全 文 ： 辽宁大学学报
自然科学版
第 32卷 第 1期 2005年
JOURNALOFLIAONINGUNIVERSITY
NaturalSciencesEdition
Vol.32 No.1 2005
芸薹属植物游离小孢子培养研究进展
杨淑琴 , ＊娄 虹 ,韩 阳
(辽宁大学 生命科学系 ,辽宁 沈阳 110036)
摘 要:对影响芸薹属植物游离小孢子培养的主要因素———材料的基因型 、亲本植株的生理状态 、小孢子
发育时期 、培养方法和条件及小孢子胚状体发育与植株再生等研究情况做了综合性论述.
关键词:芸薹属植物;游离小孢子培养;研究进展.
中图分类号:S634.103 文献标识码:A 文章编号:1000-5846(2005)01-0091-06
芸薹属植物全世界共计 100多种 ,我国有十
几种.在栽培的该属作物中 ,一部分是重要的蔬
菜 ,一部分是油料作物 ,二者在国民经济中都占有
重要地位 ,因此 ,芸薹属植物在世界范围内受到广
泛重视.
芸薹属植物游离小孢子培养始于 1982年 ,
Lichter[ 1]首次报道在甘蓝型油菜上成功地用游离
小孢子培养方法获得了胚状体 ,并发现小孢子胚
胎及其再生植株的产量远高于花药培养.此后 ,游
离小孢子培养相继在多种作物上获得成功 ,截至
目前 ,在几乎所有芸薹属作物上均有小孢子培养
成功的报道.游离小孢子培养技术已成为芸薹属
植物品种改良的一个重要手段 ,利用这一技术已
创造了几十个油菜新品种 ,在大白菜品种培育中
也得到了应用.
芸薹属植物游离小孢子培养研究成果主要集
中在以下几方面:
1 外植体对小孢子胚胎发生的影响
1.1 基因型的影响
在芸薹属植物游离小孢子培养和花药培养
中 ,不同基因型材料胚状体发生频率显著不同 ,试
材的遗传背景影响成胚率是一种普遍现象.曹鸣
庆等[ 2]报道 ,将 17种基因型大白菜的游离小孢子
进行培养 ,有 16个基因型获得了胚状体 ,反应范
围为 94%;栗根义等[ 3]用 13份大白菜进行游离
小孢子培养 ,其中的 12份得到了小孢子胚 ,反应
范围为 93%;李岩等 [ 4]在小白菜游离小孢子培养
中 , 12个基因型有 9个得到小孢子胚及再生植
株.在对四倍体大白菜植株的游离小孢子培养中
同样证明了基因型对小孢子胚胎发生能力有显著
影响[ 5] .芸薹属其它植物也普遍存在不同亲本类
型的材料.
1.2 亲本植株的生理状态的影响
亲本植株的生理状态对胚状体诱导频率有直
接影响.一般从发育健壮的植株上取花蕾进行培
养效果较好.另外游离小孢子培养还受供体植株
生长环境如温度和光照等影响.
张凤兰[ 6]报道 ,对大白菜 Homei品种 ,在 14
～ 18 h长日照 、15 ～ 20 ℃条件下培养的试材 ,胚
状体发生多 ,植株再生率也高;对大白菜品种 “东
京笋” ,母株在 14 h长日照 , 15 ℃条件下培养 ,对
胚状体发生最为适宜.但是 ,也有相反得报道.
Duijs[ 7]认为供体植株花序形成时的生长环境不
太重要.
1.3 小孢子发育时期的影响
＊ 作者简介:杨淑琴(1951-),女 ,辽宁丹东市人 ,辽宁大学实验师 ,从事生物化学研究.
收稿日期:2004-10-12
选择合适发育时期的花粉 ,是提高花粉植株
诱导频率的重要因素.适合芸薹属植物游离小孢
子培养的花粉发育时期一般为单核期至二核早
期 ,具体时期因植物种类而有所不同 ,多数在单核
中晚期 ,个别植物如甘蓝 ,用成熟花粉进行培养 ,
也能取得理想的结果.大白菜胚胎发生的激发启
动 ,大致发生在单核中期至单核靠边期这一暂短
的发育过程中.李岩等 [ 4]也报道小白菜单核中期
至单核靠边期的小孢子易于诱导胚胎发生.与二
倍体植株相似 ,四倍体大白菜的小孢子发育时期
对胚胎产率也有显著影响 ,单核靠边期小孢子占
多数时胚胎产量最高[ 8] .也有双核期是较适合时
期的报道 ,如绿菜花中 , “bc-0” 、“Galaxy”和 “bc
-4”品系在双核期小孢子比例分别为 15.38%、
13.60%和 50.70%时 , 小孢子胚发生频率最
高 [ 9] .
