCR技术 ,获得短芒大
麦CDPK 基因全长 cDNA 序列;采用 Nor the rn 杂交分析该基因在逆境条件下(低温(4 ℃)、干旱(200 g/ L PEG6000)、
盐(300 mmo l/ L NaCl)、激素(100 μmo l/ L ABA))的表达模式;采用农杆菌介导的方法 , 对该基因编码蛋白进行亚细
胞定位 , 并对转基因烟草的离子渗漏率和脯氨酸含量进行测定 。【结果】获得了短芒大麦 CDPK 基因的编码序列 , 将
其命名为 HbCD PK;HbCDPK 编码的蛋白是一个膜定位钙依赖蛋白激酶 ,该基因在短芒大麦根 、幼苗叶片和成熟胚
中均有表达;在低温 、干旱 、盐和 ABA 胁迫条件下处理不同时间 , HbCDPK 的表达丰度有差异 , 其在低温胁迫条件下
的表达信号最强;转 HbCDPK 基因烟草相对离子渗漏率降低 ,脯氨酸含量升高。【结论】HbCD PK 基因参与了低温
胁迫信号转导 ,具有提高植物抗寒性的潜能。
[ 关键词] 　短芒大麦;钙依赖蛋白激酶;非生物胁迫;亚细胞定位;RACE
[ 中图分类号] 　S512.3 +2;Q78 [ 文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2011)02-0111-09
Molecular cloning and functional analysis of a novel calcium-dependent
protein kinase gene HbCDPK from Hordeum brevisubulatum
WANG Cheng-yu1 , ZHANG Ming-zhe2 , L Shi-y ou2 , LI Yan-fang3
(1 Co llege o f Resources and Environmenta l Sciences , J i lin A gr icultura l Univer sity , Chang chun , J i lin 130118 , Ch ina;
2 Col lege o f Plant S cience , Ji l in Universi ty , Changchun , Ji l in 130062 , China)
Abstract:【Objective】Cloning , phy siological and biochemical characte ristics analysis of CDPK gene in
Hordeum brevisubulatum provided a rational basis fo r screening and utilizat ion o f ideal resistant gene.
【Method】The cDNA sequence o f CDPK gene in H.brev isubulatum was isolated by RACE-PCR and the
expre ssions profiling of HbCDPK in dif ferent tissue s and under various stresses and phy toho rmone treat-
ments(4 ℃, 200 g/ L PEG6000 ,300 mmol/ L NaCl ,100μmo l/L ABA)we re invest igated by using RNA gel
blo t analy sis.In addition , the subcellular location characterist ics of HbCDPK we re investig ated by the ex-
pression of HbCDPK:GFP fusion pro tein , and the ion percolation rate and proline content in t ransgenic to-
bacco w ere analyzed.【Result】The coded sequence of calcium-dependent protein kinase gene in H .bre-
visubulatum was obtained , and named HbCDPK .HbCDPK is a membrane-asso ciated Serine/Threonine
pro tein kinase.HbCDPK gene w as detected in roo t , leaf blade and ma ture embryo.Expression of HbCDPK
at t ranscription level was induced obviously under co ld , drought , sal t and A BA stress.The abundance of
HbCDPK mRNA in transgenic tobacco t reated by cold st ress w as the highest , and its ion percolat ion rate
＊ [ 收稿日期] 　2010-06-28
[ 基金项目] 　国家自然科学基金项目(30471229)
[ 作者简介] 　王呈玉(1975-),女 ,吉林四平人 ,讲师 ,博士 ,主要从事环境生物技术研究。
[ 通信作者] 　李彦舫(1937-),女 ,吉林长春人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事生物化学与分子生物学研究。
decreased and proline content increased.【Conclusion】HbCDPK gene par ticipates in signal t ransduction in
abiot ic st ress condition and has a po tential to enhance co ld and drought resistance o f plants.
