全 文 ：第 33 卷 第 5 期
2011 年 9 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol． 33，No． 5
Sep．，2011
收稿日期:2010--12--08
基金项目:中央高校基本科研业务费专项(YX2010--31)。
第一作者:穆琳，主要研究方向:植物学。电话:010--62337159 Email:lily77@ 126. com 地址:100083 北京市清华东路 35 号北京林业大
学招生就业处。
责任作者:谢磊，博士。主要研究方向:植物分类学。电话:010--62338492 Email:xielei_si@ 126. com 地址:100083 北京市清华东路 35
号北京林业大学树木系统进化与生物地理学研究室。
本刊网址:http:∥ journal． bjfu． edu． cn
槭叶铁线莲的系统位置初探
———来自 ITS和叶绿体 DNA序列片段的分析
穆 琳1 谢 磊2
(1 北京林业大学招生就业处 2 北京林业大学树木系统进化与生物地理学研究室)
摘要:槭叶铁线莲是分布于北京附近低山峭壁之上的特有濒危植物，其分布区域狭窄。在传统分类处理中将槭叶
铁线莲置于绣球藤组中，但是其形态特征、地理分布及生长环境与组中其他种类有较大差异。本文根据核核糖体
DNA 中的 ITS 序列片段和 3 个叶绿体 DNA 序列片段(atpB-rbcL 间隔区、psbA-trnQ 间隔区和 rpoB-trnC 间隔区) ，采
用最大简约法(MP)和贝叶斯法(Bayes)构建铁线莲属系统发育关系，从而探讨槭叶铁线莲在属中的系统位置问
题。结果表明:1)单独的 ITS 片段和叶绿体片段分析所得到的系统树分辨率较低，而合并分析可以得到相对较高
的分辨率和支持率。2)铁线莲属与锡兰莲属共同组成一单系类群，二属应予以合并。3)槭叶铁线莲并不与绣球藤
组植物聚为一支，从而并不支持现在的分类学处理。4)槭叶铁线莲表现出比较孤立的系统位置，表明该种可能是
本属中分布于北温带古老类群的孑遗。
关键词:槭叶铁线莲;系统位置;ITS;atpB-rbcL;psbA-trnQ;rpoB-trnC
中图分类号:S718. 49 文献标志码:A 文章编号:1000--1522(2011)05--0049--07
MU Lin1;XIE Lei2. A preliminary study on the systematic position of Clematis acerifolia based on
the analyses of ITS and plastid regions． Journal of Beijing Forestry University (2011)33(5)49--55
［Ch，25 ref．］
1 Recruitment ＆ Career Office，Beijing Forestry University，100083，P． R． China;
2 Laboratory of Systematic Evolution and Biogeography of Woody Plants，College of Biological Sciences
and Biotechnology，Beijing Forestry University，100083，P． R． China．
Clematis acerifolia is a critically endangered species endemic to an extremely narrow distribution
range in Beijing Municipality． This species is often found on the vertical cliffs in gorges of Fangshan and
Mentougou districts． Although most of the taxonomic treatments placed it into Sect． Cheiropsis， its
systematic position has never been tested by the molecular evidence． To access the systematic position of
C． acerifolia，sequences of the ITS，the plastid atpB-rbcL spacer，psbA-trnQ spacer and rpoB-trnC spacer
regions from the whole genus were analyzed using parsimony and Bayesian inference methods． The results
showed that:1)relatively low resolution and support values were obtained in the separate analyses but
were enhanced in the combined data analyses;2)Clematis together with Naravelia formed a clade and