一般情况下花粉培养和花药培养适宜的取材
时间为盛花期.随着供体植株的老化 ,花粉对离体
培养的反应能力下降 [ 10] .
小孢子发育进程与花蕾性状密切相关 ,许多
研究者在实验过程中发现 ,花蕾形态指标如:花蕾
长度 、花药长度及 “花瓣长 /花药长度比 ”与小孢
子发育密切相关 ,并以花蕾形态指标作为选择适
宜游离小孢子培养群体的标准.但是 ,不同基因型
材料 、以及在不同条件下栽培 ,适宜的形态指标有
所不同.曹鸣庆 [ 2]发现 , CC11基因型大白菜花蕾
长 2.0 ～ 2.5mm时 ,小孢子正处于单核中期至单
核靠边期 ,小孢子胚产量最高;蕾长 2.6 ～ 3.0mm
时 , 9.2%的小孢子处于单核中期 , 70%的小孢子
处于单核靠边期 ,小孢子胚产量次之;蕾长小于
2.0mm或大于 3.6 mm时 ,均不能诱导小孢子
胚.
理想的胚状体实验体系 ,要尽可能做到使小
孢子发育高度同步化.人们为了获得同步分裂的
细胞群体 ,曾采用选择同步化和诱导同步化方法.
但据以往报道 ,这些方法在应用时都还不够理想.
在芸薹属植物游离小孢子培养中 ,有的学者还提
出了一种诱导小孢子发育同步化的方法.即:每天
摘除即将开放的花朵 ,使营养物质集中在蕾的生
长上 ,从而导致供体植株花蕾较大 ,小孢子发育同
步化程度提高.
2 培养方法和条件对小孢子胚发生
的影响
2.1 花蕾预培养
在分离小孢子之前 ,对花蕾进行预培养 ,可提
高小孢子成胚效率.芸薹属植物主要采用低温预
培养方法 ,即将选取的花序浸在 MS液体培养基
或水中 , 4 ℃ ～ 7℃处理若干天 ,然后再分离小孢
子进行培养.王亦菲[ 11]报道 ,油菜以 4 ℃低温预
处理 1 ℃ ～ 2 d对脱分化启动最为有利.余凤
群 [ 12]报道 ,甘蓝型油菜 6℃ ～ 9 ℃处理 1d最好.
低温预培养的方法在油菜中被普遍采用 ,在其他
芸薹属植物上未见报道.
2.2 花粉预处理
为了提高花粉培养的效率 ,通常对试验材料
进行预处理.预处理操作包括:离心 、低温 、高温 、
射线 、甘露醇预处理和预培养等方式 ,其目的是改
变细胞生理状态 、分裂方式和发育途径.
自从 Keler[ 13]在甘蓝型油菜花粉培养中 ,首
次用高温处理提高花粉胚的诱导频率获得成功以
后 ,该方法被广泛用于芸薹属植物的花药培养和
游离小孢子培养.高温预处理在白菜游离小孢子
培养中也收到了良好的效果.实验证明 ,接种后
33℃ ～ 35 ℃,暗培养 24 h,对胚状体诱导的效果
最为理想.周伟军 [ 14]对油菜游离小孢子分别进行
32℃和 30℃热击暗培养 3 d和 7 d后转入常温
(24℃)下培养 ,其胚胎发生好 ,产胚率高 ,获得了
大量正常胚体.甘蓝在 30℃ ～ 35℃下预培养 1 ～
2 d,可明显提高胚状体诱导频率;青花菜以 32.5
℃热击 1 d效果最好.
2.3 小孢子分离方法
小孢子培养为游离细胞培养.小孢子位于花
药内 ,花药内包含有成千上万个单倍体小孢子或
花粉.据报道 ,油菜每个花药有 17, 000个小孢子.
为了分离小孢子 ,先从大田或温室选取处于合适
发育阶段的花序和花蕾 ,进行表面消毒 ,然后在无
菌条件下从花药中分离小孢子.分离小孢子的方
法可归纳为挤压法 、散落法和器械法 3种.
