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Central South Pharmacy. June 2016, Vol. 14 No.6　中南药学 2016年 6月 第 14卷 第 6期
驱虫斑鸠菊粗提物促进人皮肤组织黑色素合成的研究
蔡洁1，2，吴华丽1，2，吕金鹏1，2，尚靖1，2*（1. 中国药科大学江苏省中药评价与转化重点实验室，南京　211198；2.
中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，南京　210009）
摘要：目的　建立组织培养人皮肤模型并探讨驱虫斑鸠菊提取物 [Vernonia anthelmintica（L.）extract，
AVE]在该模型下对人皮肤组织黑色素合成功能的影响及可能的作用机制。方法　采用 HE染色法观察
不同培养条件对组织培养的人皮肤形态的影响，HE染色法和乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测不同浓度
AVE对人皮肤组织毒性的影响，NaOH裂解法、L-Dopa氧化法检测 AVE对人皮肤组织黑色素含量及酪
氨酸酶活力的影响，免疫组化法和Western blot法观察 AVE对组织培养的人皮肤 S100和黑色素合成关
键蛋白表达的影响。结果　以William’s E培养基为基础培养的人皮肤组织结构完整，形态良好。在
组织培养的人皮肤模型中，AVE剂量依赖性的促进黑色素合成和酪氨酸酶活性。AVE能够上调黑色素
合成关键调控因子MITF及相关蛋白（TYR、TRP-1和 TRP-2）与 S100的表达。结论　AVE通过上调
MITF及其调控的黑色素合成相关蛋白表达与黑色素细胞的增殖促进人皮肤组织的黑色素生成。
关键词：驱虫斑鸠菊提取物；人皮肤组织培养模型；黑色素合成；酪氨酸酶
中图分类号：R29, R285　　　　文献标识码：A　　　　文章编号：1672-2981(2016)06-0590-05
doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2016.06.006
Extract from Vernonia anthelmintica (L.) willd seed enhances melanin
synthesis in organ culture human skin
CAI Jie1, 2, WU Hua-li1, 2, LV Jin-peng1, 2, SHANG Jing1, 2* (1. Jiangsu Key Laboratory of TCM Evaluation and
Translational Research, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198; 2. State Key Laboratory of Natural
Medicine, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009)
Abstract: Objective To establish the human skin organ culture model and to investigate the effect of Vernonia
anthelmintica (L.) extract (AVE) on the melanogenesis of human skin and its potential mechanism. Methods
H&E staining was performed to screen the culture conditions for human skin. H&E staining and lactate dehydro-
genase (LDH) activity were used to observe the toxicity on organ culture of human skin under different concen-
trations of AVE. NaOH dissolution and L-Dopa oxidation were used to detect the melanin content and tyrosinase
activity. The melanogenic proteins (TYR, TRP-1, TRP-2 and MITF) and S100 were analyzed by Western blot
and immunohistochemical method. Results The skin structure remained complete and integrated after organ
culture with William’s E medium. Different concentrations of AVE had no toxicity on the organ cultured human
skin; AVE increased the melanin content and tyrosinase activity in a dose-dependent manner. AVE up-regulated
the expression of S100 and melanogenic proteins (TYR, TRP-1, TRP-2 and MITF). Conclusion AVE may pro-
mote melanogesnesis in organ cultured hum an skin by increasing the tyrosinase activity, stimulating melanocyte
proliferation and activating the expression of melanogenic proteins.
