全 文 ：　收稿日期:2009-11-17
　■基金项目:浙江省自然科学基金(NO.Y2080313)
　　文章编号:1004-4337(2010)02-0194-04　　　中图分类号:R944.6　　文献标识码:A · 药学研究 ·
响应面分析法优化小鱼仙草总黄酮的提取工艺研究■
严云良　　吕佩惠　　余陈欢
(浙江中医药大学　杭州 310053)
摘　要:　目的:确定小鱼仙草总黄酮的最佳提取工艺条件。方法:以乙醇回流提取法提取小鱼仙草总黄酮 ,采用分光光度法测
定总黄酮的含量 ,以总黄酮提取得率为考察指标,考察溶媒倍数 、提取时间和提取次数等因素对小鱼仙草总黄酮提取得率的影响 ,利
用响应面分析法优化提取工艺 ,确定总黄酮的最佳提取工艺。结果:小鱼仙草总黄酮的最佳提取工艺为:加药材 20倍量浓度为 70%
乙醇 ,于 90℃水浴回流提取 3次 ,每次 1.9 h。此工艺下小鱼仙草总黄酮的提取得率达 8.50%。 结论:该工艺提取得率高 、操作简
便 ,易于工业化大生产。
关键词:　小鱼仙草;　黄酮;　响应面分析法
doi:10.3969/ j.i ssn.1004-4337.2010.02.030
　　小鱼仙草为唇形科石荠苧属一年生草本植物 Mosla dian-
ther a的全草 ,别名疏花荠苧 、野香薷等。具有祛风发表 、利湿
止痒之功效 , 主治感冒发热 、扁桃体炎 、中暑头痛 、溃疡病
等[ 1] 。有关小鱼仙草挥发油的研究报道较多 , 其挥发油主要
含有香荆芥酚 、百里香酚 、芳香醇和丁香烯等成分 , 具有较好
的抑菌作用[ 2] ;而对小鱼仙草非挥发性部位的研究报道较少。
现代研究表明 ,其非挥发性部位主要含有黄酮 、酚酸等成分 ,
具有抗菌 、抗氧化 、抗变态反应等作用[ 3 ,4] 。目前关于小鱼仙
草总黄酮提取工艺优化方面的研究少见报道。 仅刘小芬等[ 5]
对小鱼仙草总黄酮的提取工艺作了单因素考察 , 缺乏多因素
间的交互作用分析 , 具有一定的局限性。而响应面分析法
(Response surface analy sis me thodo log y , RSM)是目前比较通
用的设计分析方法 , 它通过多元二次回归方程拟合多因子实
验中多个因子与响应值间的关系 , 通过对方程求极值的方法
达到参数优化的目的[ 6 ～ 9] 。本研究在前期单因素实验的基础
上 ,采用响应面分析法 , 根据 Box-Behnken 组合设计原理 , 考
察了影响小鱼仙草总黄酮回流提取效果的主要因素 , 确定了
其最佳提取工艺条件 ,为更好地开发以小鱼仙草总黄酮为主
的药物及其制剂提供了实验参考。
1　仪器与试药
WND-200A 型高速中药粉碎机(上海微型电机厂)、
S22PC 可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)。小鱼仙草
药材于 2008 年 10月采自浙江永康 , 经俞冰副教授鉴定为小
鱼仙草 M osla dianther a M axim.的地上部分 , 阴干 , 粉碎 , 备
用。芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所(批号:100080-
20030), 所用试剂均为分析纯。
2　实验方法与结果
2.1　总黄酮的含量测定
精密称取 105℃干燥恒重的芦丁对照品 10.6 mg , 加 50
%乙醇溶解定容于 50 mL 容量瓶 ,得浓度为 2.12 mgom L-1标
准品溶液。精密吸取标准品溶液 1.0 、2.0 、3.0、4.0 、5.0 、6.0
ml , 分别置 25 ml容量瓶中 , 加 5 % NaNO2 1.0 mL , 摇匀 , 放
置 6 min 后加 10 % Al(NO3)3 1.0 m L , 摇匀 , 放置 6 min 后
再加 10 % NaOH 10 mL , 加 50 %乙醇稀释至 25 ml , 混匀 ,静
置 15 min , 同行试剂作空白 ,于 510 nm 处测定吸光度[ 10] ,以吸
光度值为纵坐标 , 以芦丁浓度为横坐标 , 绘制标准曲线 , 得回
归方程:A= 0.5464C + 0.0056 , r =0.9997 , 结果表明芦丁
在 0.212～ 1.272 mg 范围内线性关系良好。
2.2　提取工艺研究
根据 Box-Benhnken 的中心组合实验设计原理 , 综合单因
素实验结果 ,在选定乙醇浓度为 70%、提取温度为 90℃的前
提下 ,选择溶媒倍数 、提取时间和提取次数 3 个因素作为自变
量设计响应面分析实验 , 分别以 X 1 、X2 、X 3 表示 , 每个自变量
的低 、中 、高水平分别以-1 、0、1 进行编码 ,以小鱼仙草总黄酮
