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驱虫斑鸠菊提取物抑制恶性黑色素瘤 A375细胞增殖的研究
李红健1 ,李琳琳2 ,孙　力1 ,尚　靖3(1.新疆自治区人民医院临床药学研究所 , 新疆 乌鲁木齐 830001;2.新疆医科大学
药理学教研室 ,新疆 乌鲁木齐 830054;3.中国药科大学新药筛选中心 ,江苏 南京 210038)
摘要:目的　探讨驱虫斑鸠菊提取物对人恶性黑色素瘤 A375 细胞的增殖以及对其酪氨酸酶活性和黑色素含量的影响。方法　
四甲基噻唑氮蓝比色法测定对 A375 细胞抑制作用;显微法观察细胞形态;比色法测定酪氨酸酶活性和黑色素含量。结果　在
一定质量浓度范围(1 ～ 40 mg· L-1)内随着驱虫斑鸠菊提取物质量浓度增加可抑制黑色素瘤细胞的增殖;驱虫斑鸠菊提取物质
量浓度小于 10 mg· L-1 , 对酪氨酸酶活性和黑色素合成抑制有增加的趋势;大于 20 mg· L-1时 , 显示一定的细胞毒性作用。结
论　驱虫斑鸠菊提取物能显著抑制恶性黑色素瘤 A375 细胞的增殖 , 在一定质量浓度范围内(1 ～ 40 mg · L -1)有浓度依赖关系
(P<0.05)。
关键词:驱虫斑鸠菊提取物;黑色素瘤;A375 细胞;增殖抑制作用
中图分类号:R965　　　文献标识码:A　　　文章编号:1004-2407(2008)01-0034-03
Effect of Vernonia anthelmintica Willd extract on inhibiting the proliferation of
melanoma A375 cells
LI Hong jian1 , LI Linlin2 , SUN Li1 , SHANG Jing3(1.X injiang Institute o f C linical Pharmacy , Urumqi 830001 ;2.Depart-
ment of P harmacology , X injiang Medical Univ ersity , Urumqi 830054 ;3.The National Laboratory of New Drug Screen of
China Pharmaceutica University , Nan jing 210038)
Abstract:Objective To explo re the effects o f Vernonia anthelmintica Willd.ext ract on the inhibition o f prolifer ation and to study
the ty r osinase activ ity and melano genesis in human melanoma A375 cells.Methods The cell prolifera tion inhibition was measur ed
by methy l thiazo ly ltet razo lium(MT T)co lo rime tric assay.The tyr osinase activity and melanin content we re measured by colo rime-
try assay .Results When the concentration of Vernonia anthe lmintica Willd w as range from 1 mg · L-1 to 40 mg · L-1 , a proli-
feration inhabiting effect w as shown with the increase o f the concentration.When the concentra tion was low er than 10 mg · L -1 ,
a po sitiv e effect of ty ro sina se activ ity and melano genesis w as show n.When the concentration was above 20 mg · L-1 , cy toto xic
effect o ccur red.Conclusions There is a concentra tion-dependent relationship be tw een the Vernonia anthelmintica Willd.ex tract
and the inhibition effect of A375 cells prolifer ation (P <0.05).
