全 文 ：麦类作物学报　 2006, 26( 2): 1～ 5
Journal of T riticeae Crops
　 粘果山羊草 ( Aegilops kotschyi ) puroindoline b
基因的克隆与表达分析
陈明洁 1 , 方 倜2 , 虞斌 1 , 张金锐 1 , 杨广笑 1 , 何光源 1
( 1. 华中科技大学中英 HUST-RRes基因工程和基因组学联合实验室 , 武汉 430074;　 2. 武汉大学生命学院 , 武汉 430072)
摘　要:籽粒硬度是小麦加工品质的重要影响因素。 puroindoline a(Pin a )和 puroindoline b(Pin b )是控制
小麦籽粒硬度的主效基因。 根据已报导的小麦 Pin b基因的保守序列 ,设计合成了一对特异性引物 Fo rB1与
RevB1,对粘果山羊草 (Aegilops kotschy i, CuMk )的三个材料的基因组 DN A和胚乳 cDN A进行 Pin b基因扩增、
克隆、序列测定和表达分析 ,发现了 4个新型 Pin b等位基因 ,基因序列与六倍体小麦的同源基因存在较大的差
异。与软粒小麦品种 Capito le的 Pinb-D 1a相比较 ,其核苷酸同源性分别为 93. 3% 、 94. 6% 、 94. 6% 、 94. 4% ,氨基
酸同源性分别为 90. 5% 、 93. 2% 、 93. 2% 、 92. 6%。 其 ORF长 447 bp,编码 148个氨基酸残基 ,都具有麦类作物
Pin b基因特有的 19个氨基酸的信号肽序列和W PTKWWK的色氨酸结构域。等位基因 Pin b-11-1含有 1个紧
邻色氨酸结构域的突变位点 ( Val66Phe)。 RT-PCR证实了 Pin b基因在籽粒胚乳中的表达。 Southern blo t分析
结果显示 ,三种材料均含有两个拷贝的 Pin b基因。研究结果表明 ,粘果山羊草中包含与小麦差异较大的籽粒硬
度控制基因 ,为栽培小麦的品质改良提供了丰富的基因资源。
关键词: 粘果山羊草 ; puroindoline b; 籽粒硬度 ; 克隆
中图分类号: S 512. 9; S 336　　　　文献标识码: A　　　　文章编号: 1009-1041( 2006) 02-0001-05
Cloning and Expression Analysis of Puroindoline b
Gene in Aegilops kotschyi
CHEN Ming- jie
1
, FANG Ti
2
, YU Bin
1
, ZHANG Jin-rui
1
, YANG Guang-xiao
1
, HE Guang-yuan
1
( 1. China-UK HUST-RRes Gen etic Engin eering and Genomics Join t Laboratory,
Huazhong Univ ersi ty of Science and Tech nology, Wuhan 430074, China;
2. College of Life Science, Wuhan University, Wuhan 430072, China)
Abstract: Grain ha rdness is one o f the main characters that determine the processing properties of
w hea t. Puroindo lines, including puroindoline a ( Pin a ) and puroindoline b ( Pin b ) a re ma jo r genes
controlling grain hardness in wheat. Acco rding to the conserved regions o f Pin b gene reported, one
pai r o f speci fic primers Fo rB1and RevB1were designed and used to ampli fy Pin b f rom genomic DN A of
y oung leaves and developing endo sperm RNA of three accessions of Aegilops kotschyi . Th rough gene
cloning and sequencing , four new alleles of Pin b were characterized. There existed la rg e di fferences
o f sequences o f Pin b betw een Ae. kotschyi and Triticum aestivum . Compared w ith Pinb-D1a f rom T .
aestivum cv. Capitole, the Pin b genes in Ae. kotschyi sha red 93. 3% , 94. 6% , 94. 6% and 94. 4%
homologies in nucleotide sequence and 90. 5% , 93. 2% , 93. 2% and 92. 6% homologies in amino acid
sequence respectiv ely. The ORF o f them was 447 bp, encoding 148 amino acid residues, containing
the signal peptide of 19 amino acid residues and the t ryptophan mo tif of WPT KWWK, which w ere
specific to Pin b gene in cereal crop. Pin b-11-1 contained a mutation adjacent to the t ryptophan mo tif
( Val66Phe) . The expression o f Pin b in g rain endosperm was verified by RT-PCR. Southern blo t
analysis show ed tha t there w ere two copies of the gene in all the th ree accessions. The results showed
that Aegilops provide an ex tensiv e reserv oir of genetic v ariation, w hich is avai lable for incorporation
into cul tiva ted wheat by w ide cro ssing.