提取得率作为响应值 Y。实验因素及水平安排见表 1。
表 1　实验因素及水平安排表
因素/水平 -1 0 1
X 1/ 溶媒倍数 20 30 40
X 2/ 提取时间 1 1.5 2
X 3/ 提取次数 1 2 3
　　分别精确称取小鱼仙草干燥药材粉末 5.0 g ,根据表 1 选
择的因素和水平 , 70%乙醇回流提取 , 过滤 , 加同浓度的乙醇
溶液定容至 250 mL , 摇匀 , 作为供试品溶液。精密移取 0.3
mL 供试品溶液 ,测定总黄酮含量 ,计算总黄酮提取得率 , 结果
见表 2。
·194·
Journal o f Mathematical Medicine Vo l.23　　 No.2　　 2010
表 2　响应面实验安排及结果(n=3)
实验编号 X 1 X 2 X 3 Y/ %-
1 -1 -1 0 8.10
2 -1 1 0 8.03
3 1 -1 0 8.12
4 1 1 0 8.76
5 0 -1 -1 7.79
6 0 -1 1 8.07
7 0 1 -1 7.99
8 0 1 1 8.90
9 -1 0 -1 8.00
10 1 0 -1 7.94
11 -1 0 1 8.25
12 1 0 1 8.44
13 0 0 0 8.39
14 0 0 0 8.48
15 0 0 0 8.44
　　注:共有 15个实验 ,其中 12个为析因实验 , 3 个为中心实
验以估计误差。
采用 SAS 9.1.3 软件对表 2 结果进行响应面回归分析 ,
得拟合方程:Y =8.436667+0.11X1 +0.2X 2 +0.2425X3 -
0.107083X1 2 +0.1775X1X 2 +0.0625X 1X 3 -0.077083X 22 +
0.1575X2 X3 -0.172083X 32(R= 0.9622)。并作回归方程显
著性检验及方差分析 ,结果见表 3。
表 3　回归方程的显著性检验及方差分析结果
方差来源 自由度 偏差平方和 均方和 F值 显著性
X 1 1 0.0968 0.0968 4.6494 P>0.05
X 2 1 0.3200 0.3200 15.3698 P<0.05
X 3 1 0.4704 0.4704 22.5961 P<0.01
一次项 3 0.8873 0.29575 14.3894 P<0.01
二次项 3 0.1699 0.05141 2.50149 P>0.05
交互项 3 0.2409 0.08029 3.90650 P>0.05
回归 9 1.2980 0.1442 6.9271 P<0.05
误差 5 0.1041 0.0208 - P>0.05
总体 14 1.4021 - - -
　　由表 3 可知 ,回归方程具有显著性 , 且线性相关系数 R 在
置信区间 95%,说明该模型与实际实验拟合较好。 可用于替
代实验点对实验结果进行分析。方程中一次项对小鱼仙草总
黄酮提取得率有显著性影响 , 二次项 、交互项则无显著性影
响 ,因此各因素与指标之间是简单的线性关系 ,而不是二次关
系。其中 ,提取时间(X2)和提取次数(X3)对总黄酮提取得率
有显著性影响 ,而溶媒倍数(X1)则无显著性影响。 并作相应
的等值线图和响应图 ,结果见图 1～ 6。
经 SAS 软件分析计算后可知 ,理论最佳回流提取工艺为:
加药材 24.30 倍量的浓度为 70%乙醇于 90℃水浴回流提取
2.54 次 , 1.85 h。在此条件下 ,小鱼仙草总黄酮提取得率理论
值为 8.78%。综合考虑实际操作的简便及实验方差分析结
果 ,确定最佳回流提取工艺为:加药材 20 倍量浓度为 70%乙
醇 ,于 90℃水浴回流提取 3 次 ,每次 1.9 h。按最佳提取工艺
进行验证性实验 , 测定小鱼仙草总黄酮含量 , 计算提取得率 ,
结果总黄酮的提取得率为 8.54%, RSD= 0.47%, 证明该工
艺稳定 ,重现性好。
图 1　y= f 1(x1 , x2)的等值线图(x 3=0)
图 2　y=f 1(x 1 , x2)响应面图(x3 =0)
图 3　y=y= f2(x2 , x3)的等值线图(x 1=0)
图 4　y=f 2(x 2 , x3)响应面图(x1 =0)
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数理医药学杂志 2010 年第 23 卷第 2 期
图 5　y=f 3(x 1 , x3)的等值线图(x2 =0)
图 6　y=f 3(x1 , x 3)响应面图(x2 =0)
3　结论与讨论
数理统计方法在中药有效成分的提取工艺中应用广泛 ,
通常采用正交设计法 ,但该法仅对实验所选取的因素水平进
行优化选择 ,不能在给出的整个区域上找到考察因素的最佳
