全 文 :第32卷 第4期
2014年12月
广西师范大学学报:自然科学版
Journal of Guangxi Normal University:Natural Science Edition
Vol.32 No.4
Dec.2014
doi:10.16088/j.issn.1001-6600.2014.04.014
收稿日期:2014-06-19
基金项目:国家自然科学基金资助项目(31470426);教育部重点科技项目(212188);青海省科技项目(2014-HZ-810,
2014-NS-516)
通信联系人:丁晨旭(1973-),男,青海西宁人,中国科学院西北高原生物研究所副研究员。E-mail:13709710391@
163.com
响应面优化多刺绿绒蒿总生物碱提取工艺
罗云演1,2,李容正3,李 冰4,丁晨旭5
(1.青海民族大学 化学与生命科学学院,青海 西宁810007;2.青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室,青海 西宁810007;
3.青海省红十字医院,青海 西宁810001;4.青海省科学技术信息研究所,青海 西宁810008;
5.中国科学院西北高原生物研究所,青海 西宁810001)
摘 要:利用响应面法优化多刺绿绒蒿中总生物碱的提取工艺。在单因素试验的基础上,选择盐酸质量分
数、液料比、提取温度为自变量,以总生物碱吸光度为响应值,进行Box-Behnken中心组合实验设计,采用响应
面法(RSM)分析这些因素对总生物碱提取的影响。响应面优化设计得出的最佳工艺条件为盐酸质量分数
3.7%,液料比38∶1,提取温度56℃,总生物碱提取率达1.18%。
关键词:响应面分析法;多刺绿绒蒿;总生物碱;提取
中图分类号:Q946.88,O629.3 文献标识码:A 文章编号:1001-6600(2014)04-0084-07
0 引言
多刺绿绒蒿Meconopsis horridula Hook.f.&Thomson为一年生草本罂粟科绿绒蒿属植物,藏名
为乌巴拉色尔布,在藏药中属于“刺儿恩类”,全株包被黄褐色或淡黄色坚硬而平展的刺,主要分布于青海、
西藏、云南、甘肃等省(区),生长于海拔3 000~5 000m的山坡石缝中。《晶珠本草》记载:“刺儿恩味苦,功效
清蒸热,为治头创伤最有疗效之药”[1-3]。其具有活血化瘀、止痛的作用,用于治疗骨折、跌打损伤等症。
生物碱类化合物存在于很多种生物体内,具有多种生理活性[4-5]。绿绒蒿属植物中已发现广泛的生物
碱类化合物,但是对于多刺绿绒蒿中生物碱的研究还少见报道,通过查阅相关文献[6-12],研究表明其主要
活性成分为异喹啉类生物碱,吴海峰[11]等从多刺绿绒蒿中分离和鉴定了4个生物碱,分别是8,9-
dihydroprooxocryptochine、原鸦片碱、(–)reframoline和黑龙辛甲醚。马应龙[12]等从多刺绿绒蒿中分离
得到了原荷包牡丹碱、原鸦片碱2种生物碱。
本文运用响应面分析法对盐酸溶液质量分数、液料比、提取温度等对多刺绿绒蒿总生物碱提取率影响
较大的因素进行优化,从而提高多刺绿绒蒿总生物碱的提取,为合理开发该宝贵的藏药资源提供参考,提
高西部地区的经济效益,促进西部地区资源的可持续发展。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
T6新世纪紫外-可见分光光度计(北京谱析通用仪器有限责任公司);KQ-300B超声仪(昆山市超声
仪器有限公司);AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。
第4期 罗云演等:响应面优化多刺绿绒蒿总生物碱提取工艺
多刺绿绒蒿,采自青海省海北门源地区,由当地藏医鉴定;盐酸罂粟碱(中国药品生物制品检定所);盐
酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠、溴甲酚紫均为分析纯。
1.2 标准曲线的制备
1.2.1 标准品溶液的配制
精密称取盐酸罂粟碱对照品(105℃干燥至恒质量)4.75mg,用水溶解于25mL容量瓶中,稀释至刻
度,摇匀,得质量浓度为0.19g/L贮备液。
1.2.2 制备标准曲线[13]
分别吸取贮备液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL,置于6个分液漏斗中,编号1-6,用水稀释至10
mL,加入pH 5.0磷酸盐缓冲液5.0mL,混匀,加入溴甲酚紫试液2.0mL,混匀,静置5min,加入氯仿
10.0mL充分萃取,取氯仿层于410nm波长处测定吸光度。以该系列中1号溶液为参比,以罂粟碱质量
浓度C(g/L)为纵坐标,吸光度值A 为横坐标,作标准曲线,得标准曲线方程为C=0.284 3A+0.010 4,
R2=0.999 6。
1.3 多刺绿绒蒿中总生物碱的提取
多刺绿绒蒿全草干燥至水份质量分数小于8%,粉碎,过450μm孔径筛网。准确称取样品1g,按一
定的液料比加入一定浓度的盐酸溶液,浸泡30min,按一定的温度进行超声(120kHz)提取45min,提取
3次,合并滤液。用质量分数10%的氢氧化钠调节滤液的pH到13,静置5min,用150mL的氯仿分3次
萃取,合并氯仿萃取液,回收溶剂,即得多刺绿绒蒿总生物碱,按“1.2.2”项下方法(410nm,1mL比色皿)
操作,测定吸光度。
1.4 影响多刺绿绒蒿中总生物碱提取的因素考察
1.4.1 盐酸质量分数对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响
