全 文 ：浙江农业学报 注 e t a月 g r i e u l t u r a。 h ze ji a心 e。 行 7 ( 一) :一8 2一】8 6 , 1 9 9 5
六棱大麦 “ rF an c e s ” 游离小抱子的分离 、 培养与植株再生
项友斌 刘 静 (浙江省农业科学院生物技术中心 , 杭州 3 , o 川
提 要 : 大麦小抱子单核中期的穗 , 经 4 ℃预处理 4 星期后 , 直接剪成小段 , 捣碎 、 过滤 、 离心
和洗涤后收集小抱子 . 用 M Sm + M al t os e 60 .0 9 / L+ 1 . o m g / L B A P 对小抱子慢速振荡培养 , 7 天
后可观察到小抱子分裂的小细胞团 , 经 3 星期左右培养 , 小细胞团总数达最高 , 其频率为总小抱
子的 .2 36 % 。 这些小细胞团 80 % 发育为类似体细胞胚结构 , 20 % 为典型愈伤组织 , 类似体细胞结
构胚置于 1 / ZM S +1 o m g / L B A p +0 . 2m g / L N A A+0 . 2 m g / L z T 分化培养基上 , 总分化频率为
67 %
, 其中绿苗率为 39 % , 愈伤组织经胚性改造后 , 在 1 / ZM S+ 4 . o m g / L B A P + 。 . s m g / L
N A A扣 .s m g / L IA A 培养基上分化 , 总分化频率为 62 % , 绿苗率为 18 % .
关键词 : 六棱大麦 ; 游离小抱子 ; 细胞团 ; 植株再生
nI 一 ,了z r o e u l t u r e o f is o l a t e d m ie r o s p o r se a n d p la n t r e g e n e r a t io n in ` x 一 r o w b a r le y (H o r de u m v u lg a er L ) e v .
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,
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.
Zm g / L Z T
, r e g e n e r a t e d g r e e n p la n t l e t s ( 1 8% )
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K e v w o r d s : S ix 一 r o w b a r le y (万口 r de u m v 封 gt a r e L . ) ; I s o la t de m i e r o s P o re : C e l ] a g gr e g a t e ; P la n t r e g e n e ar ·
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小抱子培养是利用游离未成熟的花粉进行
培养和植株再生的一项技术 . 在许多植物里
已被较 多 地 应 用 于 产 生 加倍单倍体植
株 巾 , 由于是纯一的单细胞大群体 , 它不
象在花药中培养那样 , 以成千个小抱子集中
收稿日期 : 1 9 94一 7一 2 2
在一花药为一个培养单位 , 并存在着花药壁
组织的干扰 , 因而小抱子培养体系更适于进
行遗传转化 、 离体筛选 , 甚至还有可能用于
远缘种的的单倍体细胞隔合 .
利用游离小抱子进行培养并完成植株再生
已在许多作物上得到实现 , 培养成功的禾谷
类作物包括水稻 、 小麦 、 黑麦 、 大麦及玉米
六棱大麦 ` Fr na ec s’ 游离小抱子的分离 、 培养与植株再生 1 83
等 ( 2· 川 1 , , , ’ 2 ) 。 大麦游离小抱子最早是
用 s a b ar ilg , 其成功培养的关键是花药低温预处理 、 络养基用花药预先条件化 卿 。 以
后 , K o hl o r 等报道了 D i s sa 游离小抱子培
养并再生植株成功 `“ , 。 大麦游离小抱子培
养 获 突破 性进展 的 是 Ol s on 及 H u n et r
等 〔 5 , 7〕 改 良了培养基并以麦芽糖代替蔗糖
以后 , 在 ol s o n 和 H u nt cr 改 良培养基的基
础上 , iZ a n d id n 等用 Igr 卜 通过将花药在
.0 3 M 甘露醇上预培养若干天 ` ’ 2 ) , 并在培
养基中用苯乙酸 〔 ’ 3〕 , 使小抱子诱导反应和
绿苗再生率大大提高 . 然而从 目前所有报道
来看 , 基 因型 一 般都 仅 局 限在 如 I gr i 、
D i s s a 和 s a b a r i li s 等 fL 个品种上 , 且均为二
棱大麦 , 而遗传背景相差较大的六棱大麦还
未见成功的报道 , 此外 , 分离培养都采用预
选挑取花药在液体培养基上预培养 , 然后 ,
由自然裂散或人工分离小抱子的方法 , 本文
报道六棱大麦品种 F ar n ce s 不经花药预培
养 , 小抱子直接分离培养并成功地实现绿色
植株再生 。
材料与方法
(一 ) 小抱子游离与培养
选用六棱大麦品种 F r an ce s . 种子播种在
大田自然条件下 , 抽穗后检查小抱子发育状
况 , 达到单核 中期 , 取穗经表面消毒后在
4℃下低温预处理 4 星期而后将穗从抱叶中
剥 出 , 剪芒 后 , 整 穗 用 10 % 次 氯 酸 钠
(N a CI O ) 浸泡消毒 20 分钟 , 用无菌水 冲
洗三次 , 并用灭菌过的吸水纸吸干 . 然后 ,
将穗剪成小段 , 置于厚壁的试管中 , 在含有
O
.