Key words: Vernonia anthelmintica (L.) willd extract; human skin organ culture; melanogenesis; tyrosinase
基金项目：“十一五重大新药创制”（No. 2009ZX09102-119）。
作 者简介：蔡洁，女，硕士研究生，主要从事皮肤药理方面的研究，Tel：15298362918，E-mail：caijie09@yeah.net　*通讯作者：尚靖，
女，教授，博士研究生导师，主要从事皮肤药理及糖脂代谢紊乱方面的研究，Tel：（025）83271142，E-mail：shangjing21cn@163.com
　　白癜风是一种获得性进行性的色素脱失性皮肤
病，以局部表皮功能性黑色素细胞缺失为主要特征 [1]。
位于表皮基底层的黑色素细胞可以合成黑色素，通过
树突将黑色素颗粒输送到与其相联系的角质形成细胞
使皮肤维持正常肤色，免受紫外线及光致癌因子损
害 [2-3]。黑色素合成是一个发生在黑色素细胞内受到
多种因子调节的复杂反应 [4-5]，酪氨酸酶（tyrosinase，
TYR）是黑色素合成的限速酶，其活力受到酪氨酸酶
家族相关蛋白1（TYR-related protein 1，TRP-1）和相关
蛋白2（TYR-related protein 2，TRP-2）的调控，小眼畸
形相关转录因子（microphtalmia-associated transcription
factor，MITF）能够调控 TYR、TRP-1、TRP-2的基因
转录，是 黑色素合成中的关键调节因子 [6-7]。
　　驱虫斑鸠菊 [Vernonia anthelmintica（L.）willd]为
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菊科斑鸠菊属一年生草本植物，是维吾尔医的常用药
材，治疗白癜风有突出的疗效 [8]。本文旨在探讨驱虫
斑鸠菊提取物（AVE）对组织培养的人皮肤黑色素合
成功能的影响及可能机制。
1　材料
1.1　试药
　　驱虫斑鸠菊粗体物（南京瑞菁医药科技有限责任
公司）；α-黑色素细胞刺激素（α-MSH）（Sigma，美
国）；MCDB153培养基、胰岛素、氢化可的松、L-
谷氨酰胺、L-Dopa（Sigma，美国）；DMEM培养基、
William’s E培养基（Gibco，美国）；乳酸脱氢酶细胞
毒性检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、青霉素
钠、链霉素钠（碧云天生物技术研究所）；总蛋白抽
提试剂盒（普利莱基因技术有限公司）；β-actin、Tyr、
MITF、TRP-1、TRP-2（Abcam，英国）；S100（福州
迈新生物技术开发有限公司）；辣根过氧化物酶标记
抗兔 IgG、辣根过氧化物酶标记抗鼠 IgG（Sigma，美
国）；ECL发光液体（Millipore，美国）；其他试剂均
为分析纯（南京化学试剂有限公司）。
1.2　仪器
　　超净工作台（艾克林净化设备有限公司，苏州）；
BB16型二氧化碳培养箱（Hearous，德国）；CKX41倒
置显微镜（OLYMPUS，日本）；BS210 S十万分之一电
子 天平（Sartorius，德国）；Synergy HT多功能酶标仪
（BioTek，美国）；Milli-Q自动纯水仪（Millipore，美
国）；垂直蛋白电泳仪、湿 转转模仪（Bio-Bad，美国）；
Tanon-5200全自动化学发光 /荧光图像分析系统（天能，
上海）。
1.3　样本
　　皮肤组织来源：6～ 14岁进行包皮环割术正常儿
童包皮（南京儿童医院泌尿科提供）。
2　方法
2.1　人皮肤组织培养模型建立
　　将皮肤样本在预冷的 PBS（含青霉素钠 500 IU·
mL－ 1，链霉素钠 500 μg·mL－ 1）清洗多次，至无血液
流出；剔除脂肪及血管；将组织剪成 3 mm×3 mm大
小，转移至 24孔板，每孔分别为 0.5 mL DMEM培养基
（含青霉素钠 100 IU·mL－ 1，链霉素钠 100 μg·mL－ 1）、
0.5 mL MCDB153培养基（含青霉素钠 100 IU·mL－ 1，
链霉素钠 100 μg·mL－ 1，霍乱毒素 0.2 μg·mL－ 1，
IBMX100 μmol·mL－ 1，氢化可的松 0.5 μg·mL－ 1，胰
岛素 5 μg·mL－ 1）、0.5 mL William’s E培养基（含青霉
素钠 100 IU·mL－ 1，链霉素钠 100 μg·mL－ 1，氢化可
的松 10 ng·mL－ 1，胰岛素 10 μg·mL－ 1，L-谷氨酰胺
2 mmol·L－ 1）。3种培养条件的皮肤组织样本均置于
5%CO2，37℃孵育箱中培养 24、48 h。
2.2　人皮肤组织分组及给药
　　待皮肤样本贴于板底即可进行实验。实验分组：
对照组，α-MSH组（300 nmol·L－ 1），AVE低（20 μg·
mL－ 1）、中（40 μg·mL－ 1）、高（80 μg·mL－ 1）剂量组。
完全培养 48 h。
2.3　HE染色法观察人皮肤组织形态
　　样本用 PBS洗 3次，10%福尔马林固定、浓度递
增的乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋，冷却后 4 μm
切片、脱蜡染色、脱水透明、封固。显微镜下观察、
拍照。
2.4　LDH释放法检测 AVE对人皮肤组织的毒性
　　收集培养 48 h后的培养基，按照乳酸脱氢酶细胞