Key words: Aegilops kotschy i; Puroindol ine b; Grain ha rdness; Cloning
收稿日期: 2005-06-21　　　　修回日期: 2005-10-01
基金项目:国家“ 973”计划项目 ( 2002CB111302) ;国家自然科学基金项目 ( 30370807)。
作者简介:陈明洁 ( 1968- ) ,女 ,博士 ,讲师 ,主要从事分子生物学研究。
　　小麦籽粒硬度是控制磨粉加工品质 ,决定小
麦用途的一个很重要的性状指标。研究发现籽粒
硬 度 由 小 麦 吲 哚 蛋 白 Puroindoline A 和
Puroindoline B直接控制 ,它们通过影响蛋白质
与淀粉之间的相互作用而控制籽粒硬度。 在六倍
体 面包 小麦 中 , 该类 蛋 白质 的 编码 基 因
puroindol ine a ( Pin a)和 puroindoline b( Pin b)位
于染色体 5D短臂的 Ha ( Hardness)基因复合体
上 [1 ] ,Pin a和 Pin b中任何一个基因发生突变 ,都
会导致籽粒硬度的变化。目前对于 Pin a和 Pin b
基因的分子生物学研究较为深入 ,小麦 Pin a和
Pin b同源性高达 60% ,均不含内含子 ,可读框长
447 bp,编码一类包含 148个氨基酸、对脂类物质
具有较高亲和力的碱性亲水脂膜蛋白 ( pI> 10) ,
其突出特征是具有一个富含色氨酸的类脂结合区
域。 Pin蛋白通过色氨酸结构域和淀粉表面结合 ,
作用于籽粒质地结构 ,从而影响籽粒硬度 [2 ]。在小
麦中已发现 1个 Pin a和6个Pin b基因突变体。这
些突变 ,特别是 Pin b基因色氨酸结构域的突变 ,
会导致籽粒硬度的显著变化 [3 ]。研究表明 , Pin b
基因更易发生突变 ,且突变类型较多 ,是籽粒硬度
的重要控制基因。
籽粒硬度的研究已引起人们的广泛重视 ,目
前研究主要集中在栽培小麦上。在我国 ,栽培小麦
籽粒硬度的研究也已经展开 [4, 5 ]。山羊草是小麦的
近缘野生物种 ,是重要的种质资源 [6 ]。其中粗山羊
草 ( Ae. tauschii )是小麦 D基因组的供体 ,关于其
籽粒硬度相关基因的研究已有报导 [ 7]。除了 D基
因组 ,山羊草还包括 C、M、 S、 U等基因组。本研究
以四倍体粘果山羊草 ( UU SS)为材料 ,对其进行
Pin b基因的克隆、序列测定、胚乳中基因表达分
析、 Southern印迹分析 ,旨在发现新的功能突变
体 ,阐明 Pin b基因对籽粒硬度的影响机制 ,为加
速小麦品质改良进程提供新的思路、方法和手段。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　植物材料与质粒
三种粘果山羊草 011、 038、 039由中国农科院
品种资源所提供。 用作阳性对照的 Pin b质粒
MPL13. 1. 16和用作阴性对照的四倍体小麦由英
国洛桑研究所提供。
1. 1. 2　主要试剂
Pfu DN A聚合酶、 EcoRⅠ 、 EcoRⅤ、 dN T P、
RNase、 100 bp DN A marker购自 promega公司 ;
Super Script III逆转录试剂盒购自 Inv it rog en公
司 ; Southern Blot相关试剂购自 Roche公司 ;基
因序列测定由 La rk Technolog y公司完成。
引物合成由 Sigma公司完成 ,序列如表 1
所示。
表 1　Pin b基因扩增的引物序列
Table 1　 Primer sequence of Pin b gene
PCR amplif ication
引物名称
Primer
引物序列
Primer
s equence( 5-3)
引物长度
Lp
( bp)
起点
Start
方向
Direction
扩增片段长度
L f
( bp)
Fo rB1
ATGAAGACCT TA
T TCCTCCTAGC
23 1
正向