Key words:Vernonia anthelmintica Willd extr act ;melanoma ;A375 cells ;inhibition in pr olifera tion
　　菊科植物驱虫斑鸠菊(Vernonia anthelmintica
Willd.)为菊科斑鸠属一年生草本植物 ,主要分布于印
度 、巴基斯坦及我国新疆等地。收载于《中华人民共
和国卫生部药品标准·维吾尔药分册》 ,维吾尔语称
卡力孜然 ,药用部位为该植物的成熟瘦果 ,具有清热 、
消炎 、活血化瘀 、杀虫祛斑的作用 ,维吾尔族民间常用
此治疗白癜风[ 1 , 2] 。文献报道驱虫斑鸠菊在体外有
抗肿瘤活性 ,吴剑飞等报道驱虫斑鸠菊中所含成分斑
鸠菊大苦素 、斑鸠菊醇对 P388白血病细胞有抑制作
用[ 3] ;Lambertini E.等报道驱虫斑鸠菊提取物对乳
腺癌细胞的增殖有抑制作用等[ 4] 。黑色素瘤(melan-
moa)化疗有效率低于 25%[ 5] 。国外主要以免疫治疗
和基因治疗为主[ 6] 。本研究旨在为恶性黑色素瘤的
治疗提供新的理论和实验依据 。
1　仪器与试药
1.1　仪器 　二氧化碳培养箱(Heraeus);酶标仪
(DNA Expert)。
1.2　试药　驱虫斑鸠菊提取物浸膏(自制);1640 培
养基 ,二甲亚砜(DMSO),Sigma 公司产品;胰蛋白酶
(GIBCO 公司);四甲基噻唑氮蓝(MT T ,华美公司);
新生小牛血清(杭州四季青生物制品有限公司);丝裂
霉素(MMC , Kyow a Hakko);五氟尿嘧啶(5-Fu ,上
海旭东海普药业)。
1.3　细胞株　人恶性黑色素瘤细胞株 A375 (购自
中科院上海细胞所)。
2　方法
2.1　药物配制　提取物浸膏 100 mg 溶于二甲基亚
砜 0.5 mL ,配成 400 mg ·L-1 ,终质量浓度为 1 ,10 ,
20 ,40 , 80和 100 mg · L-1 ;阳性对照组:丝裂霉素 2
mg ·L-1;五氟尿嘧啶 5 mg ·L-1;二甲基亚砜 0.05%
(体积分数);MT T 以无血清 RPM I-1640(临用前配
制),过滤除菌备用。
2.2　细胞培养　人恶性黑色素瘤细胞 A375贴壁培
养于含 10 %(体积分数)新生小牛血清的 RPMI
1640 培养基中 ,置 37 ℃,5 %CO 2的饱和湿度培养箱
中培养 。
2.3　MTT 比色法[ 7] 　取培养 4 ～ 5 d的对数生长期
A375细胞用 0.2 g ·L-1 EDTA 的胰蛋白酶2.5 g ·L-1
消化单层培养细胞消化后 ,配成 5×104个 ·L-1的细
胞悬液接种于 96 孔培养板 , 每孔加细胞悬液 100
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μL;培养 24 h后加入驱虫斑鸠菊提取物 100 μL ,终
质量浓度 1 ～ 100 mg ·L-1(每个质量浓度设 3孔 ,做
3批),空白对照组加 100μL 培养液 ,阳性对照为丝裂
霉素和五氟尿嘧啶[ 8] ;24 h 后各孔加入 5.0 g · L-1
MTT 50 μL ,培养 4 h后再加入 DMSO 100 μL 终止
反应 ,37 ℃振荡 30 min ,使结晶溶解 ,570 nm 处测定
吸光度(OD)值。
　肿瘤细胞生长抑制率(%)=对照组OD 值-用药组OD 值对照组OD 值 ×100 %
2.4　生长曲线法测定[ 7] 　将 A375 细胞接种于含
10%(体积分数)FBS 的 RPM I 1640 培养基 ,分别配
成 1×104 个·L-1的细胞悬液 ,加入培养板中 ,每孔
200 μL ,待细胞培养 24 h贴壁后 ,实验组加入最终质
量浓度为 1 , 10 ,20和 40 mg ·L -1的提取物 ,对照组
加入等体积溶剂 ,每种细胞每质量浓度设 4 孔 ,重复
4次 ,置 5%CO2 、37 ℃温箱中培养 ,然后按 1 , 2 ,3 , 4 ,
