全 文 ： 多枝赖草 、高羊茅的组织培养和愈伤组织诱变
葛荣朝1 , 　赵宝存1 , 　秘彩莉1 , 　郭光艳1 , 　赵茂林2
(1.河北师范大学 生命科学学院 ,河北 石家庄　050016;2.北京市农林科学院农业生物技术研究中心 ,北京　100089)
摘 要:以多枝赖草 、高羊茅的种子为材料 ,在诱导培养基上进行暗培养 , 产生愈伤组织.愈伤组织经多次继代
培养后仍可保持分化潜力.在分化培养基上进行光照培养后, 可以分化出丛生状幼苗 ,并大量生根 ,形成再生植株.用
EMS 溶液对2 种愈伤组织进行诱变处理 ,结果表明:不同体积分数的 EMS 对愈伤组织的致死率不同 ,随着体积分数
的提高 ,致死率逐步升高.经统计 ,初步确定 EMS 溶液对多枝赖草 、高羊茅愈伤组织的半致死体积分数分别为 6 mL/ L
和 8 mL/ L.
关键词:多枝赖草;高羊茅;组织培养;愈伤组织;EMS 诱变
中图分类号:S 543　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5854(2007)04-0531-04
随着世界经济的飞速发展和人们生活水平的日益提高 ,人类对环境质量越来越重视.草坪具有调温 、调
湿 、降低空气污染 、降低城市噪音 、防止水土冲刷和泥土上路等功能 ,在城市环境绿化中起着重要的作用.我
国的草坪业起步较晚 ,草坪草育种相对落后 ,为了满足城市绿化的需求 ,我国每年都要进口大量的草籽 ,且呈
逐年上升趋势.因此 ,培育出一些适宜于本地种植的优良草种及草种组合是当务之急[ 1 ,2] .多枝赖草具有很
好的耐盐碱性 ,对黄矮病具有突出的抗性;同时还具有耐干旱 、耐瘠薄 、耐污染 、光能利用率高的特性;具有横
向生长的地下茎 ,横向扩展性较好;具有较好的耐践踏 、耐刈割特点 ,可用于各种绿地.所以 ,多枝赖草具有培
育成优良抗逆草坪草种的潜力[ 3 ,4] .本文中 ,笔者主要是对多枝赖草 、高羊茅进行组织培养 ,然后对其愈伤组
织进行诱变处理 ,并获得再生植株 ,以期从再生植株或其后代中筛选出较为优良的草坪草品种.
1　材料与方法
1.1　实验材料
多枝赖草 、高羊茅的种子.
1.2　实验方法
1.2.1　培养基组成
基本培养基为 MS 培养基 ,附加 30 g/L 蔗糖 、5 g/ L琼脂 ,用 NaOH 调溶液至 pH 5.8.
诱导培养基为 MS+3 mg/L 2 , 4-D+0.5 mg/ L Kt;继代培养基为 MS +1 mg/L 2 , 4-D+0.5 mg/L
Kt;分化培养基为 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA.
1.2.2　再生体系的建立
选取籽粒饱满的草籽反复清洗 ,室温浸泡 24 h ,然后于超净台上用 700mL/L 的乙醇消毒 30 s ,无菌水冲
洗 3次 ,再用含 2 mL/ L Tw een20的有效氯为 20 mL/L 的 NaClO溶液浸泡 20 min ,之后用无菌水冲洗 3次.
将消毒的种子接种于诱导培养基上 ,25 ℃暗培养.
种子诱导出愈伤组织后 ,将生长良好的愈伤组织块从种子上剥离 ,接种到继代培养基上 ,移至光照培养
箱中培养.愈伤组织生长到合适大小时 ,将生长旺盛的愈伤组织一部分用于诱变处理 ,一部分接种到分化培
养基 ,诱导生芽 、生根.以上培养条件均为(25±2)℃,每天 16 h光照.
1.2.3　愈伤组织的诱变处理
用无菌水分别配置 2 ,4 ,6 ,8 ,10 mL/L 的甲基磺酸乙酯(EMS)溶液 ,将 2种愈伤组织在预先灭菌的培养
收稿日期:2006-12-07;修回日期:2007-03-02
基金项目:国家自然科学基金(30070461 , 30370905);北京市自然科学基金(5032009)
作者简介:葛荣朝(1974-),男 ,河北故城人 ,副教授 ,主要从事小麦 、草坪草 、饲草育种和分子细胞遗传学研究.