these two genera should be merged;3) traditionally taxonomic treatment of C． acerifolia was not
supported and this species may not be a member of Sect． Cheiropsis;4)the position of C． acerifolia was
detected to be isolated in the genus and it may represent a relic species of Holarctic Clematis．
Key words Clematis acerifolia;systematic position;ITS;atpB-rbcL;psbA-trnQ;rpoB-trnC
槭叶铁线莲(Clematis acerifolia Maxim．)为北京
地区特有种［1］。该种植物体型矮小，高 30 ～ 60 cm，为
直立小灌木，叶为单叶，与花簇生，五角形，花萼片 5 ～
8，白色或带粉红，雄蕊无毛，子房有柔毛。该种植物
多见于北京西南的门头沟区及房山区低山地带的悬
崖峭壁之上［1
--2］。由于分布区极其狭小，种群数量不
多，该种植物已被列为北京市一级保护植物。
《中国植物志》第 28 卷根据花与叶簇生这一性
DOI:10.13332/j.1000-1522.2011.05.001
状将槭叶铁线莲置于绣球藤组中［1］。Wang 等［3--4］
在最近的铁线莲属分类修订中，将槭叶铁线莲仍置
于绣球藤组(Sect． Cheiropsis)之中，并建立了一个单
型亚组槭叶铁线莲亚组(Subsect． Acerifoliae)。然
而，槭叶铁线莲的许多形态特征，如直立灌木习性、
掌状单叶、花萼的数目与形态，以及其分布区与生
长环境不仅在绣球藤组中而且在整个铁线莲属中
都十分独特。从形态上看，绣球藤组植物多为大型
木质藤本植物，具有一至二回三出或羽状复叶［3
--4］。
从分布区上看，其他绣球藤组植物分布于我国西
南、日本、欧洲地中海地区［3］，而并不与槭叶铁线莲
的分布区重合。槭叶铁线莲与绣球藤组其他种类
植物在形态与地理分布上的显著差异，显示该种为
绣球藤组的一个异质成员。尽管传统处理把该种
植物置于绣球藤组之中，但是其系统位置十分可疑。
近年来，DNA 序列分析已广泛应用于植物类群
的系统发育关系的研究中［5
--8］。Miikeda 等［9］曾利用
核核糖体 DNA 的 ITS 片段和叶绿体 DNA 片段构建
整个铁线莲属系统发育，然而槭叶铁线莲并没有包括
在他们的分析中。迄今为止，利用分子系统学手段探
讨槭叶铁线莲在属中的系统位置的工作尚未开展。
本研究拟在 Miikeda 等对于整个铁线莲属分子系统
发育研究的基础上，加入槭叶铁线莲的 DNA 序列进
行分析，讨论该濒危植物的系统位置问题。
1 材料与方法
1. 1 材料来源
槭叶铁线莲实验材料来自野外硅胶干燥的新鲜
叶片。属中其他种类的选取根据 Miikeda 等［9］对于
全属的系统发育分析，序列均来自 GenBank。本研究
选取的样品代表了铁线莲属的所有 4 个亚属和全部
组［10］。所有序列材料来源及凭证标本信息见表 1。
1. 2 实验设计
本研究选取一个核核糖体 DNA 片段 ITS 和 3
个叶绿体序列片段 atpB-rbcL 间隔区、psbA-trnQ 间隔
区和 rpoB-trnC 间隔区。各个片段的扩增及测序引
物均来自 Miikeda 等［9］的研究。
植物总 DNA 提取采用常规 CTAB 法［11］。采用
聚合酶链式反应 (PCR)扩增上述目地片段。扩增
反应采用 25 μL 反应体系，包括 10 ng 植物总 DNA，
两端引物各 4 pmol，0. 5 U Taq 聚合酶 (Bioline) ，
2. 5 mmol /L MgCl2。PCR 反应在 PTC-225 Peltier 温
度循环仪上进行。温度循环程序如下:95 ℃热启动
5 min，32 循环的 94 ℃变性，30 s;50 ℃退火，40 s;
72 ℃延伸，60 s，最后 72 ℃延伸 10 min。PCR 反应
产 物 采 用 Gel Extraction Mini Kit (Watson
Biotechnologies，Inc．)试剂盒纯化。测序反应采用
ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction kit (Applied Biosystems，Foster City，
California，USA)。测序反应体系如下:5 ng 单侧引
物，1. 0 μL 测序反应混合液，总体系 10 μL。测序
反应温度循环程序为:30 循环的 96 ℃，30 s;50 ℃，
30 s;60 ℃，4 min。反应产物用 ABI 3730xl DNA
analyzer (Applied Biosystems，Foster City，California，
USA)测序仪测序。每个片段均对双向进行测序。
DNA 序列利用 Sequencher 4. 5 (GeneCodes，Ann
Arbor，Michigan，USA)进行校对。
校对好的序列使用 ClustalX 软件进行排序［12］，
并使用 Se-Al 2. 0 (http:∥ evolve． zoo． ac． uk)手工
