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研究论文
驱虫斑鸠菊血清药物化学研究
周佳 , 尚靖＊ , 廖莎 , 平锋锋 (中国药科大学新药筛选中心 , 南京　210009)
摘要:目的　研究驱虫斑鸠菊的血清药物化学。方法　通过比较驱虫斑鸠菊提取物 、 给药及未给药大鼠血清的
H PLC 指纹图谱 , 确定灌服驱虫斑鸠菊后大鼠血中移行成分。结果　经多次重复试验后 , 确定血清的处理方法为每
100μL 大鼠血清加入 1 mL 乙腈沉淀蛋白。驱虫斑鸠菊提取物给药组大鼠血清的 H PLC 图谱与不给药组空白血清对
比有明显不同。含药血清中出现 12个移行成分 , 其中有 6 个成分含量较高 , 且与提取物 HPLC 图谱在相同保留时
间出峰 , 可能为原形成分 , 4 种成分可能为代谢物。结论　本研究确定了驱虫斑鸠菊的血中移行成分 , 为阐明驱虫
斑鸠菊治疗白癜风药效物质成分奠定了基础。
关键词:驱虫斑鸠菊;血清药物化学;移行成分;高效液相色谱
中图分类号:R969.1 , R284　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1672-2981 (2011)08-0561-03
do i:10.3969/ j.issn.1672-2981.2011.08.001
Serum pharmacochemistry of Vernonia anthelmintica
ZH OU Jia , SH ANG Jing＊ , LIAO Sha , PING Feng-feng (Drug Screening Center , China P harmaceutical Universi-
ty , Nanj ing 210009)
Abstract:Objective　 To inve stigate the serum pharmacochemistr y o f Vernohia anthelmintica .Methods　HPLC-UV
chromato g ram w as compared among the peaks of Vernonia anthelmintica ex tracts , serum w ith drug and blank serum to
de te rmine the tr ansitional blo od components in rats after the administration o f ex tracts.Results　After repeated exper-
iments , w e determined the be tte r method to deal with the serum.We added 1 mL e thy l cyanide into 100 μL ra t serum
to precipitate the pro teins.Twe lve compounds w ere obtained , 6 of which w ere found with high content and had the
same retention time w ith tho se in the HPLC chromatog ram of e xtr acts , and ano ther 4 compounds might be me tabo-
lite s.Conclusion　The compounds are abso rbed into the blo od and their metabolites are the effective constituents.The
or iginal crude drug s are the main ingr edients in Vernonia anthelmintica.
Key words:Vernonia anthelmintica;serum pharmacochemist ry;compound;HPLC
　　血清药物化学即从含有真正有效成分的血液中分取血清
进行药物学研究 , 是由日本学者田代真一于 1988 年提出来
的[ 1] 。中药血清药物化学是以传统药物化学方法为基础 , 综
合应用多种现代技术 , 分析鉴定进入体内后血清中移行成
分[ 2] , 把得到的成分与复方再次进行药效学比较 , 揭示中药
药效物质基础[3-4] 。
驱虫斑鸠菊 Vernonia anthelmintica (L.)Willd 为菊科
(Compositae)斑鸠菊属一年生草本植物 , 有清除异常黏液
质 、 促进黑素沉着 、 恢复皮肤颜色 、 驱虫 、 消肿 、 散寒 、 止
痛的功效[5-7] 。有文献报道驱虫斑鸠菊中的总黄酮是治疗白
癜风的主要活性物质 , 但物质基础和作用机制不清楚[8] 。本
实验采用血清药物化学方法 , 在建立驱虫斑鸠菊 HPLC 指
纹图谱基础上 , 通过比较驱虫斑鸠菊提取物 、 给药及未给药
大鼠血清 H PLC 图谱 , 确定驱虫斑鸠菊血中移行成分 , 为
最终确定驱虫斑鸠菊药效物质成分奠定基础。
1　材料
1.1　仪器及试剂
LC-2010H T (配备自动进样器 SIL-20AC 、 UV 检测