通讯作者:赵茂林(1965-),男 ,研究员 ,主要从事小麦边缘杂交育种.E-mail:zhaomaolin@baafs.net.cn
第 31卷/第 4期/
2007年 7月
河北师范大学学报/自然科学版/
JOURNALOFHEBEI NORMALUNIVERSITY/Natural Science Edition/
Vol.31 No.4
Jul.2007
DOI :10.13763/j.cnki.jhebnu.nse.2007.04.032
皿中用解剖刀切成 3 mm×3mm大小 ,分别倒入不同的 EMS 进行诱变处理 , 2 h后用无菌水冲洗 3次 ,将诱
变后的愈伤组织块接种在继代培养基上 ,每瓶接种大约 30块 ,每处理接种 10瓶.每隔 1周统计 1次 ,计算各
处理的愈伤组织致死率:
　　致死率=褐化死亡的愈伤组织块数接种的愈伤组织总块数 ×100 %.
2　结果与分析
2.1　愈伤组织的诱导与生长
2种草坪草种子接种到诱导培养基上 ,暗培养 7 d左右 ,高羊茅出现萌动 、生芽 , 14 d后 ,多数种子萌发 ,
一些幼芽的基部生长出愈伤组织.多枝赖草的种子在培养到 21 d 时 ,种胚处观察到白色突起 ,形成愈伤组
织.生长约 40 d后 ,将 2种愈伤组织转移到继代培养基上继续暗培养 ,愈伤组织生长趋于旺盛 ,大约 30 d继
代 1次.在继代的过程中 ,高羊茅的部分愈伤组织有分化出绿苗的现象.
　　A.高羊茅愈伤组织;B.多枝赖草愈伤组织;C.高羊茅愈伤组织出苗;D.多枝赖草愈伤组织出苗;E.高羊茅幼苗移栽到大田.
图 1　多枝赖草和高羊茅的组织培养
2.2　愈伤组织的分化与生根
将暗培养的愈伤组织移至分化培养基上 ,在光照条件下诱导形态建成.高羊茅愈伤组织在 20 d 左右即
分化出幼苗 ,分化率达83.9 %以上.多枝赖草的愈伤组织表面约 14 d后产生若干淡绿色芽点 ,25 d左右长成
丛生状幼苗 ,平均每块愈伤组织块可以分化出 20 ～ 30个小植株 ,其分化率约为 63.9 %以上.在 2种幼苗生
长的同时会生出大量须根 ,生根率可达 100 %.
成苗后打开瓶口炼苗 7 d.然后取出小苗洗净琼脂 ,移栽于大田 ,覆盖塑料薄膜培养 10多天后 ,去掉塑料
薄膜 ,使其自然生长 ,成活率可达 95 %以上.
2.3　愈伤组织的诱变
2种草坪草的愈伤组织经过 EMS 诱变 ,分别接种到继代培养基上.在培养到第 3 周时 ,不同诱变处理间
的愈伤组织出现明显的生长差异;培养到第 4周时 ,统计愈伤组织的致死率.分析统计结果可以发现 ,多枝赖
草和高羊茅的愈伤组织经过 EMS溶液处理后 ,其生长明显受到抑制 ,而且随着处理液体积分数的提高 ,其
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生长受抑制的现象更加明显 ,褐化死亡的数目明显增加(见图 2 、表 1).多枝赖草愈伤组织经过 6 mL/L EMS
溶液处理 2 h后 , 308块愈伤组织只有42块出现明显生长 ,187块褐化死亡 ,致死率达到 60.7 %;而高羊茅的
愈伤组织经 8mL/L EMS 溶液处理后 , 310 块愈伤组织有 25块出现明显生长 , 195块褐化死亡 ,致死率为
62.9 %.所以通过本试验初步确定 EMS溶液对多枝赖草愈伤组织的半致死体积分数为 6 mL/L ,对高羊茅
愈伤组织的半致死体积分数为 8 mL/ L.
A.2 m L/ L EMS溶液诱变的高羊茅愈伤组织;B.6 mL/ L EMS 溶液诱变的多枝赖草愈伤组织;
C.8 mL/ L EMS 溶液诱变的高羊茅愈伤组织.