3M 甘露醇的 C P w 中用玻棒捣碎 , 经两
层 2 50 目尼龙筛网过滤后 , 在 5 0 0印m 下 ,
离心 3一 5 分钟 , 收集小抱子 , 用相 同的溶
液漂洗 、 离心 2一 3 次之后 , 用培养基进行
培养 .
小 抱子 培养 所 用 培养基 的基 本成份 为
M s m 〔 7 )
, 用 6 0 9 / L 麦芽糖替代蔗糖 , 附
加 6一B A P I Om g / L , 过滤灭菌 . 小抱子悬
于培养基 中密度为 1 x l() 5 / ml , 每一培养
皿 ( 6 0 x 1 sm m ) 加小抱子悬浮液 2 m l 。 培
养过程中 , 每隔一天检查小抱子生长发育状
态 , 统计各类型抱子比例和细胞团频率变
化 .
(二 ) 小抱子活力检测
采用荧光染料 F D A 检测培养中小抱子活
力 变 化 情 况 ( F D A 溶 于 丙 酮 中 ,
.2 o m g / ml
. 每隔 1 天 , 取一次培养中的小
抱子悬浮 液进行观察 . 一滴悬浮液加一滴
F D A 溶液 . 过 5 分钟后 , 用荧光显微镜在
紫外光下进行荧光检测 , 小抱子活率以观察
到具荧光的小抱子 占总观察的小抱子数比例
统计 .
(三 ) 植株分化
由小抱子发育形成的胚状体或类似胚状体
的结构 , 生长到一 定时期 (直径 Zm m 左
右 ) , 转移 到 l / Z M S + 1 . o m g / L B A P +
o
,
ZN A A +0
,
Zm g / L z T 的分化培养基 , 使
其成苗 。 非胚状体结 的细胞 团 (愈伤组
织 ) , 先 转 到胚性 化 诱 导培 养 基 , 即为
L 3+ 2
.
o m g / L Z
,
4一 D + 0 . s m g / L I A A ,
经 3 个 星 期 培 养 后 , 转 移 到
1 / ZM S+ 4
.
o m g / L B A P + 0
.
sm g / L N A A
十。 . s m g / L 工A A 的分培养基 .
结果与分析
经低温预处理的大麦幼穗 , 进行捣碎直接
分离所得的小抱子 , 在显微镜下可见到两种
形态 ( 图 1一 A ) . 一类为体积大的小抱子 ,
呈圆形 , 胞质较浓 , 具较大的液泡 , 壁外围
呈现兰色或浅褐色 . 这类细胞经 F D A 染色
一般都呈现较强的荧光 , 即较旺盛的生活
力 。 另一类小抱子体积较小 , 形状各异 , 有
椭圆形 、 耳形 、 梨形等 , 胞壁较厚 , 胞壁外
围不象大的小抱子那样的色泽 , 胞质较空或
质壁分离 . 经 F D A 染色 , 只有少部分具有
活力 .
通过 1一 3 天 的培养 , 几乎所有小体积的
小抱子都死亡 , 表现为质壁严重分离 , 体积

六棱大麦 ` F彻 c se ’ 游离小抱子的分离 、 培养与植株再生 18 5
较原分离时进一步皱缩 . 大体积的小抱子一
部分变成为小体积抱子 , 失去活力 . 另一部
分则在培养过程中逐渐增大体积 , 细胞质开
始 变 浓 , 液泡 逐渐 变 小 直至 消失 ( 图
1一B ) .
在整个培养过程中 , 小抱子活力变化 , 基
本上与大体积的小抱子的比例变化平行 . 即
在培养体系中 , 一般只有那些大体积的小抱
子才具有活力 .