Forw ard
447
RevB1
GAT ATCATCACC
AGT AAT AGCC
22 433
反向
Reverse
1. 2　方法
1. 2. 1　基因组 DNA以及发育中胚乳总 RNA的
提取
基因组 DNA从新鲜植物叶片中用 CT AB法
提取 [8 ]。
发育中胚乳总 RNA的提取采用 CT AB与
PV P,结合高盐的方法提取。选用开花后 3周的发
育中胚乳 1 g ,液氮中彻底磨碎 ,加入 CTAB-PV P
RNA提取液 ,结合 10 mol /L LiCl沉淀过夜 ,得到
高质量的总 RNA[9 ]。
DNA与 RNA的浓度测定用紫外分光光度计
法 ,纯度鉴定用琼脂糖凝胶电泳法。
1. 2. 2　基因克隆与序列测定
cDN A的制备采用 SuperScriptⅢ逆转录试
剂盒 ( Invi trog en) ,将 o lig o ( dT)引物、 dN T P、总
RNA( DN A-free)和 RNase-free H2O混合后 ,于
65℃温育 5 min,冰浴 1 min,然后加入 5× First
st rand buffer、 DTT和 SuperscriptⅢ ,混匀后于
50℃温育 1 h。逆转录反应一结束立即将样品加热
至 70℃ ,保温 15 min使逆转录酶失活 ,置于冰上
迅速冷却。 所得的 cDN A即可用于基因扩增。
以基因组 DNA或 cDN A为模板 ,用特异性引
物扩增 Pin b基因 , PCR扩增采用 50μL反应体
系 ,选用高保真 Pfu DN A聚合酶 ,反应液首先加
热至 95℃并保温 5 min,然后开始循环反应: 95℃
30 s; 58℃ 1 min; 72℃ 2 min; 35个循环后 ,于
72℃继续延伸反应 10 min。 PCR扩增反应时同时
设立对照 ,阳性对照是以 Pin b质粒 M PL13. 1. 16
为模板 ,阴性对照分别用四倍体小麦基因组 DNA
和蒸馏水为模板 ,反应液的配制和反应条件与研
·2· 麦　类　作　物　学　报 26卷
究材料相同。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化、回收
得到产物。将基因与 pGEM-T ea sy载体连接 ,再
经过转化感受态细胞、质粒抽提、质粒鉴定 ,获得
的阳性质粒即可进行序列测定。
1. 2. 3　 Southern blo t分析
基因组 DN A分别用 EcoRⅠ和 EcoRⅤ彻底酶
解 ,经琼脂糖凝胶电泳和 Southern印迹转至尼龙
膜上 ,再经过预杂交、地高辛探针杂交、洗膜、化学
荧光检测 ,进行基因组 DNA中 Pin b基因拷贝数
的分析 [10 ]。 Pin b质粒 MPL13. 1. 16经 EcoRⅠ 酶
解后用作阳性对照。 地高辛探针采用 Pin b质粒
MPL13. 1. 16为模板、 ForB1和 RevB1为引物 ,通
过 PCR扩增的方法合成。
2　结果与分析
2. 1　粘果山羊草基因组 DNA中P in b基因序列
用表 1中的引物对三种粘果山羊草的基因组
DNA进行 PCR扩增 ,电泳结果均显示出大小约
450 bp的特异性扩增条带 ,表明三个材料中都含
有 Pin b基因 (图 1)。对三个材料分别进行 Pin b基
因克隆、测序 ,得到三个各不相同的Pin b基因 ,与
已经报导的软粒小麦 cv . Capi to le的 Pinb-D1a
(编号为 X69914)进行序列比对 ,发现三个 Pin b
基因都长 447 bp,编码 148个氨基酸残基 ,都具有
麦类作物 Pin b基因特有的 19个氨基酸的信号肽
序列和 WPTKWWK的色氨酸结构域。但是它们
的序列与 Pinb-D1a序列存在较大差异 ,都含有多
个突变位点 ,粘果山羊草 011的 Pin b基因中突变
位点多达 14个。粘果山羊草 011、 038、 039的 Pin b
基因与 Pinb-D1a的核苷酸同源性分别为 93. 3% 、
94. 6% 、 94. 4% ,氨基酸同源性分别为 90. 5%、 93.