Key words:Hordeum brevisubulatum ;calcium-dependent pro tein kinase;abiotic st re ss;subcellular lo-
calization;RACE
　　在逆境条件下 ,植物必须具有很强的适应能力
才能生存 。在整个生活周期中 ,植物暴露于各种有
利和不利的环境条件下 ,这些环境条件引发了众多
的信号转导途径 ,使植物以迅速而有效的方式做出
反应 。这便形成了适应性的进化机制 ,使植物对环
境刺激做出反应 ,以利于其生存。
在高等植物中 ,为适应各种外界环境刺激 ,以最
大限度地减少逆境对自身的伤害 ,在长期的进化过
程中 ,从对逆境信号的感知 、胞间转导和传递到最终
表达各种逆境基因 ,产生适应性 ,形成了一系列复杂
的逆境信号传递的分子机制 。其中 ,Ca2+作为胞内
的第二信使 ,为适应各种外界环境刺激 ,在植物对各
种逆境信号的转导中起着重要作用[ 1] 。植物细胞质
中 Ca2+水平在应答多种刺激时会发生改变 ,其中
光 、环境胁迫 、植物激素 、机械损伤和真菌激发子等
许多刺激 ,均能诱导胞内 Ca2+浓度瞬间升高[ 2-6] 。
Ca
2+水平的变化经常伴随着蛋白质磷酸化的改变 ,
这一过程主要是由钙依赖蛋白激酶(Calcium-de-
pendent protein kinases , CDPK)完成的[ 7] 。胞内
Ca2+浓度变化最终会引起基因表达或细胞代谢变
化 ,从而在植物生长发育和环境适应中发挥着重要
作用 。在非生物胁迫下 ,其细胞质中的 Ca2+浓度也
会出现特异性变化 。一般认为 , 细胞质中的这种
Ca2+浓度特异性变化 ,是其作为细胞次级信使来区
分不同原始信号的一种反应 ,并通过与它的作用介
质———钙结合蛋白相互作用而将信号继续向下游传
递 ,进而在细胞内引起一系列的生物化学反应 ,以适
应或抵制各种胁迫 。目前 ,关于 CDPK 的下游信号
转导通路并不清晰 。但越来越多的证据表明 , CD-
PK 参与了植物非生物胁迫信号转导 ,干旱 、盐 、伤
害 、低温 、光和激素等均能影响植物不同 CDPK 的
表达或活性[ 2-6] 。在模式植物拟南芥的基因组中 ,迄
今已鉴定了34 个 CDPK 基因 ,其分别位于所有5 条
染色体上[ 8] 。在水稻中 ,迄今已鉴定出 29 个 CDPK
家族成员[ 9] 。在小麦[ 10] 、马铃薯[ 11] 、葡萄[ 12] 和烟
草[ 13]中也鉴定出了一些 CDPK 基因 。但迄今为止 ,
有关牧草作物 CDPK 基因克隆和功能分析的研究
还鲜见报道。
短芒大麦(Hordeum brevisubulatum(Trin.)
Link)是禾本科大麦属中的一种多年生牧草作物 ,俗
称野大麦 ,主要分布在荒漠化草原和高山草原的边
缘 ,具有耐寒 、耐旱 、耐瘠 、耐盐碱等优良的抗逆性
状。根据这些优良性状可以推测 ,短芒大麦含有丰
富的抗逆基因资源 ,是一种较优的研究植物抗逆性
的材料 。因此 ,本研究从短芒大麦中克隆 CDPK 基
因 ,并对其生理生化特性进行分析 ,旨在为重要粮食
作物的抗逆性改良提供科学依据。
1　材料与方法
1.1　植物材料
将短芒大麦种子(吉林大学植物基因工程中心
提供)播种于土质较肥沃的盆栽土壤中 , 25 ℃条件
下正常培养 ,苗龄 2 周后 ,在连续光照的条件下 ,分
别置于低温(4 ℃)、盐(NaCl 300 mmol/L)、干旱
(200 g/L PEG6000)以及激素(ABA 100 μmol/ L)
条件下进行胁迫处理 ,以正常条件下生长的短芒大
麦作为对照(CK),分别于胁迫处理 0.5 , 2.0 , 4.0 ,
6.0 ,8.0 ,12.0和 24.0 h 剪取不同处理及对照的叶
片 ,贮存在-80 ℃备用 。
1.2　短芒大麦总 RNA 的提取
按照 TriZol 试剂盒(Invi tro gen , Carlsbad ,CA ,
