全 文 ：Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术
2013年第2期
响应面分析法优化乳白香青中
绿原酸提取工艺
王 瑛1，2，张本印1，牛江进1，2，张 琳1，2，陶燕铎1，梅丽娟1，王启兰1，*
（1.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810008；
2.中国科学院研究生院，北京 100049）
摘 要：以乳白香青为原料，确定乳白香青中绿原酸最佳提取的工艺条件。在单因素实验的基础上，运用Box-Behnken
中心组合实验设计，建立绿原酸提取得率的二次回归模型，确定乳白香青中绿原酸的优化工艺条件为：提取温度为
41℃，液料比为31∶1（mL/g），甲醇浓度为66%（v/v），绿原酸的得率为5.2796（mg/g），接近于模型预测值5.3295（mg/g）。
关键词：乳白香青，绿原酸，响应面分析法，提取工艺
Optimization of extraction technology of chlorogenic acid from
Anaphalis lactea Maxim. by response surface methodology
WANG Ying1，2，ZHANG Ben-yin1，NIU Jiang-jin1，2，ZHANG Lin1，2，TAO Yan-duo1，
MEI Li-juan1，WANG Qi-lan1，*
（1.Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810008，China；
2.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）
Abstract：In order to promote the extractability of chlorogenic acid from Anaphalis lactea Maxim，we established
a quadric regression equation for predicting the yield of chlorogenic acid on the basis of one-factor tests，
according to Box-Behnken design. The result showed that the optimum conditions for the extraction of
chlorogenic acid were as follows：extraction temperature 41℃，ratio of material to solvent 31 ∶1（mL/g），Mthanol
concentration 66%（v/v）. Under these conditions，the chlorogenic acid yield was up to 5.2796（mg/g） which
was well matched with the predictive extracting yield 5.3295（mg/g）.
Key words：Anaphalis lactea Maxim；chlorogenic acid；RSM；extraction process
中图分类号：TS201.1 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2013）02-0238-04
收稿日期：2012－07－27 * 通讯联系人
作者简介：王瑛（1987-），女，硕士研究生，研究方向：天然药化。
基金项目：国家科技攻关项目（0713351614）；国家自然科学基金（31101012）。
乳白香青（Anaphalis lactea Maxim.）属菊科香青
属多年生草本植物，主要分布于青海东部、甘肃南部
及四川西北部，为常用藏药，全草用药，具有活血散
瘀、祛风湿、消痞瘤、平肝潜阳、祛痰、平喘及外用止
血、治风寒感冒、胃溃疡等功效[1-4]。绿原酸是乳白香
青中主要的生物活性物质之一，化学名称为3-咖啡
酰奎尼酸，分子式为C16H18O9[5]。绿原酸具有较强的生
理活性，如抗肿瘤、抗氧化 [6-8]、抗病毒 [9]、消炎 [10]、解
毒、利胆、降压降血脂和升高白细胞及显著增加胃肠
蠕动和促进胃液分泌等药理作用[11-13]，对大肠杆菌、金
色葡萄球菌、肺炎球菌和病毒有较强的抑制作用[14-15]。
绿原酸作为极具生物活性的天然物质，目前已被广
泛应用于医药、食品、日化等行业。我国虽然拥有富
含绿原酸的金花、杜仲等丰富的自然资源，国内外对
绿原酸的需求仍然较大。但截至目前，国内外文献还
没有对乳白香青中绿原酸提取工艺研究报道。鉴于
响应面法在优化反应条件、研究各因素之间相互作
用的过程中具有直观、简便的特点，如张崟等[16]就响
应面法与正交实验对骨素酶解工艺做了对比，结果
发现响应面法得出的最优工艺所得的水解度比正交
实验得出的最优工艺所得水解度高出15.4%。将响应
面法用于乳白香青绿原酸提取工艺的优化和结果分
析，对开发和利用乳白香青资源有重要意义。本研究
在单因素实验的基础上选择提取温度、液料比、甲醇
百分含量3个主要因素，用绿原酸标准品HPLC法绘
制标准曲线，以绿原酸得率为指标，采用响应面法对
乳白香青中绿原酸提取工艺进行了优化。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
乳白香青 2011年8月采自青海省门源县仙米
林场（N37°23’～37°50’，E101°46’～102°39’之间），经