修正排序错误。根据以前的研究结果，ITS 序列中
无法排序的区段不参与系统发育分析［9］。
1. 3 系统发育分析
对于每一个 DNA 区段的数据 矩 阵，利 用
Modeltest 3. 7 检测其分子进化模型［13］。模型选择
采用 AIC(Akaike information criterion)方法［14］。所
选模型用于其后的 Bayes 系统发育分析。
非一致性长度检测(ILD)用于检测各个 DNA 区
段之间的一致性，以决定不同 DNA 区段是否可以联
合分析［15］。该分析中，只考虑各个 DNA 区段信息位
点区，采用 100 循环启发式搜索，每循环存储 100 棵
简约树［16］。当 ILD 检测结果 P≥0. 05 时，我们认为
不同序列数据之间没有显著冲突，可以合并分析。然
而此方法近年来受到了批评，认为对数据间一致性检
测过于苛刻［17
--18］。因此本研究还采取了直接观察对
比 ITS 和叶绿体区段所构系统树的各个分支是否有
显著冲突的方法，来决定数据之间是否可以联合分
析。此方法近年来被许多研究所采用［19--21］。
系统发育分析采用简约法(Parsimony)和贝叶
斯法 (Bayes)。简约分析使用 PAUP* 4. 0b10［22］，
采用启发式搜索(heuristic searches)方法。启发式
搜索采用 1 000 循环。所有序列位点不加权，对插
入缺失部分进行编码(作为 0，1 性状处理)。系统
树各分支的支持率计算，采用靴带分析(bootstrap)
方法［23］。每个分析均采用1 000次循环，每循环最
少存储 100 棵简约树。Bayes 法使用前述检测的分
子进化模型，利用 MrBayes 3. 1. 2［24］软件完成。对
于合并的多基因片段分析，分子进化模型分别定
义［25］。Bayes 分析运行2 000 000代的 1 冷马尔可夫
链和 3 逐渐增温的热马尔可夫链 (Markov chain
Monte Carlo) ，每经过 100 代取一棵树。同一分析重
复 2 次以避免错误结果。马尔可夫链是否稳定采用
likelihood 值与运行代数相关性曲线图来确定。
05 北 京 林 业 大 学 学 报 第 33 卷
表 1 材料来源与 GenBank 检索号
Tab． 1 Origin of materials and GenBank accession numbers
植物种 标本信息 材料来源
GenBank 检索号
(nrITS:atpB-rbcL:trnQ-psbA:rpoB-trnC)
Clematis acerifolia Maxim． Shi 051 (PE) 中国北京市房山区
C． afoliata Buchanan Miikeda 98--05 新西兰阿卡罗阿 AB120193:AB115443:AB117586:AB116890
Archichlematis alternata Kitam． et Tamura Miikeda 97--04 尼泊尔 AB120190:AB115440:AB117582:AB116887
C． angustifolia Jacq． Miikeda 98--08 日本 AB120199:AB115449:AB117591:AB116896
C． apiifolia DC． Miikeda 97--02 日本 AB120180:AB115430:AB117572:AB116877
C． brachyura Maxim． Miikeda 99--06 韩国 AB120204:AB115454:AB117596:AB116901
C． crassifolia Benth． Yukawa 98--51 日本 AB120194:AB115444:AB117585:AB116891
C． delavayi Franch． SICH1332 中国四川稻城县 AB120202:AB115452:AB117594:AB116899
C． eichleri Tamura Tamura s． n． 泰国清迈 AB120209:AB115459:AB117601:AB116906
C． fasciculiflora Franch． Tsukuba Bot． Gard． 118663 中国 AB120203:AB115453:AB116900:AB117595
C． florida Thunb． Miikeda 96--06 日本 AB120186:AB115436:AB117578:AB116883
C． fusca Turcz． Miikeda 96--01 日本北海道 AB120179:AB115429:AB117571:AB116876
C． gentianoides DC． Miikeda 99--02 澳大利亚塔斯马尼亚 AB120210:AB115460:AB117602:AB116907
C． japonica Thunb． Miikeda 99--03 日本东京 AB120187:AB115437:AB117579:AB116884
C． lasiandra Maxim． Miikeda 96--04 日本 AB120185:AB115435:AB117577:AB116884