细化值。而响应面分析法作为一种新的统计方法 , 可通过中
心组合实验 ,研究多种因素间的交互作用 , 并能从图形方面分
析寻求最佳的实验考察因素细化值[ 11] 。因此 , 本实验采用响
应面分析法进行小鱼仙草总黄酮提取工艺的研究。结果实验
所确定的提取工艺具有提取得率高 、操作简便且成本较低等
特点 ,为小鱼仙草总黄酮生产工艺的优化及开发小鱼仙草植
物资源提供实验依据。
通常认为 ,提取溶剂越多 , 被浸提出来的物质就越多[ 12] 。
本实验曾对溶媒倍数进行单因素考察 ,结果表明 , 30 倍量时提
取得率最高 ,再增加溶媒倍数时反而下降。究其原因可能是
溶媒倍数增加至一定值后 ,乙醇与药材形成竞争体系 , 导致药
材对热能吸收减少 ,细胞破裂不完全 , 黄酮不能充分溶出[ 13] 。
同时 ,提取溶剂用量过大 , 会给过滤及蒸发浓缩工序增加困
难 ,并且增加生产成本。故最终确定溶媒倍数以 20 ～ 40 倍量
作为考察水平。
　　本实验曾考察了提取溶剂 、提取温度等单因素对提取工
艺的影响。据文献报道 , 当乙醇浓度在 60 ～ 80%时 ,药材有效
成分可最大溶出[ 14] , 本实验结果也证明 , 当乙醇浓度达到
70%时 ,小鱼仙草总黄酮提取得率最高;另一方面 , 随着提取
温度的提高 ,热力学运动加快 , 有利于药材有效物质的溶出 ,
但当温度接近沸点时 , 黄酮苷类成分的苷键易水解开裂 , 造成
了化学成分的改变[ 15] 。实验研究表明 , 当提取温度为 90℃时
总黄酮提取得率最高 , 因此实验最终确定以 70%乙醇作为提
取溶剂 ,提取温度以 90℃为佳。
参　考　文　献
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Optimisation for Flavonoids Extraction from Mosla Dianthera
Maxim.using Response Surface Method
Yan Yunliang , et al
(Zhej iang Universi ty o f Tradi tional Chinese Medicine , Hangzhou 310053)
Abstract　Objective:T o opt imize the ext raction conditions o f flavonoids f rom M osla dianthera M axim.
·196·
Journal o f Mathematical Medicine Vo l.23　　 No.2　　 2010
　收稿日期:2009-10-16　　　　　　　　　　　　　通讯作者:李红玉
　作者简介:曹洪昭(1983-), 辽宁医学院硕士研究生。研究方向:生药学。
Method:We take the solvent quantity , ex traction t ime and t imes of e xt ract ion as investigat ion facto rs to ex-
t ract the to tal flavonoids dete rm ined by the method o f spect rophotometry.The procedure fo r the ex t raction
w as performed wi th the ex t raction yield of to tal f lav onoids as the response.Response surface method(RSM)
was applied to determine the optimum extract ion technolo gy.Results:The optimum ex traction condi tion w as
as follow s:concentration o f alcohol 70%, ext raction 3 times , 1.9 hours each time , ratio of liquid to solid 20
at 90℃.The ext raction rate of flavonoids under this condi tion w as 8.50%.Conclution:The method to ex-
t ract f lav onoids f rom M osla dianthera M axim is simple and feasible.I t can provide the scient ific basis fo r fur-
ther development of M osla dianthera M axim.