中国科学院西北高原生研究所梅丽娟高级工程师鉴
定为乳白香青（Anaphalis lactea Maxim.）；绿原酸标
准品 购自中国药品生物制品检定所；试剂 除高
效色谱流动相用色谱纯外，其余均为分析纯；色谱用
水 超纯水。
238
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.02.029
工 艺 技 术
2013年第2期
Vol . 34 , No . 02 , 2013
Agilent 1200型液相色谱仪 美国安捷伦仪器有
限公司；XS105DU型电子天平 瑞士梅特勒托利多；
DFY-300型高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限
公司；HH-6型数显恒温水浴锅 国华电器有限公
司；UPT-Ⅰ-57型优普超纯水机 成都超纯水科技
有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 材料预处理 将乳白香青置于通风避光处阴
干至恒重，用中药粉碎机粉碎成细粉，过八十目筛，
备用。
1.2.2 色谱条件 色谱柱为 Phenomenex ODS
（150.0mm×4.6mm，35μm）色谱柱；流动相为乙腈-
0.3%磷酸（13 ∶87，V/V）；检测波长为327nm；柱温为
25℃；流速为1.0mL/min；进样量为10μL。
1.2.3 绿原酸标准曲线的绘制 精密称取绿原酸对
照品2.4mg，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，
得0.24mg/mL的对照品储备液。在液相中绿原酸标准
品进样量分别为5、8、10μL，以绿原酸标准品的质量
为纵坐标，以峰面积为横坐标绘制标准曲线。计算得
线性回归方程为：y=0.0004x-0.0088，r=0.9998，如图1
所示。结果表明，峰面积与绿原酸标准品的质量线性
关系良好。绿原酸对照品色谱图及乳白香青样品色
谱图如图2所示。
1.2.4 单因素实验设计 在进行响应面分析之前，
先通过单因素实验选出对乳白香青绿原酸提取得率
有影响的因素，并确定其实验水平。参考相关文献，
本文称取1.00g乳白香青粉末，考察了不同的液料比
（10 ∶1～50 ∶1）、提取温度（30～90℃）、甲醇提取浓度
（45～95%）、超声时间（5～30min）对绿原酸提取得率
的影响。
1.2.5 响应面法实验设计与数据分析方法 根据
Box-Benhnken实验设计原理，选择影响乳白香青绿
原酸得率（Y）的3个主要影响因素：提取温度（A）、液
料比（B）、甲醇浓度（C）进行组合。以-1、0、1代表自
变量水平，xi为自变量的编码值；Xi为自变量的真实
值；其关系为xi=（Xi－X0）/ΔX。其中，X0为实验中心点
处自变量的真实值；ΔX为自变量的变化步长[17]。实验
因素及水平编码见表1。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 液料比对绿原酸提取率的影响 设定甲醇浓
度为70%，提取温度为50℃，考察液料比对绿原酸提
取率的影响。设计液料比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、
50∶1。结果如图3所示。当料液比为30∶1时，绿原酸提
取得率基本不再增加。再增加液料比，绿原酸提取得
率基本稳定，但同时会增加生产成本。
2.1.2 提取温度对绿原酸提取率的影响 设定液料
比20∶1，乙醇体积分数为70%，考察提取温度对绿原
酸提取率的影响。设计提取温度为30、40、50、60、70、
80、90℃。结果如图4所示，绿原酸提取率温度升高而
增加，当温度升高至时40℃，绿原酸提取得率最高；40~
60℃时绿原酸提取率平稳；随后提取率急剧降低。
2.1.3 甲醇浓度对乳白香青中绿原酸提取率的影响
设定液料比20∶1，提取温度50℃，考察甲醇浓度对
绿原酸提取率的影响。设计甲醇体积分数为45%、
55%、65%、75%、85%、95%，结果如图5所示。绿原酸
图3 液料比对绿原酸提取率的影响
Fig.3 Effect of liquid to solid ratio on extraction rate of
chlorogenic acid yield
液料比（mL/g）
0∶1 10∶1 20∶1 30∶1 40∶1 50∶1 60∶1
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
绿
原
酸
得
率
（
m
g/g
）
图1 绿原酸标准曲线
Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid
峰面积（mAU）
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
绿
原
酸
含
量
（
μg
）
因素
水平
-1 0 1
A 提取温度（℃） x1 30 40 50
B 液料比（mL/g） x2 20∶1 30∶1 40∶1
C 甲醇浓度（%） x3 55% 65% 75%
编码值
表1 Box-Behnken设计因素水平及编码
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
图2 绿原酸对照品（A）及乳白香青样品（B）HPLC图
Fig.2 HPLC chromatogram of chlorogenic acid reference
substance（A）and samples（B）of Anaphalis lactea Maxim.