USA)操作说明书 ,提取正常生长状态下短芒大麦
幼苗叶片 、根和成熟胚及各胁迫处理下短芒大麦幼
苗叶片总 RNA 。
1.3　短芒大麦 CDPK基因(HbCDPK)全长 cDNA
的克隆
利用 DNAMAN 软件 ,对 GenBank 中已公布的
植物 CDPK 基因 OsCDPK (AY144497)和 ZmCD-
PK 2(U28376)编码的氨基酸序列进行同源性分析 。
根据保守区设计合成扩增短芒大麦 CDPK 基因3′端
巢式简并引物 CPK3′-1(5′-GG(C/ T)G T(C/G)
ATGCA(C/ T)CG(G/T)GA(C/T)CT-3′)和
CPK3′-2(5′-AGGCCA(C/ T)TGA T TT(C/T)GG
(C/G/A)(C/ T)T(C/ T/A)T-3′),同时设计巢式锚
定反 转 录 引 物 Q T (5′-CCAGTGAGCAGAG T
GACGAGGACTCGAGCTCAAGCT TT TT TT T TT
T TT TT T T-3′)、Q 0(5′-CCAG TGAGCAGAG TGAC
G-3′)和 Q 1(5′-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3′)。
112 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 39 卷
以低温胁迫处理的短芒大麦幼嫩叶片提取的总
RNA 反转录的 cDNA 第一链为模板 , 进行巢式
PCR 扩增 ,以 CPK3′-1 和 Q 0 为引物组合进行第 1
轮扩增 ,第 1 轮 PCR 扩增体系为:cDNA 模板 3.0
μL , 10×High Fidelity PCR Buf fer 5.0 μL , MgSO4
(50 mmo l/L)5.0 μL , dN TP M ix ture (10 mmo l/L
each)1.0 μL , CPK3′-1(10 pmo l/μL)2.0 μL ,Q 0(10
pmol/μL)2.0 μL , Platinum? Taq High Fidelity
0.5 μL ,无菌去离子水 36.5 μL。反应条件采用热
启动 PCR方式:95 ℃预变性 4 min , 80 ℃暂停加入
Platinum? Taq High Fideli ty DNA 聚合酶 ,之后94
℃30 s ,60 ℃40 s ,72 ℃90 s ,35 个循环;72 ℃延伸
10 min。反应结束后 , 取 5 μL 扩增产物 , 进行 10
g/ L琼脂糖凝胶电泳检测。以稀释 100 倍后第 1 轮
扩增产物作为模板 , CPK3′-2 和 Q1 为引物组合进行
第 2 轮扩增 ,第 2轮 PCR扩增体系为:稀释后的第一
轮扩增产物 5.0 μL , 10×High Fideli ty PCR Buf fer
5.0 μL ,MgSO4(50 mmol/L)5.0 μL , dNTP Mixture
(10 mmol/L each)1.0 μL ,CPK3′-2(10 pmol/μL)1.0
μL ,Q 1(10 pmol/μL)1.0 μL ,Platinum? Taq High Fi-
delity 0.5μL ,无菌去离子水 36.5 μL。反应条件同第
1轮 PCR。反应结束后用 10 g/ L琼脂糖凝胶电泳对
PCR产物进行鉴定 ,并对扩增产物进行测序。试验获
得了 HbCDPK 基因 cDNA 3′末端 。
根据已经获得的 HbCDPK 基因的 3′-RACE
结果 ,设计 5′-RACE 试验巢式 PCR 引物:CPK5′-
GSP1 (5′-TGATGGCCA TGGCTGACTCT-3′)、
CPK5′-GSP2(5′-GCACTCCAAACA TCTA TCTC-
3′)和 CPK5′-GSP3 (5′-CTAAGGACT TCGGAG-
CAAC-3′)。按照 5′-RACE 试剂盒(5′-RACE Sys-