2% 、 92. 6% ,而且其序列均不同于以前报导的各
种类型的 Pin b等位基因 ,属于新类型的 Pin b等
位基因 (图 2)。
1. 100bp DN A mark er; 2. Pin b质粒阳性对照 ; 3～ 5. 011、 038、
039基因组 DN A的 Pin b基因扩增 ; 6～ 8. 011、 038、 039胚乳
cDN A的 Pin b基因扩增 ; 9.阴性对照 1(水 ) ; 10.阴性对照 2(四
倍体硬粒小麦 )
1. 100bp DNA marker; 2. posi tive cont rol of Pin b plasmid; 3～
5. PCR resul t s of Pin b gen e f rom g DN A of 011, 038, 039; 6～ 8.
PCR result s of Pin b gen e f rom cDNA of 011, 038, 039; 9.
negat ive con t rol of H2O; 10. n egative cont rol of durum w heat
图 1　粘果山羊草 011、 038、 039基因组 DNA
和胚乳 cDNA的P in b基因扩增
Fig. 1　 PCR amplification of P in b gene from
gDNA and cDNA of Ae. kotschy i 011, 038, 039
图 2　粘果山羊草中 4个新类型 Pin b等位基因推导的成熟蛋白序列
Fig. 2　 Deduced mature protein sequences of 4 new Pin b alleles in Ae. kotschyi
2. 2　粘果山羊草胚乳中P in b基因的表达
Puroindoline是一类种籽储藏蛋白 ,开花后
15～ 21 d的发育中胚乳是 Pin基因表达高峰期。
提取胚乳中总 RNA,用同样的引物 ForB1和
RevB1,通过 RT-PCR扩增 ,发现三种粘果山羊草
中 Pin b基因均有表达 (图 1)。
·3·2期 陈明洁等:粘果山羊草 ( Aegilops kotschyi ) puroindoline b基因的克隆与表达分析　　
对表达的 Pin b基因纯化、克隆、测序 ,发现
011中表达的 Pin b基因序列与基因组 Pin b基因
序列不同 , 038和 039中表达的 Pin b基因与基因
组 Pin b基因序列一致。进一步研究发现 ,粘果山
羊草 011基因组中包含两种 Pin b基因 ( Pinb-11-1
和 Pinb-11-2) ,而且均在胚乳中表达。胚乳中发现
的 Pinb-112含有 10个突变位点 ,与 Pinb-D1a的
核苷酸同源性为 94. 6% ,氨基酸同源性为 93. 2% ,
也是一个新型的 Pin b等位基因 (详见图 2)。由此
可以推断 011中至少含有两个拷贝的 Pin b基因 ,
为此有必要对基因组 DNA进行 South er n blo t分
析。
2. 3　 Southern blot分析结果
粘果山羊草三个材料的基因组 DNA分别经
EcoRⅠ 和 EcoRⅤ 彻底酶解之后 ,进行 Southern
blo t分析。以 Pin b质粒为模板 ,采用 PCR扩增的
方法合成地高辛探针 ,检测转移至尼龙膜上的基
因组 DNA,结果表明三种材料均含有 2个拷贝的
Pin b基因 (图 3)。
1. Pin b质粒对照 ; 2～ 4. 经 EcoRⅠ 酶解的 011、 038、 039的基因
组 DN A; 5～ 7. 经 EcoRⅤ酶解的 011、 038、 039的基因组 DN A
1. Posi tiv e con t rol of Pin b plasmid; 2～ 4. g DN A of 011, 038
and 039 digested b y EcoRⅠ ; 5～ 7. gDNA of 011, 038 and 039
diges ted by EcoRⅤ