毒性检测试剂盒说明测定上清液中的 LDH活性。在
490 nm处测定吸光度，采用 600 nm或大于 600 nm的
任一波长作为参考波长进行双波长测定。
2.5　NaOH裂解法检测人皮肤组织黑色素含量
　　按文献 [9]方法测定黑色素含量。称量样本于冰上
剪碎。每 80～ 100 mg组织加入 1 mL总蛋白抽提裂
解液进行匀浆，加入 2倍体积的抽提液混匀。4℃，
10 000 g·min－ 1离心 10 min。溶液分上中下 3层，
上层弃去，中间层蛋白膜用于蛋白定量（BCA法）。
下层黑色素沉淀加入 350 μL 1 mol·L－ 1 NaOH（含
10%DMSO），置于 80℃恒温金属浴中裂解 2 h，于
405 nm处测定 OD值，计算黑色素相对含量。
2.6　L-Dopa氧化法检测人皮肤组织酪氨酸酶活力
　　称量样本于冰上剪碎。每 80～ 100 mg组织加入
1 mL总蛋白抽提裂解液进行匀浆，加入 2倍体积的抽
提液混匀，4℃，10 000 g·min－ 1离心 10 min。溶液
分上中下 3层，取中间层蛋白膜用于蛋白定量（BCA
法）。计算含 10 μg总蛋白的裂解液体积，用 PBS（0.1
mol·L－ 1，pH＝ 6.8）定量至 100 μL，再加入 100 μL
0.01% L-Dopa，37℃避光孵育 30 min，475 nm处测定
OD值。
2.7　免疫组化观察人皮肤组织 S100蛋白的表达
　　按照“2.3”项下方法制作蜡块，PBS清洗除去包
埋剂、3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶的活性、
PBS洗 3次、加入封闭液室温孵育 1 h、适当稀释的
S100一抗 4℃孵育过夜、PBS洗 3次、二抗常温孵育
1 h、清洗、DAB显色、苏木素复染、封片。显微镜下
观察、拍照。
2.8　Western blot 法检测人皮肤组织黑色素相关蛋白的
表达
　　提取总蛋白，BCA法蛋白浓度定量，经 SDS-
PAGE电泳分离蛋白，湿转法恒流 320 mA将蛋白转移
到 PVDF膜上，2.5%牛血清白蛋白室温封闭 1 h，一
抗在 4℃孵育过夜，TBST洗 3次，相应的二抗在室温
孵育 1 h，TBST洗 3次，ECL化学发光法显影，天能
成像系统拍照，结果分析采用吸收度表示，以目标条
带与内参的比值来表示。
2.9　数据统计
　　所有实验结果采用 Graph Pad Prism 5统计软件分
析，数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较
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采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），P＜ 0.05
为差异具有统计学意义。
3　结果
3.1　3种培养基对组织培养的人皮肤形态的影响
　　对于人皮肤组织培养模型的建立，本研究选择 3
种常见的培养基培养 24、48 h用以观察不同培养条
件对人皮肤组织形态的影响。3种培养基所培养 24
h 的皮肤组织为复层鳞状上皮，由基底层至表面可分
为基底细胞层，棘细胞层和颗粒细胞层，表面可见
角化，基底层细胞为柱状，有棕褐色色素；其下为
真皮，未见皮肤附属器官，符合正常人皮肤结构形
态。而在培养 48 h 时，3种培养基所培养的人皮肤
组织结构发生不同变化。DMEM 所培养的皮肤组织
结构可明显看出表皮排列轻度紊乱；MCDB153 所培
养的皮肤组织结构表皮各层次尚可见，表皮排列轻度
或中度紊乱，表皮和真皮分离，表皮细胞中度坏死；
William’s E 培养基所培养的人皮肤组织结构形态保
持良好，皮肤各层结构清楚，表皮排列较整齐。因
此，William’s E 培养基可以作为人皮肤组织培养的
合适条件。
图 1　不同培养基培养 24 h和 48 h对人皮肤组织结构的影响
Fig 1　Effect of 3 medium on the structure of human skin organ culture
model for 24 h and 48 h
注（Note）：a～ f：100×，g～ h：200×。
3.2　AVE对组织培养的人皮肤形态结构的影响
　　与对照组相比，不同浓度的 AVE作用 48 h的人
皮肤组织表皮、真皮结构完整，各层结构保持良好。
其中，表皮主要细胞角质细胞排列紧密，从外向里可
见细胞形态的变化，与正常人皮肤结构相一致（见图
2A）。与对照组相比，不同浓度的 AVE作用 48 h人皮
肤组织释放的 LDH明显降低（P＜ 0.001）（见图 2B）。
结果显示，不同浓度 AVE对人皮肤组织结构没有造成
显著影响，组织培养中细胞活性保持较好，并为后续
实验提供剂量依据。
图 2　AVE作用 48 h对人皮肤组织形态结构的影响
Fig 2　Effect of AVE on the structure of organ culture human skin model
for 48 h
注：A. H&E染色法（a：100×，b：200×）；B. LDH 释放法
（x±s，n＝ 3）。与对照组相比较，***P＜ 0.001。
Note：A. H& E staining（a：100×，b：200×）；B. LDH
activity released into culture medium. （x±s，n＝ 3）. Compared with
the control group，***P＜ 0.001.