时间（min）
2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5
140
120
100
80
60
40
20
0
m
AU
A
3.6
58
18
.8
42
2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5
100
80
60
40
20
0
m
AU
B
3.6
47
18
.8
44
9.4
55
20
.5
01
23
.6
18
时间（min）
239
Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术
2013年第2期
提取率随甲醇浓度增加而增加，当甲醇体积分数为
65%时，绿原酸提取率最高，甲醇浓度大于65%时，绿
原酸提取得率下降。
2.2 响应面法实验数据分析
对乳白香青中绿原酸提取工艺进行响应面分
析，其具体实验方案及结果见表2，方差分析结果见
表3。
采用Design-Expert 8.05软件对各因素进行回归
拟合，得到绿原酸得率回归方程：
Y=5.26+0.18A+0.38B+0.17C+0.094AB+0.13AC+
0.23BC-0.46A2-0.54B2-0.48C2-0.080A2B。
模型的可靠性可从方差分析及相关系数来考察
（见表3）。结果表明对绿原酸提取量所建立的二次多
项模型具有显著性。因而该模型拟合程度比较好，实
验误差小，可以用此模型对甲醇提取乳白香青中绿
原酸的提取量进行分析和预测。模型方程回归系数
及其显著性检验（见表3）。结果表明，一次项A、C显
著，B极显著；二次项A2、B2和C2极显著；交互项AB、
AC不显著，BC显著。
2.3 响应面分析和因素间的交互影响
实验号 A B C Y 绿原酸得率（mg/g）
1 -1 -1 0 3.8356
2 1 -1 0 4.0912
3 -1 1 0 4.2402
4 1 1 0 4.872
5 -1 0 -1 4.0002
6 1 0 -1 4.0259
7 -1 0 1 4.3526
8 1 0 1 4.8924
9 0 -1 -1 4.0456
10 0 1 -1 4.3482
11 0 -1 1 3.6708
12 0 1 1 4.8752
13 0 0 0 5.2557
14 0 0 0 5.254
15 0 0 0 5.2539
16 0 0 0 5.2706
17 0 0 0 5.2644
表2 Box-Behnken实验因素水平及设计方案和结果
Table 2 Box-Behnken experimental design and results
项 平方和 自由度 均方 F值 p值
Model 5.17678 9 0.575198 23.92012 0.0002
A 0.263865 1 0.263865 10.97306 0.0129
B 0.906127 1 0.906127 37.68212 0.0005
C 0.234989 1 0.234989 9.772247 0.0167
AB 0.035382 1 0.035382 1.471376 0.2645
AC 0.066075 1 0.066075 2.747776 0.1414
BC 0.203311 1 0.203311 8.454864 0.0227
A2 0.885735 1 0.885735 36.8341 0.0005
B2 1.234517 1 1.234517 51.33852 0.0002
C2 0.984111 1 0.984111 40.92514 0.0004
残差 0.168326 7 0.024047
失拟项 0.168112 3 0.056037 1045.53 0.1001
纯误差 0.000214 4 5.36E-05
总离差 5.345106 16
表3 回归统计分析结果
Table 3 Regression analysis
注：p<0.05，显著；p<0.01，极显著。
5.5
B：液料比
5
4.5
4
3.5
20.00
25.00
35.00
30.00
40.00
A：提取温度30.00
40.00
50.00
35.00
45.00
5.4
绿
原
酸
提
取
得
率
（
m
g/g
）
C：提取浓度 55.00
60.00
70.00
65.00
75.00