器 、 LcSolution1.11sp1 工作站 , 日本岛津);COSMOSIL-
C18分析柱(250 mm×4.6 mm , 5 μm);保护柱 Security Guard
　　基金项目:国家 “十一五重大新药创制” 科技重大专项 (No.20092X09102-119);国家自然科学基金 (No.30873156);教育部新世纪人
才项目 (No.NCEF-07-0851)
作者简介:周佳 , 女 , 硕士研究生 , 主要从事中西医结合天然药物物质基础研究 , Tel:13912944742 , E-mail:zhoujia198602@
163.com　　＊通讯作者:尚靖 , 女 , 博士 , 博士生导师 , 主要从事药理学及天然药物结构与功能的相关性研究 , Tel:(025)
83271142 , Fax:(025) 83271142 , E-mail:shangjing2006@yahoo.com.cn
中南药学 2011年 8月第 9卷第 8期　Cen tral South Pharm acy .August 2011, Vol.9 No.8
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Cartridg es C18 (4 mm×3.0 mm);KH -500DB 型数控超声
波清洗器 (昆山禾创超声仪器有限公司);XW-80A 涡旋
混合器 (上海医科大学仪器厂);LEGEND Micro 21R冷冻
离心机 (Thermo SCIENTIFIC);BS210S 电子天平 (北京赛
多利斯有限公司);SPD 2010 真空浓缩机 (Thermo Electron
公司)。甲醇 、 乙腈 (色谱纯 , Merk 公司);甲酸 (分析纯 ,
南京化学试剂有限公司);三蒸水 (Milli-Q 自动纯水机 ,
美国 Millipore 公司)。
1.2　药材
驱虫斑鸠菊成熟果实采自新疆阿克苏地区扎木台乡 , 经
北京医科大学药学院天然药物教研室艾铁民教授鉴定为菊科
植物驱虫斑鸠菊 (Vernonia anthelmintica)干燥成熟果实。
1.3　动物
SPF 级 Sprague Daw ley (SD)大鼠 , 250 ～ 300 g , 均
为雄性 , 共 12 只 [ 上海市西普尔-必凯实验动物有限公司 ,
许可证号:SCXK (沪)2008-0016] , 分笼饲养 , 基础饲料
为实验鼠全价颗粒饲料 (江苏省江浦实验动物饲料厂)。
2　方法
2.1　液相色谱条件[ 9-10]
COSMOSIL C18 色谱柱 (ODS , 250 mm ×4.6 mm ,
5 μm)。流动相:乙腈 (A)-0.05%甲酸溶液 (B), 梯度洗
脱程序:0～ 30 min:10%～ 20% A , 30 ～ 40 min:20%～
24% A , 40 ～ 65 min:24%～ 32% A , 65 ～ 70 min:32%
A;流速:1 mL · min -1 ;检测波 长:289 nm;柱温:
40 ℃;检测时间 70 min;进样量:20 μL。
2.2　供试品溶液的制备
2.2.1　提取物的制备　精密称取驱虫斑鸠菊药材 5 g , 粉碎
后加入 60%乙醇 100 mL , 加热回流提取 3 次 (3 次加入
60%乙醇量依次为药材的 20、 10、 10 倍), 3 次提取时间依
次为 2 、 1.5 、 1 h , 将提取液过滤 , 合并上清液 , 浓缩并置
于 100 mL 容量瓶中 , 用提取溶剂定容至 100 mL , 制得提取
物溶液 (相当于原药材 0.05 g· mL-1)。使用相同的制备方
法 , 于药厂中制得较大量的驱虫斑鸠菊提取物溶液 , 并制成
固体粉末备用。
2.2.2　驱虫斑鸠菊供试品溶液的制备[ 10] 　取 “ 2.2.1” 项
下所制得的提取物溶液 0.6 m L , 置于 10 mL 容量瓶中 , 用
提取溶剂定容 , 溶液过 0.45 μm 微孔滤膜 , 取滤液 100 μL
挥干溶剂 , 复溶液 100 μL (甲醇-水= 3∶2)复溶 , 进样
20 μL 进行 H PLC 分析。
2.2.3　驱虫斑鸠菊灌胃液的制备　精密称取 “2.2.1” 项下
的驱虫斑鸠菊提取物 120 g , 研磨至细 , 加入 0.5%CMC-Na
溶液 300 m L , 混悬均匀 , 制成含提取物 0.4 g · mL-1的混
悬液 (相当于原药材 0.44 g ·mL-1), 密封 , 置 4 ℃冰箱保
存供灌胃使用。
2.3　拟含药血清处理[ 11-12]
取 “ 2.2.2” 项下驱虫斑鸠菊供试品溶液 100 μL 于 EP
管中 , 挥干溶剂 , 加入 0.1 m L 大鼠空白血清 , 涡旋使残渣
完全溶解 , 分 3 种方法进行处理 , ①加入 2 mL 乙酸乙酯提
取;②加入 1 mL 甲醇沉淀;③加入 1 mL 乙腈沉淀 , 3组均
涡旋提取 5 min , 14 000 r · min -1离心 10 min , 取上清液
0.8 mL , 挥干溶剂 , 加入复溶液 (甲醇-水=1∶1)100 μL
复溶并涡旋至溶解完全 , 14 000 r ·min -1离心 10 min , 取上