①挤压法 将无菌花序 、花蕾或花药放入研
钵或烧杯中 ,加入少量分离溶液 ,然后用玻璃棒或
注射器的内管轻轻挤压材料 ,使小孢子从花药中
92 辽宁大学学报 自然科学版 2005年
游离到溶液中.通过不锈钢网或尼龙网筛去比小
孢子大的组织碎片 ,收集小孢子悬浮物 ,再通过低
速离心使小孢子沉淀.弃上清液后 ,加分离溶液反
复清洗 2次 ～ 3次 ,最后用培养液清洗 1次 ,即可
制备成小孢子悬浮液 ,转入培养器进行培养.
②散落法 在进行花药的液体漂浮培养时 ,
花药会自行开裂 ,小孢子从花药裂口处散落到培
养基中.利用这种方法收集小孢子叫散落法.
③器械法 为了提高分离效果 ,一些研究者
探索用机器分离小孢子.常用的机器有两种 ,一种
是小型搅拌器 ,一种叫超速旋切机.器械法的操作
简便 ,植物花序 、花蕾或花药在容器内高速旋转刀
具的转动下破碎并高速运动 ,小孢子便被游离到
溶液中.
用以上 3种方法分离的小孢子还可以用密度
梯度离心纯化.一般使用 percol配制成不同的梯
度溶液 ,先将高密度溶液放入离心管底部 ,然后小
心依次加入低密度溶液 ,最后将待纯化的小孢子
悬浮物加在最上部 ,在较高的速度下 (200 ～ 400
g)离心 5 min.结果不同时期的小孢子和细胞碎
片会分布在不同的梯度界面上.在适合的界面上
吸取最适发育时期的小孢子 ,加培养基再清洗和
离心 2次即可用于培养.
目前绝大多数研究者采用挤压法.
2.4 培养方法
芸薹属植物游离小孢子培养的经典方法是小
孢子游离后 ,经 30℃ ～ 35 ℃度热激处理暗培养 1
～ 2d,再转入 25 ℃常温暗培养 ,普遍采用液体浅
层静止培养法.
王亦菲 [ 11]报道 ,液体静置培养两周后 ,转入
450r/min摇床继续培养 ,取得了较好的效果.申
书兴[ 8]发现 ,摇床培养对大白菜小孢子胚的发生
及子叶胚率的提高均有良好的促进作用.
Huang等 [ 15]报道 ,加液培养能提高胚状体诱
导频率.其原因之一是加液培养能够稀释细胞毒
素 ,同时还能补充营养物质.Kot等 [ 16]认为 ,在小
孢子培养过程中 ,处于不适培养时期的小孢子向
培养基中释放有毒物质 ,这些有毒物质大大降低
了小孢子启动分裂的能力 ,还会干扰心形胚的发
育.故认为在培养过程中 ,应每 3 d更换一次培养
基.
2.5 培养基
芸薹属植物游离小孢子培养中 ,最常用的基
本培养基是 NLN培养基.与 MS、B5等植物组织
培养中常用培养基相比较 , NLN的主要特点是大
量元素含量较低.余凤群 [ 12] 比较了 MS、B5、1/2
MS和 1 /2B5等培养基对甘蓝型油菜游离小孢子
培养的影响 ,发现在 MS、B5培养基上未产生胚状
体 ,在 1 /2MS、1/2B5上形成少量胚状体 ,在 NLN
上形成大量胚状体 ,因此 ,认为小孢子胚易于发生
在离子浓度低的培养基中.Keler[ 17]报道 ,甘蓝型
油菜在 NLN大量元素降至 1/2时 ,提高了胚状体
产量 ,而在 MS、B5培养基上未获小孢子胚.
其它添加物 ,如 L-脯氨酸 200mg/L和谷氨
酰胺 800 mg/L对胚状体的诱导有促进作用.L-
脯氨酸能加速小孢子分裂 ,促进胚状体发生 ,而谷
氨酰胺对胚状体正常发育有利.两者配合 ,能降低
畸型胚的发生 ,从而提高再生植株率 [ 11] .
许多学者研究了植物激素对芸薹属植物小孢
子胚发生 、发育的影响 ,试验结果不一.许艳辉 [ 18]
报道 , 6-BA对大白菜小孢子胚胎发生有一定的
促进作用 ,最佳浓度为 0.2 mg/L,但是 ,对难成胚
的基因型 , 6-BA作用不大.李岩 [ 4]发现 ,培养基
中加少量激素(NAA0.5 mg/L, BA0.05 mg/L)有
利于小白菜游离小孢子胚胎发生 ,其胚产量明显
高于不加外源生长物质的对照.Sato[ 19]认为 ,不含
激素的培养基与加有 NAA0.5 mg/L+ 6-BA
0.05mg/L的培养基对胚状体诱导效果相同.许
多研究者也使用了不加外源激素的培养基.四倍
体白菜的小孢子培养发现 ,在 6-BA0.2mg/L水
平下 , NAA为 0 ～ 1.0 mg/L时 ,小孢子胚有较高
的发生频率;NAA高于 2.0 mg/L时出现抑制作
用.在 NAA0.5 mg/L水平下 , 6-BA为 0.05 ～ 0.