tem , version 2.0 , Invit rogenTM Life Technologies)
操作说明 ,获得了 HbCDPK 基因 cDNA 5′末端序
列并对扩增产物进行测序 。对 HbCDPK 基因
cDNA 3′末端和 5′末端序列进行拼接 ,获得 HbCD-
PK 基因全长 cDNA 。根据该 cDNA 序列开放阅读
框两端 ,设计基因全长特异引物 CPK5′(5′-AGATC
TA TGGGCCAG TG TTGCAGCAG-3′)和 CPK3′
( 5′-ACTAG TCTTGAGCT TTA T TGGCTGCT-
3′),引物中下划线部分分别表示 BglⅡ和 S peⅠ酶切位
点 ,以便于进行植物表达载体的构建。对扩增获得的
HbCDPK 基因编码区序列进行测序 ,利用 DNAMAN
软件对 HbCDPK 基因序列进行生物信息学分析。
1.4　HbCDPK 基因的表达模式分析
分别将从短芒大麦根 、幼苗叶片和成熟胚中提
取的总 RNA , 经甲醛变性胶电泳分离后 , 转移到
Hybond-N +尼龙膜上 ,按照 Dig DNA Labeling and
Detection Kit 操作说明书 ,以 DIG 标记的 HbCD-
PK 基因编码区双链DNA 片断为探针 ,进行 North-
ern Blot 杂交 ,对 HbCDPK 基因在根 、幼苗叶片和
成熟胚中的表达模式进行分析[ 14] 。对短芒大麦生
长 2周后的幼苗分别在不同胁迫条件下进行不同时
间(0 , 0.5 , 2.0 , 4.0 , 6.0 ,8.0 , 12.0 ,24.0 h)处理 ,分
批取材后 ,利用 N orthern Blot 方法分析 HbCDPK
基因在 4种胁迫处理下的表达模式 。
1.5　农杆菌介导的烟草转化及转基因烟草的分子
鉴定
分别用含有 Bgl Ⅱ和 S pe Ⅰ酶切位点的引物
CPK5′和 CPK3′扩增 HbCDPK 的 ORF 序列。将
扩增的 cDNA 序列用 Bgl Ⅱ和 Spe Ⅰ酶切后 ,连接
到用相同酶酶切的 pCAMBIA1302 载体上 ,构建含
有 HbCDPK 完整读码框架的植物表达载体 pCam-
bia-CDPK:GFP ,并将构建好的表达载体 pCambia-
CDPK:GFP 通过冻融法导入农杆菌 EHA105 中 ,
采用农杆菌介导法转化烟草叶盘[ 15] 。以潮霉素阳
性烟草植株的叶片为材料 ,小量提取基因组 DNA ,
然后以此 DNA 为模板 ,以 CPK3′和 CaMV 35 S 启
动子的一段核苷酸序列(35S-up:5′-TGA TATCTC-
CACTGACGTAAGGGA TG-3′)作 为 引 物 进 行
PCR 扩增 ,最后以地高辛标记的 HbCDPK 基因的
cDNA 片段作为探针 ,对本试验获得的潮霉素阳性
植株进行 PCR-Southern 检测。
1.6　转基因烟草的抗寒性分析
植物组织受到逆境伤害时 ,由于膜的功能受损
或者结构被破坏 ,而使其透性增大 ,细胞内各种水溶
性物质包括电解质将有不同程度的外渗 ,将植物组
织浸入去离子水中 ,吸光度值会改变[ 16] 。因此 ,可
以通过吸光度的改变 ,测定植物组织的离子渗透率 ,
来说明植物组织在低温胁迫条件下受到的伤害程
度 ,进而可以反映植物的耐寒性。
植物在正常条件下 ,游离脯氨酸含量很低 ,但遇
到干旱 、低温 、盐碱等逆境时 ,游离脯氨酸大量积累 ,
并且积累指数与植物的抗逆性有关[ 17] 。因此 ,脯氨
酸含量可作为植物抗逆性的一项生化指标。
为了检测转基因烟草植株中 HbCDPK 基因超
量表达对其低温胁迫抗性的效应(处理方法同1.1),
分别对在 0 , -4 , -6 , -8 , -10 ℃条件下生长的转
HbCDPK 基因植株 C2 、C8 和 C16 的相对离子渗漏
率 ,及-4 ℃处理 7 d(7 d cold)与正常温度(25 ℃)