清液 , 再次离心 10 min 后即可进样。
空白血清的处理方法同拟含药血清处理方法。
2.4　空白血清及含药血清的采集和处理
2.4.1　给药及采血　SD 大鼠 12 只 , 分两笼饲养于温度
22～ 28 ℃、 自然光照及明暗各 12 h 的 SPF 级动物实验室
内 , 实验前适应性饲养 1周 , 天黑前投食 , 自由饮水。取血
前禁食约16 h , 可自由饮水 , 编号后取空白血液 , 分离空白
血清 , 置-20 ℃冰箱中冷冻备用。采血后恢复 3 d 进行给
药。
按单剂量4 g · kg-1 · d -1灌胃给药 (每毫升相当于原药
材 0.44 g), 连续给药 5 d , 前 4 d给药时正常饮食饮水 , 末
次给药前禁食约 16 h , 可自由饮水 , 给药后不同时间点 (1 、
1.5 、 2、 3 h)按编号取血 , 分离含药血清 , 置-20 ℃冰箱
中冷冻备用。
12 只大鼠的空白血清与含药血清一一对应。
2.4.2　血清样品的处理　取给药及空白大鼠血清 100μL于
EP 管中并编号 , 加入 1 m L 乙腈涡旋提取 , 处理方法同拟
含药血清的处理方法。
2.5　H PLC 色谱分析
按 “2.1” 项下色谱条件 , 分别测定驱虫斑鸠菊供试品
溶液 、 驱虫斑鸠菊含药血清和空白血清的 H PLC 色谱图。
3　结果
3.1　拟含药血清不同处理方法色谱图
使用乙酸乙酯萃取 、 甲醇和乙腈沉淀的方法处理拟含药
血清 , 结果表明 , 相同量的拟含药血清经过处理后 , 乙腈沉
淀法得到的药物回收率最高 , 杂质成分最少 , 且没有物质成
分的缺失 , 见图 1A 。考察不同体积的乙腈对血清中固有成
分去除效果以及药物回收率的影响 , 结果表明 , 加入 0.5 、
0.8 mL 的乙腈处理后 , 拟含药血清中药物的回收率较加入
1 mL 乙腈比 , 略低 , 见图 1B , 确定加入乙腈的量为 1 mL 。
3.2　不同时间点含药血清色谱图
灌胃给药后不同时间点采集得到的含药血清 HPLC 色
谱图分析可知 , 1 h 时采得的含药血清中所含的药物成分最
多 , 且浓度最高 , 见图 2 , 因此确定 1 h 为给药后的采血时
间。
3.3　血清中移行成分的分析
在实验建立的色谱条件下 , 驱虫斑鸠菊供试液 (A)、
驱虫斑鸠菊含药血清 (B)、 空白血清 (C)的色谱见图 3。
由图 3 (A)可见 , 驱虫斑鸠菊供试液中共检出 13 个峰。通
过比较驱虫斑鸠菊含药血清与空白血清 , 发现驱虫斑鸠菊含
药血清中出现了 12 个新色谱峰 , 即 a～ l号峰。比较发现含
药血清中 c、 e、 f 、 g 、 i、 k 号峰分别于驱虫斑鸠菊供试液中
的 1、 5、 6 、 7、 8 、 10 号峰相对应 , 说明有 6 种驱虫斑鸠菊
原型成分被吸收入血。而在图 3 (B)中的 a、 b、 h、 j号峰
是驱虫斑鸠菊含药血清的特有峰 , 可能是驱虫斑鸠菊提取物
在大鼠体内的代谢产物。在驱虫斑鸠菊含药血清色谱图中
d 、 l号峰位置 , 驱虫斑鸠菊供试液和空白血清在相近位置上
都出现此峰 , 该色谱峰是血清中的固有成分 , 还是血清中固
Cen t ral South Pharmacy.August 2011 , Vol.9 No.8　中南药学 2011年 8月第 9卷第 8期
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有成分与驱虫斑鸠菊原型成分的叠加 , 有待采用质谱等检测
方法做进一步的考察。
4　讨论
本实验中空白血清及驱虫斑鸠菊含药血清都采自同一只
大鼠 , 通过自身对照 , 消除了个体差异造成的分析误差。在
分析生药药品和给药后血清样品时 , 采用完全相同的色谱条
件 , 因此 , 2 种样品的 HPLC 图谱中的色谱峰应具有很好的
对应关系 , 同时 , 实验中还对供试液的稳定性 、 仪器的精密
度 、 检测方法的重复性等进行了考察 , 均符合相关要求。
实验确定了给药后的取血时间 , 保证含药血清中含有最
高浓度的驱虫斑鸠菊药物移行成分。同时还确定了含药血清
的处理方法 , 使检测得到的 H PLC 色谱峰能更好的表征含
药血清中含有的药物成分。
　　本实验采用血清药物化学的方法对驱虫斑鸠菊进行研
究 , 通过比较驱虫斑鸠菊 60%醇提物 、 驱虫斑鸠菊含药血
清和空白血清 H PLC 色谱图的差异 , 确定血中有 12 种移行
成分 , 其中 6种为原型成分 , 4 种可能为原型成分的代谢产
物。
　　本研究确定的 12 种入血成分可能是驱虫斑鸠菊的体内
直接作用物质 , 对其进行研究并结合含药血清的体外药效检
测结果 , 将有助于阐明驱虫斑鸠菊治疗白癜风 、 促进黑素合
成作用的药效物质基础。在此基础上进行深入研究探讨 , 可
建立驱虫斑鸠菊的药效指纹图谱 , 实现根据药效作用制定质
量控制标准的目的 , 为更好地控制该药的质量奠定基础。
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(收稿日期:2011-03-23;修回日期:2011-04-18)
中南药学 2011年 8月第 9卷第 8期　Cen tral South Pharm acy .August 2011, Vol.9 No.8