2 mg/L时小孢子胚产率高;6-BA超过 0.4mg/L
时出现抑制作用.王亦菲 [ 11]报道 ,在诱导培养基
中单独使用或配合使用 0 ～ 2 mg/L的 6 -BA、
KT、2, 4 -D, GA3,其作用不大 ,有些甚至抑制胚
胎发生.余凤群[ 12]提出 ,激素可能不是甘蓝型油
菜形成小孢子胚的必要条件.
芸薹属植物游离小孢子培养通常以蔗糖为碳
源和渗透压稳定剂 ,糖浓度对小孢子的活力以及
胚状体发生有重要影响。实验中采用的蔗糖浓度
93 第 1期 杨淑琴 , 等:芸薹属植物游离小孢子培养研究进展
一般为 100 ～ 160 g· L-1%, 牛应泽[ 20] 曾采用
10%log· L-1 、130 g· L-1%和 160 g· L-1 ～ 200
g· L-1%三种蔗糖浓度 ,对油菜小孢子胚胎发生
能力进行研究 ,结果表明 ,含 130 g· L-1蔗糖的
NLN培养基胚胎发生率最高.陈军 [ 21]试验得到同
样的结论.
另外 ,有些学者认为 ,高浓度的蔗糖可保持小
孢子活力 ,而低浓度蔗糖能促进小孢子分裂及进
一步发育.在芜菁培养中 ,先用高糖培养基(含蔗
糖 160g· L-1 ～ 200 g·L-1)培养 2 ～ 3d,而后换
成蔗糖 10% ～ 13%的培养基 , 可使培养效率提
高 [ 21] .
在培养基成份对小孢子胚诱导的研究方面 ,
关于活性炭的效果报道较多 ,普遍的观点是 ,活性
炭能提高小孢子产量 ,并且还能提高胚状体发育
的同步性 ,在油菜 、绿菜花以及其他科属的烟草 、
辣椒 、玉米等植物的培养中都有类似报道.活性炭
对游离小孢子培养胚状体发生有很好的促进作
用 ,其原理被认为是活性炭吸附了培养基中由培
养细胞释放的有毒物质.在白菜小孢子培养过程
中 ,无胚胎发生能力的小孢子能释放出一些有毒
物质 ,可能会抑制具有胚胎发生能力小孢子的胚
胎发生及胚状体的正常发育 ,而活性炭可以吸附
这些有毒物质.
有报道证明 ,活性炭并非对所有材料的游离
小孢子培养都有作用 ,个别材料无论如何都得不
到胚或每次只得一至数个不能正常发育的胚[ 22] .
在花椰菜上 ,部分基因型加入活性炭后 ,胚胎发生
率反而降低.
Lichter[ 23]指出 ,活性炭不仅可以吸收培养基
中的有毒物质 ,而且可以吸收一些必要元素和植
物激素 ,如 NAA、KT、Fe盐鳌合物等 ,因此 ,活性
炭浓度不宜太高 ,否则会起负作用.在配制活性炭
时 ,最好加少量(0.5%左右)的琼脂糖.因为无琼
脂糖的游离活性炭吸附到小孢子上 ,反而会阻止
胚状体的发生.关于培养基中其它成份对白菜小
孢子培养的影响 ,研究报道较少.
3 小孢子胚状体发育与植株再生研
究
3.1 胚状体发育及植株再生
一般情况下 ,在培养 1 ～ 3 d后小孢子开始第
一次细胞分裂;7 ～ 11 d可形成肉眼可见的球形
胚;15 d左右可形成心形 、鱼雷及子叶形胚.一般
情况下 ,胚状体的发育并不同步 ,原胚 、球形胚 、心
形胚 、鱼雷形胚及子叶形胚并存 ,同时还有许多畸
形胚.转移到 B5或 MS琼脂培养基上 ,部分胚状
体成苗.成苗频率取决于胚状体类型.通常子叶形
胚 、心形胚 、鱼雷胚属于正常胚 ,两极性发育好 ,一
端具有类似下胚轴结构 ,另一端则类似芽端 ,有不
完全的二片子叶结构 ,再生频率高.球形胚由于两
极性发育较差 ,难以再生植株.萌发培养基(或叫
成苗培养基)通常是不加或只加少量激素的 MS、
B5固体培养基 ,培养基中添加 20 g· L-1 ～ 30 g
· L-1蔗糖.