图 3　粘果山羊草 011、 038、 039的
Pin b基因 Southern blot分析
Fig. 3　 Southern blot analysis of P in b
gene in Ae. kotschyi 011, 038 and 039
3　讨 论
小麦籽粒硬度是小麦的重要目标性状之一 ,
它直接决定小麦的磨粉品质和烘烤品质 ,从而成
为决定小麦品质优劣、贸易价格和最终用途的重
要指标 ,因此小麦籽粒硬度的研究已引起广泛的
重视。 近些年来 ,以近缘野生物种为研究材料 ,开
发新的种质资源 ,已成为目前植物分子育种的一
个重要研究方向。在小麦品质改良方面 ,除了以栽
培小麦为研究材料之外 ,研究者们已经从山羊草
属和提莫菲维小麦中分离得到新的高分子量麦谷
蛋白亚基基因 [11, 12 ] ,粗山羊草 ( Ae. tauschi i )籽粒
硬度的研究也取得一定进展 [7 ] ,这对于应用基因
工程技术进行小麦遗传改良的研究 ,快速改造栽
培小麦品质具有重要意义。
作为控制籽粒硬度的主效基因 ( Ha )之一 ,
Pin b基因对于小麦籽粒硬度的改良至关重要。本
研究以粘果山羊草为研究对象 ,分析其Pin b基因
序列 ,发现四种新型的 Pin b等位基因。为确保序
列测定的准确性 ,实验中采用了高保真的 Pfu
DN A聚合酶 ,以避免由于 PCR扩增时核苷酸的
错误掺入而导致突变的错误结论。对于发现的四
种新型 Pin b等位基因 ,均进行克隆、测序等重复
实验 ,确保实验结果的可靠性。
Pin b基因在籽粒胚乳中的表达研究采用
RT-PCR的方法。在粘果山羊草 011中发现两个
Pin b等位基因 , RT-PCR证实两个基因均在胚
乳中表达 , Southern blo t分析结果显示基因组中
Pin b基因有 2个拷贝 ,与序列测定结果相吻合。
Southern blo t分析也显示粘果山羊草 038、 039都
包含 2个拷贝的 Pin b基因 ,但是基因克隆和测序
结果均只显示一个基因序列 ,是否存在其他类型
的等位基因 ,有待进一步研究。
通过扫描电镜分析粘果山羊草三种材料的籽
粒硬度 ,结果均为软粒 (结果未列出 )。 Morris等
认为 ,小麦中 Pin a和 Pin b基因的突变均导致籽
粒变硬 [3 ]。但是粘果山羊草三种材料中 4个 Pin b
等位基因都含有多个突变位点 ,并未导致籽粒变
硬 ,表明这些突变并未降低 Pin B蛋白与脂类的
结合力 ,甚至可能使之加强。特别是 Pinb-11-1包
括一个紧邻色氨酸结构域的突变位点 ,这可能直
接影响到 Pin B蛋白与脂类的结合 ,从而影响籽
粒硬度 ,因此有必要将其克隆至表达载体上 ,鉴定
其活性与功能。此外研究材料中Pin b基因的多拷
贝现象是否导致较高的 Pin B蛋白表达量 ,从而
影响籽粒硬度 ,也是一个研究重点。
研究还发现 ,作为籽粒中的脂类结合蛋白 ,
Puroindoline不但影响小麦的籽粒硬度 ,而且通
过改变面粉的吸水率而影响面团的流变特性和面
包质地 ,同时还具有抗病菌和啤酒泡沫稳定的功
效 [13～ 15 ]。因此籽粒硬度主效基因的研究对于小麦
籽粒硬度的基因工程改良、小麦食品加工业的发
展以及抗病性的研究都具有重要意义。
通过对粘果山羊草Pin b基因的研究发现了 4
种新型等位基因 ,而且它们都包括 10个或以上突
·4· 麦　类　作　物　学　报 26卷
变位点 ,证实了粘果山羊草确实是一个丰富的品
质改良遗传资源库。目前相关的研究尚不多 ,因此
有必要展开进一步的研究 ,如构建高效植物表达
载体 ,转化小麦进行功能互补实验 ,鉴定其功能 ,
为充分利用野生遗传资源 ,通过基因工程技术快
速改良我国小麦籽粒硬度奠定基础。
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·5·2期 陈明洁等:粘果山羊草 ( Aegilops kotschyi ) puroindoline b基因的克隆与表达分析