图 2　多枝赖草和高羊茅愈伤组织的 EMS诱变
表 1　多枝赖草和高羊茅愈伤组织 EMS的诱变结果
EMS 溶液/
(mL·L-1)
多枝赖草愈伤组织
接种数 褐化数 明显生长 致死率/ %
高羊茅愈伤组织
接种数 褐化数 明显生长 致死率/ %
2 310 79 101 25.5 327 49 187 15.0
4 320 123 76 38.4 324 88 95 27.2
6 308 187 42 60.7 317 133 59 42.0
8 320 276 26 86.3 310 195 25 62.9
10 331 315 3 95.2 303 249 11 82.2
3　讨　论
试验中多枝赖草由种子诱导出愈伤组织的时间偏长 ,且出愈率较低 ,分析其原因主要是由于多枝赖草种
子本身发芽所需时间较长 ,约 15 d左右 ,且发芽率较低.在愈伤组织诱导过程中 ,生长素与细胞分裂素的协
同调控作用在组织培养中非常重要.试验中同时添加了生长素 2 , 4-D和细胞分裂素 Kt 2种植物激素 ,其中
2 ,4-D主要诱导愈伤组织产生 、Kt则促进了愈伤组织的快速生长 ,二者协同作用 ,使愈伤组织得以顺利诱导
和旺盛生长.
化学诱变是通过采用一些分子结构不太稳定的化学诱变剂进行 ,常见的化学诱变剂包括甲基磺酸乙酯
(EMS)、硫酸二乙酯(DES)和叠氮化钠(NaN3)等 ,其中 EMS 是当前已研究证明使用效果最明显的化学诱变
剂.EMS 主要是通过在鸟嘌呤的 O6 位置进行烷基化 ,然后在 DNA复制过程中 ,烷基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶形
成配对 ,造成G:C 转换成A:T ,从而造成单一碱基对的改变而形成点突变[ 5 , 6] .这些点突变植株可以最大限
度保持原品种的全部优良特性 ,同时增加一些新的性状 ,如抗病性 、耐盐性 、耐寒性等[ 7] .在笔者的诱变试验
中 ,生长状态较好的高羊茅愈伤组织对 EMS溶液的损伤具有更高的抵抗力 ,其半致死体积分数要高于多枝
赖草.经过初步实验得出了 2种草坪草的组织培养方法和 EMS 诱变的半致死体积分数 ,这对进一步利用
EMS诱变这 2种愈伤组织 、获得优良草种具有很好的应用价值.
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Tissue Culture and Callus Induced Mutation of Leymus
multicaulis and Tall Fescue(Festuca arundinacea)
GE Rong-chao1 , 　ZHAO Bao-cun1 , 　BEI Cai-li1 , 　GUO Guang-yan1 , 　ZHAO M ao-lin2
(1.College of Life S cience , Hebei Normal University , Hebei S hijiazhuang　050016 , China;
2.Beijing Research Center of Agri-biotechnology ,Beijing Academy of Agriculture and Forestry S ciences, Beijing　100089 , China)
Abstract:Tissue culture of Leymus multicaul is and tall fescue (Festuca arundinacea)were optimized by
using mature seeds as explants.The callus could keep the abili ty of differentiation after many t imes subculturing.
On the medium of dif ferentiation medium , many seedlings w ere induced from the callus , and grew out a lot of
roots at the same time.Tw o kinds of callus were induced and handled by EMS(ethyl methane sulphonate).The
results showed that the lethality rate of callus w as increasing w hen we increased the concentration of EMS.By
analy zing the results , the median lethal concentration of EM S for the callus of Leymus mul ticaulis and tall fescue
w as 6 mL/L and 8 mL/L respectively.
Key words:Leymus mul ticaul is;tall fescue;tissue culture;callus;EMS mutation
(责任编辑　柴　键)
(上接第 530页)
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1 482-1 488.
The Comparison of the Structure Between Extracellular
Polypeptide of Plant and Human Cytokines
LIU Hui1 , 2 , 　GUO Yi1
(1.College of Life S cience , Hebei Normal University , Hebei S hijiazhuang　050016 , China;
2.School of S cience , Hebei University of Technology , Tianjin　300130 , China)
Abstract:Extracellular polypeptides of plant have been proved to be important signals in signal transduc-
tion.Using tools of bioinformatics , the amino acid sequence of these ex tracellular polypeptides of plant , animal
and microbe were studied.Some interesting results w ere found that there is some common character about ex tra-
cellular polypeptide f rom different species , which is the very correlat ive 3D structure.Using bioinformatics tool ,
the 3D structure of receptor of calmodulin , an impo rtant new extracellular polypeptides of plant w as given.What
w ere found would help to identify new extracellular polypeptides of plant.
Key words:ex tracellular polypeptide;cytokine;st ructure;bioinformat ics
(责任编辑　柴　键)
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