113第 2 期 王呈玉 ,等:短芒大麦钙依赖蛋白激酶基因的克隆与功能分析
条件下(Normal)生长的转 HbCDPK 基因植株 C2 、
C8 和 C16 的脯氨酸含量进行测定[ 18] 。
1.7　HbCDPK 基因编码蛋白的亚细胞定位分析
利用分别含有 BglⅡ和 S pe Ⅰ 酶切位点的引物
CPK5′和 CPK3′,扩增 HbCDPK 基因的编码区序
列 ,将测序正确的序列与经 Bgl Ⅱ和 S pe Ⅰ双酶切
的植物表达载体 pCambia1302(本实验室保存)进行
连接 ,构建 HbCDPK-GFP 融合表达载体 ,并对重组
载体进行酶切和测序 。采用农杆菌介导的方法对烟
草进行转化 ,并对诱导生根的转基因烟草根尖伸长
区进行观察[ 19] 。
2　结果与分析
2.1　HbCDPK 基因的克隆与序列
采用 RACE-PCR 的方法 ,成功克隆了短芒大麦
CDPK 基因 HbCDPK ,该基因全长 1 600 bp ,推测
编码 532 个氨基酸的多肽 , 基因序列提交 NCBI
GenBank 数据库 ,获得的登录号为 DQ250026。序
列分析结果(图 1)表明 , HbCDPK 基因与其他植物
CDPK 基因的同源性比较高 ,在 HbCDPK 编码的
氨基酸序列中 ,其起始氨基酸序列为“MGQCCSR” ,
该序列是具有豆蔻酰化和棕榈酰化作用所必需的保
守序列 MGxxC(S/Q)xxT[ 20-21] ,因此推测该蛋白激
酶可能定位在膜上 , 这还有待进一步试验证明。
HbCDPK 编码氨基酸序列具有 CDPK 家族所特有
的 4 个特征性 EF-hand 蛋白结构域和 Ser/ Thr 蛋
白激酶活性位点[ 22-27] ,其中催化结构域同样包含 11
个高度保守的亚结构域[ 22-27] ,但 HbCDPK 编码的
氨基酸序列在 N-端可变区与其他植物的 CDPK 之
间的差异很大 ,而在激酶结构域和 EF-hand 蛋白结
构域的保守性却非常高。
图 1　HbCDPK 与其他 6 种植物 CDPK 氨基酸序列的比较
Ⅰ ～ Ⅺ.催化结构域;EF1～ EF4.EF-hand 结构域
Fig.1　Alignment of the deduced amino acid sequences of H bCDPK w ith its homo lo gs
Ⅰ -Ⅺ.Location of a catalyt ic domain;EF1-EF4.C alcium-binding domain(EF1-EF4 hands)
114 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 39 卷
　　为了进一步明确 HbCDPK 基因编码蛋白与其
他已报道 CDPK 的同源关系以及它在整个钙依赖
蛋白激酶家族中的分类地位 ,根据 Cheng 等[ 2] 的分
类方法 ,从拟南芥 CDPK 家族每个小组中分别选取
有代表 性的 基因 作为 分 类的 基本 框架 , 用
DNAMAN软件进行序列比对分析 ,结果(图 2)表
明 , HbCDPK 与拟南芥 CDPK 9 、CDPK29 和 CD-
PK 33 同属于G roup Ⅱ 。
图 2　HbCD PK 基因编码蛋白与拟南芥 CDPK 的系统进化树
方框内表示 HbCDPK 基因编码蛋白;G roup Ⅰ ～ Ⅳ表示 CDPK 亚家族[2]
Fig.2　Phy lo genetic analy sis o f HbCDPK with CDPK in Arabidopsis
H bCDPK is boxed;Group Ⅰ - Ⅳ indicate sub family of CDPK [ 2]
2.2　HbCDPK 基因的表达模式
2.2.1　HbCDPK 基因的组织表达特性　由图 3可
见 , HbCDPK 基因在短芒大麦根 、幼苗叶片和成熟
胚中均表达 ,且在幼苗叶片和成熟胚中的表达量明
显高于根部组织;由于 HbCDPK 在成熟胚中明显