小抱子起初为细胞内分裂 , 分裂的细胞都
被包裹在小抱子壁内 (图 1一 C 、 D ) , 并且
只有那些突破胞壁的才能形成小细胞团 . 因
此在观察过程 中只见到小抱子分裂形成的
-4 10 个细胞的小细胞团 (图 1一E 、 )F , 另
有很少情况可见到胞壁包围的内分裂形成的
多核细胞 . 本试验中 , 在分离培养后第 7 天
见到突破胞壁的小细胞团 , 随后几天小细胞
团急剧增加 , 从第 1 天起增加幅度明显减
慢 , 至第 21 天 , 分裂形成的小细胞团可达
总 小抱子数的 2 . 36 % , 以后 基本上无 变
化 . 全培养过程中有一些活力的小抱子 (一
般为大体积的小抱子 ) 未成为小细胞团 , 甚
至到培养结束 , 在显微镜下可见 , 这一部分
有活力的小抱子有细胞内分裂后 , 但因不能
突破细胞壁而停顿分裂 .
经过 3 至 4 星期的培养 , 可见大量类似体
细胞胚结构 (图 1一G ) , 其总数占小抱子形
成的细胞 团总数的 80 % , 因发育 时期 不
同 , 可观察到各种形状 , 如 , 犁形 、 心形 、
球形等各异的结构 , 有的发育早的因未能及
时挑出进行分化培养 , 而在液体培养基中伸
长为杆状 , 小部分 ( 20 % 以下 ) 则无规则
形状 , 可以认为是典型愈伤组织 .
具有类似体细胞胚的结构转移到分化培养
基进行分化 , 能分化芽 和根 的总 频率为
67 %
, 其中绿苗 (图 1一 H ) 分化频率为
39 %
, 白化苗为 28 % . 无论绿苗还是 白化
苗 , 根均生长 良好 . 小抱子形成的愈伤组织
经胚性化改 良培养后在分化培养基上进行分
化 , 其分化总频率为 62 % , 其中绿苗分化
率为 18 % , 白化苗占大多数 ( 4 % ) . 由这
一分化过程所得到的苗 , 根生长不好 , 有的
虽然分化后长成苗 , 但无根的分化 .
讨论
大麦小抱子的游离大多先取花药再分离 ,
或花药在 o . 3M 的甘露醇上预培养后 , 自然
裂散或提取而收集得到 . 本试验则采用较简
便的直接分离 , 而不经过花药预培养 , 即取
幼穗直接捣碎 、 过滤 、 离心 , 而得到小抱
子 , 小抱子仍具有较强的活力 , 并形成大量
类似体细 胞胚结构 , 且培养再生成功 . 可
见 , 本研究的直接分离和培养在大麦小抱子
培养中有实用性 . 从植株上取得的穗 , 极大
多 数 都 经过 4℃ 低 温 预 处理 , 但 w ie
等 〔’ “ ) 却直接用未经过 4 ℃低温预处理的穗
提取花药在甘露醇里预培养再分离小抱子 ,
取得了再生植株成功 , 本研究在游离小抱子
直接培养过程中 , 游离前的低温预处理较关
键 , 我们 曾预处理 1 至 2 周 , 则根本无任何
小抱子起动分裂 , 预处理 3 周的 , 小抱子最
终分裂频率 只有 0 . 28 % . 本试验 结果表
明 , 预处理 4 周的小抱子形成细胞团的频率
最高 (2 . 36 % ) 。 目前为止 , 报道小抱子培
养 成 功 所 用 的 大 麦 基 因 型 只 有 gI 瓦
S a b a r i l i s
、
D i s s a 等几个二棱大麦品种 , 六
棱大麦一般都认为较难进行离体培养 〔4) .
本研究是在对六棱大麦品种的离体培养能力
差异比较 (本文未述及 ) 的基础上 , 在六棱
大麦品种 F ar n ce s 培养成功 , 这一结果拓宽
了适宜刁、抱子培养的基因型 . 为进一步研究
六棱大麦小抱子培养及其在加倍单倍体育种
和建立 D H 群体进行分子遗传学研究具有
重要意义 , 从本试验的结果来看 , 存在着分
化时白化苗比例相当高问题 , 这对于小抱子
培养在加倍单倍体育种与遗传操作中的应用
是一大障碍 . 如何提高绿苗分化频率有待于
进一步研究 .
参考文献
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〔1 3〕 Z ia u d d in A A M a r s o la i s E S im io n a n d K J K a s h a
19 9 2
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