准确称取多刺绿绒蒿粉末1g,置于50mL三角瓶中,固定液料比30∶1(mL/g),提取温度50℃,超
声提取时间45min,考察盐酸质量分数对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响。
1.4.2 液料比对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响
准确称取多刺绿绒蒿粉末1g,置于50mL三角瓶中,固定盐酸质量分数3%,提取温度50℃,超声提
取时间45min,考察液料比对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响。
1.4.3 提取时间对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响
准确称取多刺绿绒蒿粉末1g,置于50mL三角瓶中,固定液料比30∶1(mL/g),提取温度50℃,盐
酸质量分数3%,考察超声提取时间对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响。
1.4.4 提取温度对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响
准确称取多刺绿绒蒿粉末1g,置于50mL三角瓶中,固定液料比30∶1(mL/g),盐酸质量分数3%,
超声提取时间45min,考察提取温度对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响。
1.5 多刺绿绒蒿中总生物碱的提取工艺设计
本实验采用Design Expert.V.8.0.6软件中的Box-Behnken中心组合试验设计响应面试验。根据影
响多刺绿绒蒿中总生物碱提取因素考察的结果,选取盐酸质量分数、液料比和提取温度3个因素作为试验
因素,以总生物碱提取率为响应值设计试验,试验因素及水平见表1。
表1 中心组合设计表
Tab.1 Central composite design
因素 -1 0 1
盐酸质量分数(A)/% 2 3 4
液料比(B)/(mL·g-1) 20 30 40
提取温度(C)/℃ 40 50 60
58
广西师范大学学报:自然科学版 第32卷
2 结果与分析
2.1 单因素对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响
2.1.1 盐酸质量分数对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响
盐酸质量分数对提取多刺绿绒蒿中总生物碱影响的实验结果如图1所示。
图1 盐酸质量分数对总生物碱提取率的影响
Fig.1 Effects of hydrochloric acid concentration on the extraction yield of total alkaloids
由图1可知,随着盐酸质量分数的升高总生物碱提取率上升,在盐酸质量分数为3%之后,再增加盐
酸的质量分数提取率明显下降。这可能是由于盐酸质量分数增大,酸性增强,破坏了生物碱的结构,致使
提取率下降,故选择盐酸质量分数3%左右为宜。
2.1.2 液料比对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响
液料比对提取多刺绿绒蒿中总生物碱影响的实验结果如图2所示。
图2 液料比对总生物碱提取率的影响
Fig.2 Effects of ratio of liquid to solid on the extraction yield of total alkaloids
由图2可以看出,多刺绿绒蒿生物碱提取率随液料比的增加而增大,当液料比达到30∶1时,多刺绿
绒蒿总生物碱的提取率已基本达到最佳,随着液料比的进一步增大,提取率仅略微上升,从节约溶剂的角
度,选择液料比为30∶1左右为宜。
2.1.3 提取时间对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响
提取时间对提取多刺绿绒蒿中总生物碱影响的实验结果如图3所示。
由图3可知,在15~45min,多刺绿绒蒿总生物碱提取率随着提取时间的延长而显著增加,45min后
随着提取时间的延长,提取率略有下降,这可能是由于杂质的溶出也相对随之增加,干扰了生物碱的溶出
所致,考虑到提取周期和效益,选择提取时间为45min。
68
第4期 罗云演等:响应面优化多刺绿绒蒿总生物碱提取工艺
2.1.4 提取温度对提取多刺绿绒蒿中总生物碱的影响
提取温度对提取多刺绿绒蒿中总生物碱影响的实验结果如图4所示。
由图4可见,多刺绿绒蒿总生物碱提取率随提取温度的升高逐渐增加,但50℃以后提取率显著下降,
这可能是由于多刺绿绒蒿中的生物碱对温度敏感,随着提取温度的升高,其结构发生了改变,与染料的结
合率降低,致使提取率明显下降,故选择提取温度为50℃左右。
图3 提取时间对总生物碱提取率的影响
Fig.3 Effects of extraction time on theextraction yield of total alkaloids
图4 提取温度对总生物碱提取率的影响
Fig.4 Effects of extraction temperature on theextraction yield of total alkaloids
2.2 响应面分析方案与数据分析
Box-Behnken设计方案及实验结果见表2。利用DesignExpert.V.8.0.6软件,通过对表2中总生物