3.3　AVE对组织培养的人皮肤黑色素合成及酪氨酸酶
活性的影响
　　与对照组相比，不同浓度 AVE作用 48 h于人皮
肤组织能够促进黑色素合成与酪氨酸酶活力（见图 3）。
其中，AVE 80 μg·mL－ 1及α-MSH 300 nmol·L－ 1 显
著促进人皮肤组织的黑色素合成与酪氨酸酶活力（P
＜ 0.05）。
图 3　AVE作用 48 h对人皮肤组织黑色素含量与酪氨酸酶活力的影响
Fig 3　Effect of AVE on melanin synthesis and tyrosinase activity of
organ culture human skin model for 48 h
注：A. NaOH裂解法测定黑色素含量；B. L-Dopa氧化法测定
酪氨酸酶活力（x±s，n＝ 3）；与对照组相比较，*P＜ 0.05。
Note：A. Melanin content determined by NaOH dissolution；B.
Tyrosinase activity determined by L-Dopa oxidation. （x±s，n＝ 3）.
Compared with the control group，*P＜ 0.05.
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3.4　AVE对组织培养的人皮肤黑色素合成相关蛋白表
达的影响
　　由于 AVE能够促进组织培养的人皮肤模型中黑
色素合成与酪氨酸酶活力，因此考察 AVE对该模型
中黑色素合成相关蛋白表达的影响。MITF是黑色
素合成的关键转录因子，并能调控黑色素相关蛋白
TYR、TRP-1、TRP-2的表达。与对照组相比，AVE
剂量依赖性的促进 TYR、TRP-1、TRP-2、MITF表
达，并且 AVE 80 μg·mL － 1显著上调 TYR、TRP-
1、TRP-2、MITF的 表 达（P＜ 0.05）。α-MSH 300
nmol·L－ 1显著上调 TYR、TRP-1、TRP-2的表达（P
＜ 0.05），并极为显著上调MITF的表达（P＜ 0.001）
（见图 4）。结果显示，AVE通过上调 TYR活力及
MITF调控的黑色素相关蛋白的表达促进组织培养的
人皮肤黑色素合成。
图 4　AVE作用 48 h对人皮肤组织黑色素相关蛋白（TYR、TRP-1、
TRP-2、MITF）表达的影响
Fig 4　Effect of AVE on the expression level of melanogenic proteins
（TYR，TRP-1，TRP-2 and MITF）in organ culture human skin model
for 48 h
注：与对照组相比较，*P＜ 0.05，**P＜ 0.001。
Note：Compared with the control group，*P＜ 0.05，**P＜ 0.001.