的时空积累 ,因此可以推测 HbCDPK 参与了短芒
大麦种子的形成过程 。
2.2.2　HbCDPK 基因在不同胁迫条件下的表达特
性　图 4 表明 , HbCDPK 基因在不同胁迫条件下处
理不同时间的表达丰度有差异。 HbCDPK 基因在
正常生长条件下(0 h)有微量表达 ,其表达明显受到
低温(4 ℃)和干旱(200 g/L PEG6000)胁迫的诱导
而上调 。当低温处理 6 h 时 , HbCDPK 表达量最
高 ,之后随着时间的延长其表达量逐渐减少;当盐胁
迫处理时 , HbCDPK 表达量在 2 h 内快速增高 ,并
持续表达 , 24 h 达到最高;当干旱胁迫 2 h 时 Hb-
CDPK 表达量达到最高 ,并持续到 6 h ,随后快速下
降;当 ABA 处理 0 ～ 24 h 时 , HbCDPK 表达量均较
低 ,且变化小。
115第 2 期 王呈玉 ,等:短芒大麦钙依赖蛋白激酶基因的克隆与功能分析
图 3　HbCDPK 基因的组织特异性表达分析
R.根;L.叶片;S.成熟胚
Fig.3　Tissue-specific e xpression of the HbCDPK gene
R.Roots;L.Leaves;S.Mature em bryo
图 4　不同胁迫条件下 HbCDPK
基因在转录水平的表达模式
Fig.4　Northern-blo t analyses of the HbCD PK transcript
induced under v arious abio tic stresses
2.3 　转 HbCDPK 基因烟草的 PCR 和 PCR-
Southern检测
图 5 显示 ,以 CPK3′和 35S-up 为引物 ,从转 Hb-
CDPK 基因烟草 DNA 中扩增得到的 DNA 片段与阳
性对照相同 ,约为 1.6 kb ,而阴性对照(野生型烟草)
中无该扩增产物。为了进一步验证该结果 ,将部分转
基因烟草的 PCR 产物经 Southern 吸印转至尼龙膜
上 ,以地高辛标记的 HbCDPK cDNA 为探针 ,对部分
PCR阳性植株进行 PCR-Southern 检测 ,结果表明 ,扩
增产物均与探针产生杂交信号 ,表明 HbCDPK 的
cDNA 已整合到转基因烟草基因组 DNA 中。
2.4　转基因烟草的抗寒性
2.4.1　相对离子渗漏率　由图 6 可见 ,当培养温度
在0 ℃以下时 ,野生型烟草和转 GFP 基因烟草的相
对离子渗漏率明显较高 ,在-4 ℃时相对离子渗漏率
已经超过 80%,植物组织在低温胁迫条件下受到的伤
害程度明显;而在低温条件下培养的转 HbCDPK 基
因烟草的相对离子渗漏率较野生型烟草及转 GFP基
因烟草低 ,温度降至-6 ℃以下时 ,其相对离子渗漏
率低于 80%,表明转 HbCDPK 基因烟草植物组织在
低温胁迫条件下受到的伤害程度明显低于野生型烟
草和转 GFP 基因烟草。可知转 HbCDPK 基因烟草
的低温胁迫抗性明显高于野生型烟草 。
图 5　部分转 HbCD PK 基因烟草的 PCR及
PCR-Southern 检测结果
PCK.质粒 pCambia-CDPK:GFP;NCK.野生型烟草;
2 , 3 , 8 , 16.部分转 HbCDPK 基因烟草
F ig.5　PCR and PCR southern analy sis wa s used to
identification o f the transgene tobaccoes
PCK.Plasm id of pC ambia-CDPK:GFP;NCK.Wild type;
2 , 3 , 8 , 16.Transgenic tobacoos
图 6　低温胁迫条件下转 HbCDPK 基因烟草叶片的
相对离子渗漏率
WT.野生型烟草;Vector.35S-GFP 转基因烟草;
C2 、C8 、C16.HbCDPK-GFP转基因烟草