碱提取率实验数据进行多元回归拟合,对实验结果进行响应面分析,得出回归模型方差分析表和响应曲面
图,分别见表3和图5~7。
响应面软件程序对表2中实验结果进行二次回归响应面分析,得到的回归方程为:多刺绿绒蒿总生物
碱的提取率=1.14+0.095A+0.066B+0.046C+0.012AB-0.033AC+0.02BC-0.093A2-0.035B2
+0.005C2
由表3可知,回归模型P 值小于0.001达到极显著水平,方程相关系数R2=0.954 8,说明该模型拟
合度较好,失拟项P=0.484 7(P>0.1)不显著,表明本实验所得二次回归方程高度显著,实验设计可靠。
该模型优化得出的最佳提取工艺为盐酸质量分数3.71%、液料比38.34,提取温度56.27℃,在该提取条
件下总生物碱提取率理论值为1.23%。两因素交互作用对总生物碱提取率影响的响应面图如图5~7。
78
广西师范大学学报:自然科学版 第32卷
表2 Box-Behnken设计方案及实验结果
Tab.2 Box-Behnken experiments design and results
实验编号 盐酸质量分数/% 液料比/(mL·g-1) 提取温度/℃ 提取率/%
1 3 30 50 1.14
2 3 20 60 1.09
3 3 30 50 1.15
4 2 40 50 0.99
5 2 30 40 0.87
6 4 40 50 1.19
7 3 30 50 1.11
8 2 30 60 1.03
9 3 30 50 1.17
10 3 40 60 1.22
11 3 20 40 1.02
12 2 20 50 0.86
13 3 40 40 1.11
14 3 30 50 1.13
15 4 30 40 1.14
16 4 20 50 1.01
17 4 30 60 1.17
表3 回归方程方差分析表
Tab.3 ANOVA for quadratic polynomial model
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性
Model 0.17 9 0.019 38.59 <0.000 1 ***1
A 0.072 1 0.072 145.44 <0.000 1 ***
B 0.035 1 0.035 70.73 <0.000 1 ***
C 0.017 1 0.017 34.47 0.000 6 **2
AB 0.000 625 1 0.000 625 1.26 0.298 9
AC 0.004 225 1 0.004 225 8.51 0.022 4
BC 0.000 4 1 0.000 4 0.81 0.399 2
A2 0.036 1 0.036 72.57 <0.000 1 ***
B2 0.005 158 1 0.005 158 10.39 0.014 6
C2 0.000 105 3 1 0.000 105 3 0.21 0.659 1
残差 0.003 475 7 0.000 496 4
失拟性 0.001 475 3 0.000 491 7 0.98 0.484 7 不显著3
纯误差 0.002 4 0.000 5
总差 0.18 16
R2=0.980 2 R2 Adj=0.954 8
1.***,P<0.001,差异极显著;2.**,P<0.01,差异高度显著;3.P>0.1,差异不显著。
88
第4期 罗云演等:响应面优化多刺绿绒蒿总生物碱提取工艺
图5 盐酸质量分数与液料比交互作用对总生物碱提取率影响的响应面图
Fig.5 Response surface curve for the extraction yield of total alkaloids showing interaction
between hydrochloric acid concentration andratio of liquid to solid
图6 盐酸溶液与提取温度交互作用对总生物碱提取
率影响的响应面图
Fig.6 Response surface curve for the extraction yield of
total alkaloids showing interaction between
hydrochloric acid concentration and extraction
temperature
图7 液料比与提取温度交互作用对总生物碱提取
率影响的响应面图
Fig.7 Response surface curve for theextraction yield of
total alkaloids showing interaction between ratio of
liquid to solid and extraction temperature
3 验证实验
模型优化条件得到的最佳理论工艺条件为:盐酸质量分数3.71%、液料比38.34,提取温度56.27℃,
总生物碱提取率理论值为1.23%,实际操作中将工艺修正为盐酸质量分数3.7%、液料比38∶1,提取温
度56℃进行实验,总生物碱提取率为1.18%(n=3,RSD=0.61%)。
4 结论
采用响应面法优化多刺绿绒蒿总生物碱的超声波提取工艺,得出最优工艺条件为盐酸质量分
数3.7%,液料比38∶1,提取温度56℃,经检验,在此工艺条件下,总生物碱提取率为1.18%(n=3)。该
研究结果对多刺绿绒蒿中总生物碱的提取提供一定的参考价值,为绿绒蒿的综合开发利用提供理论依据。
参 考 文 献:
[1] 孙红祥,奚镜清.多刺绿绒蒿的考释[J].中国中药杂志,1993,18(8):454.