A：提取温度30.00
40.00
50.00
35.00
45.00
5.2
5
4.8
4.6
4.4
4.2
4
绿
原
酸
提
取
得
率
（
m
g/g
）
5.5
5
4.5
4
3.5
B：液料比20.00
30.00
40.00
25.00
35.00
绿
原
酸
提
取
得
率
（
m
g/g
）
C：提取浓度 55.00
60.00
70.00
65.00
75.00
图6 AB、AC和BC分别对绿原酸提取率影响的响应面图
Fig.6 The response surface of AB，AC and BC on
extraction rate of chlorogenic acid
图4 不同温度对绿原酸提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of
chlorogenic acid
提取温度（℃）
0 20 40 60 80 100
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
绿
原
酸
得
率
（
m
g/g
）
图5 甲醇浓度对绿原酸提取率的影响
Fig.5 Effect of methanol concentration on extraction rate of
chlorogenic acid
甲醇百分含量（%）
0 20 40 60 80 100
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
绿
原
酸
得
率
（
m
g/g
）
240
工 艺 技 术
2013年第2期
Vol . 34 , No . 02 , 2013
根据拟合模型绘制乳白香青绿原酸的响应面
图，可直观地看出响应面的最高点，即参数范围内的
极值以及因素间的相互作用对响应值的影响，依次
可以确定最佳工艺参数范围。Design-Expert 8.05软
件处理后三维响应面图见图6。
通过模型方程所作的响应曲面图，可直观地描
述各因素对响应值（绿原酸含量）的影响和各个因素
间的交互作用。由图6可以看出，响应曲面均是开口
向下的凸面，等高线近似为圆形，其中心位于所考察
区域内，说明在考察的区域范围内存在响应值的极
大值，同时响应面为突出的曲面，即简单的一次线性
方程难以解析。
通过Design-Expert 8.05软件分析各因素对乳白
香青中绿原酸得率的影响得出结论，甲醇提取乳白
香青绿原酸的最佳条件为提取温度41.33℃、甲醇浓
度66.33%和液料比31.33∶1。在此条件下绿原酸提取
量可达5.3295mg/g。为检验响应面法的可靠性，采用
上述最优提取条件进行乳白香青中绿原酸甲醇提取
实验，同时考虑到实际操作的情况，将乳白香青绿原
酸最佳提取条件修正为提取温度41℃、甲醇浓度
66%、液料比 31 ∶1，实际测得的绿原酸含量为
5.2796mg/g，与理论预测值基本吻合。因此，采用响应
面法优化得到的乳白香青中绿原酸甲醇提取工艺参
数基本准确可靠，具有一定的实用价值。
3 结论与讨论
乳白香青成分复杂，采用紫外分光光度法测定[18]
时杂质干扰严重，无法对其活性成分绿原酸进行定
量分析。本实验参考文献[19]采用HPLC法并进行优
化，以乙睛-0.3%磷酸溶液（13∶87）为流动相，分离度
好、重现性好、操作简便、数据可靠，可用于乳白香青
中绿原酸含量的质量控制。
本文在单因素实验的基础上，采用响应面法对
乳白香青绿原酸提取工艺进行了优化，结果表明，各
因素指标之间的关系不是简单的线性关系，而是二
次关系。从本次实验数据所绘制的曲面图可以看出，
提取温度、液料比、甲醇浓度3个因素对乳白香青中
绿原酸成分提取率的效应趋势，液料比对考察指标
影响较大，提取温度与提取浓度对考察指标的影响
较小。通过回归方程优化得乳白香青中绿原酸的最
佳提取工艺为：提取温度41℃，料液比31∶1，甲醇浓度
为66%，此条件下乳白香青中绿原酸平均提取得率
为5.2796mg/g，高于优化前的提取率3.8356mg/g。响
应面法优化乳白香青中绿原酸提取率比优化前提高
了27.40%。回归分析和验证实验结果表明，采用响应
面法优化乳白香青中绿原酸的提取工艺条件，得到
的绿原酸提取工艺流程具有实际应用价值。
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