Key words　Mosla dianthera.;f lavonoid;RSM
　　文章编号:1004-4337(2010)02-0197-03　　　中图分类号:R927.2　　文献标识码:A · 药学研究 ·
HPLC法测定万寿菊茎中叶黄素的含量
曹洪昭　　聂传平　　李红玉
(辽宁医学院药学院　锦州 121001)
摘　要:　目的:建立一种测定万寿菊茎中叶黄素含量的 HPLC 方法。方法:采用 Diam onsil-C18 色谱柱(200 mm ×4.6 mm , 5
μm),流动相:甲醇∶水=97.5∶2.5 ,流速:1.0 mL/min ,检测波长:445 nm。结果:叶黄素在 1.92～ 96μg/mL 范围内 ,有良好的线性
关系(r=0.999 6),平均回收率为 98.9%, RSD1.04%。结论:该法简便准确 、重现性好 ,可用于万寿菊茎中叶黄素的含量测定。
关键词:　万寿菊茎;　叶黄素;　高效液相色谱;　含量测定
doi:10.3969/ j.i ssn.1004-4337.2010.02.031
　　叶黄素(lutein)是胡萝卜素的衍生物 , 是一种优良的抗氧
化剂 ,在老年性黄斑退化病和白内障疾病防治方面具有重要
的作用[ 1 ,2] 。此外 ,叶黄素还具有预防心血管疾病 、抗癌和提
高机体免疫力等功能[ 3] 。 1g 叶黄素的价格与 1 g 黄金的价格
相同 ,因此又名“植物黄金” 。目前叶黄素主要从万寿菊干花
中提取 、检测 , 而对万寿菊茎中叶黄素含量的测定研究未见报
道。我国在新疆 、内蒙古 、黑龙江等地区建立了大面积的万寿
菊种植基地 ,但是大量的万寿菊茎 、叶被作为废弃物而未被利
用。因此 ,研究 、开发富含叶黄素的新天然资源 , 测定万寿菊
茎中叶黄素的含量具有重要的现实意义。同时 , 为广大万寿
菊种植者和加工企业变废为宝 ,做一点有益的探索。
1　仪器与试药
1.1　仪器
UV2550 紫外可见分光光度仪(日本岛津公司);RE-
5298A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);P680 型高效液相
色谱仪(戴安中国有限公司);SKQ-2200 超声波清洗器(上海
生析超声仪器有限公司);D2F-6050 真空干燥箱(上海精宏实
验设备有限公司)。
1.2　试药
实验所用万寿菊茎采自辽宁医学院药园 , 采摘后切碎 、洗
净 ,常温干燥至恒重 , 粉碎过 20 目筛以备用;叶黄素对照品
(上海顺勃生物工程技术有限公司 ,含量≥95%)。
2　方法与结果
2.1　对照品溶液的配制
精密称取叶黄素标准品 4.8 mg 置 25 mL 棕色容量瓶中 ,
用甲醇溶解并定容 , 摇匀。置于阴凉避光处保存。
2.2　供试品溶液得配制
2.2.1　提取　取万寿菊茎适量 , 研磨成粉末 , 过 20 目筛 , 称
取粉末 10 g 置于 500 mL 烧瓶中 ,加入石油醚∶无水乙醇(3
∶l)混合溶剂 250 mL , 提取温度 50℃, 超声振荡提取 20 min。
过滤 ,除去滤渣 ,将滤液置于分液漏斗中。 分离石油醚层 , 将
其旋转蒸发浓缩。
2.2.2　皂化　在浓缩液中加人 20%的氢氧化钾-甲醇溶液 5
mL , 60℃水浴加热 , 反应 6 小时。用 10%的盐酸调节 pH 值
至中性 ,过滤 , 滤渣用适量的冷水和正己烷洗涤。
2.2.3　重结晶　将 2.2.2 项下制得的滤渣溶于二氯甲烷中
制得饱和溶液 , 向饱和溶液中慢慢逐滴加入适量的正己烷 , 放
入冰箱中于 5℃静置过夜。次日 , 在 4000 r/ min 的条件下离
心 10 min , 得到的沉淀物用氮气吹干 , 用甲醇溶解于 100 m L
棕色容量瓶中 , 摇匀 ,得供试品溶液 , 阴凉避光保存。
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数理医药学杂志 2010 年第 23 卷第 2 期