5 ,6和 7 d各取样加入 4 g ·L-1台盼蓝液 ,每种质量
浓度设 3个平行孔计数活细胞数 ,根据细胞浓度值的
对数值与时间作用绘成图 ,即为细胞生长曲线 。用台
盼蓝染色法进行活细胞计数。
2.5　酪氨酸酶活性的测定[ 9 , 10] 　待 A375细胞生长
至近融合状态 ,经 2.5 g · L-1胰蛋白酶消化收集并
调整细胞浓度 3×104 ·L -1 ,培养板加入人黑色素瘤
A375细胞单细胞悬液每孔 200μL ,待贴壁后加入含
药物的培养液 ,分别继续培养 48 h 后弃培养液 ,用
pH7.4的 PBS 洗涤 2 次 ,每孔加入 1%(体积分数)
T ri ton X-100 溶液 90 μL , 迅速置 -80℃冻存 30
min ,随后室温融化使细胞完全裂解 ,37 ℃预温后加入
10 g ·L-1多巴溶液 100 μL ,37 ℃反应 0.5 h ,490 nm
处测定吸光度值。每一浓度设 4个复孔 ,取平均值 。
2.6　黑色素含量测定[ 11] 　选择对数生长期 A375细
胞 ,将细胞浓度调整为 3×107 ·L-1 ,加入 24孔细胞
培养板 ,每孔 1 mL ,待细胞贴壁生长后加入含药物的
培养液每孔 1 mL ,对照组不加 。培养 4 d后 ,用 2.5
g ·L-1胰蛋白酶消化 6 ～ 8 min ,将细胞收集入离心
管离心 10 min(1 000 r ·min-1),倾去上清液 ,再用
PBS 洗 2次后 ,用 1 mo l· L-1氢氧化钠 0.5 mL 在
37 ℃作用 48 h ,充分裂解细胞和溶解黑色素颗粒 ,每
孔加入 100 μL ,405 nm 处测定吸光度值 。每一质量
浓度设 4个复孔 ,取平均值。
2.7　细胞形态观察　各组细胞培养 48 h 后 ,在镜下
观察黑色素瘤细胞的形态改变 。
2.8　统计学方法　采用直线回归和相关分析以及样
本均数(student , s-t)检验。
3　结果
3.1　驱虫斑鸠菊提取物对 A375细胞增殖作用的影
响　以提取物不同质量浓度和肿瘤细胞生长抑制率
作散点图 ,作直线和回归分析 ,得方程式:
Y =1.903 6X +13.36 , R2 =0.911 8 , P <0.05
表明提取物与黑色素瘤 A375细胞生长抑制率在
1 ～ 40 mg ·L-1范围内有依赖关系(见表 1),大于 40
mg ·L-1时与阳性对照组作用相似 ,呈现一定的细胞
毒作用 。
表 1　驱虫斑鸠菊提取物对人恶性黑色素瘤 A375 细胞
增殖的影响( x ±s , n=9)
药　物 质量浓度/mg· L -1 生长抑制率 / %
空白对照 0 　 0.00±0.00
驱虫斑鸠菊 1.00 9.52±0.13
10.00 30.13±4.44
20.00 66.04±3.73
40.00 82.91±0.81
80.00 91.51±1.09
100.00 92.58±0.45
MMC 2.00 78.38±1.27
5-Fu 5.00 74.70±2.12
3.2　驱虫斑鸠菊提取物对 A375细胞生长曲线的影
响　图 1显示 ,提取物对 A375肿瘤细胞的生长抑制
作用呈质量浓度和时间依赖性 。
3.3　驱虫斑鸠菊提取物对酪氨酸酶活性的影响　由
表 2可见 ,大于 20 mg ·L-1药物组酪氨酸酶活性下降
(P <0.01),其原因是高质量浓度的驱虫斑鸠菊对
A375细胞有毒性作用 ,抑制了酪氨酸酶的分泌。从细
胞形态可见 ,细胞变形甚至死亡 ,也支持上述结果。
图 1　驱虫斑鸠菊提取物对 A375细胞作用的时间-剂量曲线
—◇—对照;—□—1 mg · L-1;—△—10 mg · L-1;
—×— 20 mg· L -1;— —40 mL · L-1
图 2　不同驱虫斑鸠菊提取物组对 A375 细胞
形态的影响(10×40 倍)
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表 2　不同质量浓度驱虫斑鸠菊作用 A375细胞酪氨酸酶活性
和黑素含量(OD, x±s , n=8)