Fig.6　Relative leakage ra tio in discs o f young leaves
of HbCDPK over-expression transgenic tobaccos
WT.Wild ty pe tob acco;Vector.Transformed w ith
35S-GFP;C2 , C8 , C16.T ransformed w ith H bCDPK-GFP
2.4.2　脯氨酸含量　图 7 表明 ,经过低温处理后转
HbCDPK 基因烟草植株体内的游离脯氨酸含量超
过 15 μg/mg ,明显高于野生型烟草 。
以上结果表明 ,在低温胁迫条件下 ,细胞中保护
性物质(脯氨酸)的含量增加 ,降低了细胞在低温胁
迫条件下受到损伤的程度 ,增强了转基因植株的抗
寒性。
2.5　HbCDPK 基因编码蛋白的亚细胞定位
由于根部受叶绿体荧光干扰较小 ,所以取转基
因烟草根尖进行观察 ,结果见图 8。
116 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 39 卷
图 7　低温胁迫条件下转 HbCDPK 基因烟草的
脯氨酸含量
WT.野生型烟草;Vector.35S-GFP 转基因烟草;
C2 、C8 、C16.HbCDPK-GFP 转基因烟草
Fig.7　P roline levels in discs of leaves of tobaccos
w ith cold str ess
WT .Wild type tob acco;Vecto r.Transformed w ith 35S-GFP;
C2 , C8 , C16.T ran sfo rm ed wi th H bCDPK-GFP
　　在细胞质 、细胞核和细胞膜部位观察到绿色
荧光(图 8B),表明 GFP 绿色荧光蛋白在转基因烟
草的细胞质 、细胞核和细胞膜中均有表达;而只在转
基因烟草的细胞膜观察到了 HbCDPK:GFP 融合蛋
白绿色荧光(图 8D)。为了排除细胞壁的干扰 ,又进
行了质壁分离试验 ,结果(图 8E 、F)显示 , HbCD-
PK:GFP 融合蛋白只在细胞膜中表达 。
3　讨　论
由于 CDPK 广泛参与了植物生长发育和逆境
的响应过程 ,因此在植物的长期演化过程 ,植株体内
的 CDPK 以众多成员组成的家族形式存在 ,并通过
各自的结构特征和功能 ,分别介导不同的内部生育
信号和外部逆境的信号转导过程。前人已在不同作
物中鉴定出了许多 CDPK 基因。本研究从具有强
抗寒性 、耐旱耐瘠性 、耐盐碱性等优良抗逆性状的单
子叶牧草作物 ———短芒大麦中 ,成功分离了一个新
的 CDPK 基因 ,并将其命名为 HbCDPK 。
图 8　HbCDPK 基因编码蛋白的细胞质膜定位分析
A 、B.GFP 绿色荧光蛋白的表达;C 、D.H bCDPK-GFP 融合蛋白的表达;E 、F.质壁分离试验
A 、C 、E.明视野;B、D 、F.暗视野;箭头表示质壁分离后的细胞膜;标尺表示 100μm
Fig.8　Image s o f HbCDPK pro tein ta rge ted to cell membrane of ro ot cells of t ransgenic tobacco
A , B.T he tobaccos w ere t ransformed w ith 35S-GFP;C , D.The tobaccos w ere t ran sformed wi th H bCDPK-GFP;
E , F.E xperim ent of plasmolysi s A , C , E.Bright f ield;B, D , F.Dark field;T he arrow indicated the cel l m emb rane;scale:100μm
　　本研究对克隆的 HbCDPK 基因编码氨基酸序
列进行了分析 ,结果表明 , HbCDPK 基因与其他植