3.5　AVE对组织培养的人皮肤 S100表达的影响
　　S100蛋白是低分子量的钙结合蛋白，具有多种亚
型，其中 S100A1特异性表达在黑色素细胞，S100B
特异性表达在黑色素细胞与朗格汉斯细胞。本研究选
择 S100蛋白标记黑色素细胞。图 5显示，S100阳性
细胞主要位于表皮基底层，与正常的人皮肤结构相
一致，组织培养的人皮肤模型中黑色素细胞主要位于
表皮基底层，这一结果再次证明模型的可靠性。与
对照组相比，AVE促进 S 100蛋白的表达。AVE 80
μg·mL－ 1及α-MSH 300 nmol·L－ 1能明显促进 S100
蛋白的表达，即促进黑色素细胞的增殖。
图 5　AVE作用 48 h对人皮肤组织 S100表达及定位的影响（100×）
Fig 5　Effect of AVE on the expression and localization of S100 protein
of organ culture human skin model for 48 h（100×）
4　讨论
　　近年来随着组织工程技术的发展，皮肤组织培养
模型也得到广泛应用。传统的二维细胞难以实现细胞与
细胞的 cross-talk及细胞与其周围基质间作用 [10]；动物
模型由于解剖结构和代谢更新等的差异难以拟合人体
皮肤状态；组织培养的人皮肤模型克服了以上不足，在
药物研究及机制探索等方面不断发展 [11]。本研究采用 3
种培养基作为组织培养条件进行筛选：DMEM培养基
为培养 B16F10、A375等黑色素瘤细胞的常用培养基；
MCDB153培养基是人类原代黑色素细胞培养的主要培
养基；根据文献报道 [12] William’s E培养基可以培养人
毛囊长达 7 d之久，因此选择其为候选培养条件。结果
显示，William’s E培养基所培养的皮肤组织在培养 48
h后仍然表皮层次清晰、细胞排列整齐，与正常的人皮
肤组织结构保持一致（见图 1）。因此William’s E培养
基可以作为后续人皮肤组织培养条件。
　　驱虫斑鸠菊一直被用来治疗色素脱失性皮肤病，
数百年来用来改善皮肤的黑色素合成功能，然而具体
机制仍不清楚。本研究建立组织培养的人皮肤模型，
并探讨该模型下 AVE对皮肤黑色素合成功能的影响及
可能的作用机制。首先，我们考察了 AVE对人皮肤组
织潜在的毒性作用。α-MSH 300 nmol·L－ 1及不同剂
量的 AVE（20～ 80 μg·mL－ 1）作用人皮肤组织模型
后，皮肤结构保持完整、LDH释放明显减少（见图 2）。
而释放到培养基中的 LDH作为细胞毒性指标之一，其
释放量的减少表明该研究剂量下的 AVE对人皮肤组织
具有一定的保护作用，有助于维持皮肤细胞及整个皮
肤结构的稳定性。
　　TYR是黑色素合成的限速酶，据文献报道 [6-7]其
活性和表达直接影响黑色素合成。结果显示，AVE剂
量依赖性的促进人皮肤组织的 TYR活性与黑色素含量
（见图 3）。MITF是黑色素合成的关键转录因子，并调
控黑色素相关蛋白 TYR、TRP-1、TRP-2的表达，最终
影响黑色素合成 [13-14]。为了探究 AV E促进人皮肤组织
黑色素合成的分子机制，考察了 AVE对黑色素合成相
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关蛋白表达的影响。结果显示，AVE剂量依赖性的上
调黑色素相关蛋白 TYR、TRP-1、TRP-2及MITF的表
达（见图 4）。Zhou J等 [15]发现 AVE 20 μg·mL－ 1作
用 24 h极显著促进 B16F10细胞及正常人原代黑色素
细胞 TYR活力及 TYR与MITF的表达。而本研究中
AVE（20～ 80 μg·mL－ 1）作用 24 h对皮肤黑色素合
成没有明显影响（数据未提供），AVE 80 μg·mL－ 1 作
用 48 h具有显著性。这可能有两方面的原因：一方面
作用时间不同，两项研究中 AVE分别作用 24、48 h；
另一方面，模型的 差异。Zhou J等 [15]采用单细胞模型，
研究 AVE直接对黑色素细胞的作用。而本研究采用皮
肤组织模型，AVE不仅直接作用 于黑色素细胞，还可
能作用于角质形成细胞、肥大细胞、朗格汉斯及成纤
维细胞等。并且，多种皮肤细胞之间相互作用，进而
影响黑色素细胞，形成复杂的网络结构。而这一体系
与生理及病理状态下的皮肤结构与功能有更加的相似
度，更能模拟黑色素细胞的微环境。Zhou J等 [15]发现
AVE可促进 B16F10细胞及正常人原代黑色素细胞的
增殖，因此我们进一步考察 AVE对人皮肤组织黑色素
细胞增殖的影响。S100蛋白是低分子量的钙结合蛋白，
常用来标记黑色素细胞 [16]。S-100阳性细胞位于表皮
基底层，且随着 AVE剂量增加，S-100阳性细胞数目
增加（见图 5）。这一结果表明，AVE可以促进人皮肤
组织的黑色素细胞增殖。
　　本研究建立基于组织培养方式的人皮肤模型，并
首次运用于皮肤黑色素合成功能的研究。AVE通过促
进表皮黑色素细胞的增殖及上调MITF及其调控的黑
色素合成相关蛋白的表达，从而促进人皮肤组织的黑
色素合成。但是本研究只是对这一机制进行了初步探
索，AVE在组织培养的人皮肤模型中对黑色素细胞及
其他细胞如角质形成细胞、肥大细胞的作用还有待于
进一步研究。
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