大白菜的成熟小孢子胚在 NLN-13液体培
养基中滞留时间的长短对以后的胚胎培养影响甚
大 [ 24] ,在液体培养基中培养 28 d和 35 d的胚最
终成苗率大大低于培养 14 d和 21 d胚的最终成
苗率.
四倍体材料的小孢子培养发现 ,培养基水分
状况与成苗率有关 [ 5] .研究者认为小孢子胚成熟
后需要较干燥的生长环境 ,及时将成熟的子叶期
胚转入相对干燥的培养环境 ,对于植株再生有利.
适宜大白菜胚状体成苗的培养基是 B5附加 3%
蔗糖和 1.2%琼脂 [ 24] .
对胚状体的低温诱导是一种有效的提高植株
再生能力的方法.周伟军报道 [ 14] ,甘蓝型油菜胚
状体转入固体培养基后 ,先进行 10d低温诱导(2
℃),再在常温 (24 ℃)光下培养就能很好地萌
发 ,并直接快速地再生成苗.
3.2 小孢子植株的倍性及其染色体加倍技术
由小孢子培养所得到的单倍体植株只有通过
染色体加倍成为二倍体 ,才能用于育种实践.
研究发现 ,由游离小孢子培养所获得的植株
并非完全是单倍体 ,通常是由单倍体 、二倍体及多
倍体构成的混合群体.自然加倍的频率在不同植
物中有较大的差异.张凤兰 [ 25]以 10个品种及组
合的大白菜为材料 ,对小孢子植株的倍性进行了
鉴定 ,发现其自然加倍率很高 ,多数品种在 70%
以上 ,认为大白菜由小孢子培养得到的植株无需
人工加倍 ,有自然加倍成为二倍体的特点.而油菜
94 辽宁大学学报 自然科学版 2005年
小孢子培养获得的植株 70% ～ 90%为单倍体 ,自
然加倍率仅 10% ～ 30%.
染色体人工加倍主要是用.秋水仙碱处理单
倍体植株使之加倍.据报道 [ 26] ,芸薹属植物小孢
子胚再生的单倍体植株 ,染色体人工加倍方法主
要有以下几种:
①把带有秋水仙碱溶液的脱脂棉盖在植株的
顶芽 、腋芽上.
②初花期把单倍体植株从土壤中取出 ,洗净
根部泥土后用 0.2% ～ 0.4%秋水仙碱溶液泡根
1.5 ～ 8 h,再移栽田间.
③3 ～ 4叶龄的试管苗 ,在含 50 mg/L秋水仙
碱的 B5液体培养基中无菌培养 4 ～ 8 d,转到无
秋水仙碱的 B5培养基中培养 7 ～ 14 d,然后移栽
到土壤中.
④ 15 ～ 20日龄的胚状体用 0.1%或 0.2%秋
水仙碱处理 8 ～ 20 h.
⑤离体小孢子用秋水仙碱或抗微管的除草剂
处理并培养成植株 , 这种方法加倍率较高 , 达
44% ～ 94%,而且加倍植株极少是可育和不育花
的嵌合体.
4 问题与展望
经过 20多年的研究探索 ,植物游离小孢子培
养技术不断改进 ,在某些物种上 (如:甘蓝型油
菜)已经形成了较为完善的技术体系.但是 ,在理
论和应用上仍存在许多问题 ,多数物种还没有建
立起高效的小孢子培养技术体系.鉴于小孢子培
养在植物育种上的特殊意义 ,今后应继续加强这
方面的理论和技术研究 ,建立稳定 、高效的获得纯
合二倍体游离小孢子植株的技术体系 ,使其真正
成为应用于植物品种改良最成功的现代生物技
术.游离小孢子培养技术与传统育种技术相结合 ,
必将加快植物新品种的选育进程 ,提高育种效率.
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ProgressofStudyonIsolatedMicrosporeCultureinBrassica
YANGShu-qin, LOUHong, HANYang
(DepartmentofLifeScience, LiaoningUniversity, Shenyang110036)
Abstract: History, efectfactorsandculturetechnologyofisolatedmicrosporecultureinBrassicawerere-
viewed.Thequestionandresearchorientationinthefuturewereindicated.
Keywords: Brassica;isolatedmicrosporeculture;progress
(责任编辑 崔久满)
96 辽宁大学学报 自然科学版 2005年