药物质量浓度/mg· L -1 酪氨酸酶活性 黑色素含量
0 　 0.084±0.002 0.085±0.008
1.00 0.084±0.004 0.091±0.007
10.00 0.078±0.008 0.084±0.005
20.00 0.073±0.003＊＊ 0.079±0.008
40.00 0.059±0.004＊＊ 0.075±0.008
80.00 0.070±0.002＊＊ 0.075±0.018
注:与对照组比较 , ＊＊P<0.01 , ＊P<0.05
3.4　驱虫斑鸠菊提取物对 A375细胞中黑色素的影
响　由表 2可见 ,药物质量浓度在 1 ～ 10 mg · L-1
时 ,黑色素含量有增加的趋势 ,大于 20 mg ·L-1时黑
色素含量有下降的趋势(P>0.05),说明驱虫斑鸠菊
在高质量浓度时体外可能对 A375细胞有毒性作用 。
3.5　驱虫斑鸠菊提取物对 A375细胞形态的影响　由
图2可见 ,对照组细胞呈现双极的细胞;1～ 10 mg ·L-1
组细胞形态与对照组变化不大;20 mg · L-1组细胞
形态数突增多并延长 ,部分细胞开始变成圆形;40
mg · L-1组细胞均变成圆形 ,细胞内颗粒较多 ,出现
死亡 ,显示明显的细胞毒性。
4　讨论
本研究显示 ,驱虫斑鸠菊提取物能够显著抑制人
恶性黑色素瘤 A375细胞的增殖 ,且抑制作用随质量
浓度的升高而逐渐增强。
MTT 法 、生长曲线法是观察体外抗肿瘤活性的
常用方法 。MT T 法快速简便 ,常用于抗肿瘤药的体
外初筛试验。本研究采用 2种试验方法的联合应用
增加了试验结果的可靠性 。
试验结果也发现用药物干预后细胞形态变化不
大 ,对人恶性黑色素瘤 A375细胞合成黑色素及酪氨
酸酶活性在低质量浓度(1 ～ 10 mg ·L -1)时有促进
作用 ,但不明显 。高质量浓度对 A375细胞表现出细
胞毒作用 ,从而抑制了酪氨酸酶的分泌和黑色素的合
成。此方面有待于进一步的研究。
驱虫斑鸠菊提取物抗肿瘤作用的物质基础尚不
明确 ,现报道有抗肿瘤活性的主要为萜类和内酯类化
合物[ 4] 。
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melanin[ J] .Yale J Biol Med , 1973 , 46:500.
(收稿日期:2007-04-14)
大黄素类化合物抗子宫内膜癌细胞
活性的 QSAR模型研究
赵蔡斌 ,郭小华 ,闵锁田(陕西理工学院化学与环境科学学
院 , 陕西 汉中 723000)
基金项目:陕西理工学院专项科研项目(SLGQD0508)
摘要:目的　探索大黄素类化合物抗子宫内膜癌细胞活性的
构效关系。方法　采用量子化学 AM1算法 ,计算药物分子结
构参数 , 利用逐步回归法和神经网络法建立构效关系模型。
结果　建立了 2种大黄素类化合物抗子宫内膜癌细胞活性的
构效关系模型。结论　大黄素类化合物抗子宫内膜癌细胞活
性与其分子的水合能 H 、极化率α相关。 2 种构效关系模型
都具有可信的预报能力 ,神经网络模型预报能力更强。
关键词:大黄素类化合物;子宫内膜癌细胞;构效关系;抽一法
交叉验证
中图分类号:R966　　　文献标识码:A　　　
文章编号:1004-2407(2008)01-0036-03
大黄素(emodin)属于三羟基蒽醌类化合物 ,为中
药大黄的有效成分之一 , 具有多种生物活性[ 1] 。
Demirezer等[ 2]发现大黄素及其衍生物对多种肿瘤细
胞有抑制作用。Teich 等[ 3] 则发现 4位上为不同胺所
取代的大黄素衍生物 ,具有更强的活性。人工神经网
络利用计算机来模拟生物神经网络的某些结构和功
能 ,具有强大的非线性处理能力 、自组织协调及容错能
力 ,已广泛用于定量构效关系(QSAR)[ 4] 的研究中 。
1　药物分子构型优化方法及结构参数计算
大黄素母体结构如图 1所示。抗癌活性数据来
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