[2] 刘松渝.绿绒篙属植物的生物碱[J].华西药学杂志,1987(3):173-175.
98
广西师范大学学报:自然科学版 第32卷
[3] 王彬,宋学华,蹼社班.藏药“欧贝”和“刺儿恩”的性状鉴定研究[J].江苏药学与临床研究,2003,11(3):23-25.
[4] 尹文清,段少卿,张岩,等.钩藤不同溶剂提取物及总生物碱抗氧化活性研究[J].广西师范大学学报:自然科学版,
2010,28(1):31-34.
[5] 汪洪武,汤敏燕,孙凌峰,等.具有抗肿瘤活性的生物碱类化合物[J].江西师范大学学报:自然科学版,1996(3):
233-237.
[6] 马明芳,丁克毅,丁立生,等.多刺绿绒蒿的化学成分研究[J].华西药学杂志,2009,24(3):227-229.
[7] 吴海妹,袁瑞瑛,小尼玛顿珠,等.多刺绿绒蒿的化学成分[J].药学与临床研究,2012,20(4):314-316.
[8] 袁瑞瑛,旦欧,次登,等.藏药多刺绿绒蒿化学成分研究现状[J].西藏科技,2012(5):64-66.
[9] 李启发.通关藤和多刺绿绒蒿的化学成分研究[D].成都:西南民族大学,2007:30-36.
[10] 吴海峰,潘莉,邹多生,等.3种绿绒蒿挥发油化学成分的GC-MS分析[J].中国药学杂志,2006,41(17):1298-1300.
[11] 吴海峰.五种绿绒蒿藏药材化学成分研究[D].西宁:中国科学院西北高原生物研究所,2009.
[12] 马应龙.多刺绿绒蒿化学成分的研究[D].西宁:青海师范大学,2008.
[13] 尹萌,梁宪扬.酸性染料比色法测定强力枇杷露中盐酸罂粟碱的含量[J].华西药学杂志,2001,16(6):460-461.
Optimization of Extraction Process of Alkaloids from Meconopsis horridula
Hook.f.&Thomson by Response Surface Methodology
LUO Yun-yan1,2,LI Rong-zheng3,LI Bing4,DING Chen-xu5
(1.Colege of Life Science and Chemistry,Qinghai University for Nationalities,Xining Qinghai 810007,China;
2.Key Laboratory of Plant Resources and Chemistry of Qinghai-Tibet Plateau,Xining Qinghai 810007,China;
3.Qinghai Red Cross Hospital,Xining Qinghai 810001,China;4.Science and Technology Information Institute
of Qinghai,Xining Qinghai 810001,China;5.Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,
Xining Qinghai 810001,China)
Abstract:Response surface method (RSM)is applied to optimize the extraction of alkaloids from
Meconopsis horridula Hook.f. & Thomson.Based on single experiment,hydrochloric acid
concentration,liquid-solid ratio and extracting temperature are selected for designing,the extraction
yield of alkaloids as response value.Box-Benhnken central combination experiment is used to set a
mathematical model for response surface analysis.The results of RSM show that the optimal extraction
conditions are:hydrochloric acid concentration is 3.7%,liquid-solid ratio is 38∶1,and extracting
temperature is 56℃.Under these conditions,the extraction yield of alkaloids is up to 1.18%.
Key words:RSM;Meconopsis horridula Hook.f.&Thomson;alkaloids;extraction
(责任编辑 王龙杰)
09