物的 CDPK 基因同源性比较高 。从蛋白质的 N 端
到 C端 ,存在 4 个典型的功能域 ,依次为可变区 、催
化区 、连接区和调控区[ 8] 。在 CDPK 的 N 末端为可
变区 ,不同植物种属间该区域的氨基酸残基数量变
异较大 ,故在氨基酸水平上同源性低 。与可变区相
接的催化区 ,通常由 300 多个氨基酸残基组成 ,该区
域中具有典型的 Ser/Thr 蛋白激酶的催化保守序
列 ,不同种属或不同成员之间具有较高的同源性。
CDPK 家族中的不同成员基因 ,分别在特定组
织 、生理条件或发育阶段下表达 ,执行特定的生物学
功能。水稻的 2 个 CDPK 基因在叶片对光的反应
中具有不同的功能[ 28] ;烟草 CDPK 基因的转录本存
在于根 、茎和花中 ,而在叶片中未能检测到其转录
本[ 29] ;马铃薯 CDPK 基因的表达受发育阶段的调
控 ,其在块茎形成开始时被诱导表达[ 30] 。本研究
中 , HbCDPK 是一个编码膜定位钙依赖蛋白激酶基
117第 2 期 王呈玉 ,等:短芒大麦钙依赖蛋白激酶基因的克隆与功能分析
因 ,其在短芒大麦根 、幼苗叶片和成熟胚中均有表
达。
近年来通过对拟南芥 、水稻等植物的研究表明 ,
在 34 个拟南芥 CDPK 成员和 29 个水稻 CDPK 成
员中 , 多数 CDPK 与逆境信号转导有关[ 8-10] 。
S heen[ 7] 发现 , 在干旱和盐诱导条件下 , 拟南芥
A tCDPK 1 和 AtCDPK 2 的表达量明显增大;拟南
芥 AtCDPK 10 和 AtCDPK 30 参与了对 ABA 和非
生物胁迫的信号转导。Zhang 等[ 22] 发现 ,烟草的
CDPK 基因 NtCPK4 ,在赤霉素和盐处理条件下 ,表
达水平显著上调 ,说明 NtCPK4 基因在调节植物对
外界环境胁迫中起着重要作用。本研究中 , HbCD-
PK 基因在低温 、干旱 、高盐和 ABA 不同胁迫条件
下处理不同时间的表达丰度有差异 ,其中低温胁迫
条件下的表达信号最强。
利用基因的遗传转化技术 ,对来自不同植物种
属CDPK 基因的功能研究证实 ,一些 CDPK 基因参
与了低温 、高盐和干旱等非生物胁迫信号和激素信
号的传导 ,部分基因超量表达 ,通过诱导转基因植株
下游胁迫响应基因的表达 ,增强了植株对低温 、高盐
和干旱的抵御能力[ 7] 。其中水稻中一种与膜相关的
CDPK 基因可被低温诱导[ 31] ,而 OsCDPK7 受低温
和高盐诱导 ,当 OsCDPK7 在水稻中超量表达时 ,转
基因水稻能够增强对高盐和干旱的抗性[ 32] 。激活
的 AtCDPK 能够诱导胁迫响应基因 H VA 1 启动子
的驱动报告基因表达 ,表明 CDPK 基因参与了胁迫
信号的传导[ 7] 。OsCDPK13 基因表达的蛋白及其
蛋白的积累 ,能够上调植物对低温和赤霉素(GA)的
反应 ,超量表达 OsCDPK13 的转基因水稻较对照组
表现出明显的冷胁迫修复能力[ 23] 。Lu 等[ 33] 的研究
结果表明 , I iCPK2 受低温 、高盐和植物激素诱导表
达 ,因此其可能参与了低温 、高盐和激素信号转导通
路。本研究中 , HbCDPK 基因的表达特性分析结果
表明 ,其在短芒大麦中参与了调控非生物胁迫信号
的转导 。本研究对低温胁迫条件下转 HbCDPK 基
因烟草植株和野生型烟草植株的相对离子渗漏率 、
脯氨酸含量进行了测定 ,结果表明 ,转 HbCDPK 基
因烟草的相对离子渗漏率较野生型烟草低 ,而脯氨
酸含量较野生型烟草高 ,表现出了明显的抗寒性。
研究证实 ,CDPK 在植物的抗逆信号转导过程中具
有重要作用 ,虽然其介导的胁迫信号转导通路与其
他信号通路的相互联系还不清楚 ,但本研究结果不
仅丰富了 CDPK 基因的相关信息 ,而且为植物抗逆
性的遗传改良提供了新的材料和方法。
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