C． lasiantha Nutt． ex Torr． et A． Gray Miikeda 99--01 美国加利福尼亚 AB120200:AB115450:AB117592:AB116897
C． ligusticifolia Nutt． ex Torr． et A． Gray
Regional Parks Bot． Gard．，
Berkeley 85. 22 美国加利福尼亚
AB120201:AB115451:AB117593:AB116898
C． nobilis Nakai Miikeda 99--04 韩国 AB120206:AB115456:AB117598:AB116903
C． ochotensis (Pall．)Poir． Miikeda 96--02 日本北海道 AB120182:AB115432:AB117574:AB116879
C． orientalis L． Mikanagi s． n． 中国新疆 AB120196:AB115446:AB117588:AB116893
C． patens Morr． et Decne． Miikeda 98--04 日本 AB120184:AB115434:AB117576:AB116881
C． pierotii Miq． Miikeda 00--01 日本 AB:120191:AB115441:AB117583:AB116888
C． potaninii Maxim．
Royal Bot． Gard．
Edinburgh 19913243 中国
AB120198:AB115448:AB117590:AB116895
C． serratifolia Rehd． Miikeda 99--05 韩国 AB120205:AB115455:AB117597:AB116902
C． stans Sieb． et Zucc． Miikeda 96--03 日本东京 AB120188:AB115438:AB117580:AB116885
C． tangutica (Maxim．)Korsh． Miikeda 02--94 日本 AB120195:AB115445:AB117587:AB116892
C． tashiroi Maxim． Miikeda 01--01 日本 AB120192:AB115442:AB117584:AB116889
C． terniflora DC． Miikeda 02--95 日本东京 AB120183:AB115433:AB117575:AB116880
C． texensis Buckley Miikeda 98--07 美国德克萨斯 AB120197:AB115447:AB117589:AB116894
C． uncinata var． ovatifolia(T． Ito)Ohwi Miikeda 97--03 日本 AB120189:AB115439:AB117581:AB116886
C． villosa DC． Saunders s． n． 南非 AB120211:AB115461:AB117603:AB116908
C． vitalba L． Tsukuba Bot． Gard． 123918 比利时 AB120207:AB115457:AB117599:AB116904
C． williamsii A． Gray Miikeda 98--03 日本 AB120181:AB115431:AB117573:AB116878
Hepatica nobilis var． japonica Nakai Miikeda 98--02 日本 AB120214:AB115464:N /A:AB116911
Knowltonia sp． Shiraishi s． n． 南非 AB120215:AB115465:AB117606:AB116912
Pulsatilla cernua (Thunb．)Berchet．
＆ J． Presl．
Tsukuba Bot． Gard． accession
number 12458 日本
AB120213:AB115463:AB117605:AB116910
Anemone flaccida Fr． Schmidt Miikeda 97--01 日本 AB120212:AB115462:AB117604:AB116909
Naravelia laurifolia Wall． ex Hook． f．
et Thomson
Tamura 20000 泰国 AB120208:AB115458:AB117600:AB116905
Bayes 树的前2 000 ～ 5 000棵作为烧入(burn-in)弃
掉不用，剩余的树做 50% 多数一致树，所得数值即
为后选概率值(posterior possibility)。
2 结果与分析
2. 1 各个 DNA 片段信息
所有用于分析的序列的基本参数和最大简约
分析基本参数见表 2。在 ITS 区段中有 53 碱基长度
的区段无法准确排序，因而在系统发育分析中去
除。Hepatica 属材料无法获得 psbA-trnQ 间隔区［9］，
因此本研究中将此种的该数据作为缺失数据处理。
在所有片段中，ITS 的变异水平明显高于叶绿体区
段，然而最大简约分析的一致性指数叶绿体区段明
显高于 ITS 区段。
2. 2 系统发育树
采用最大简约法所得到的系统发育树与采用
Bayes 方法所得到的树形一致，故此本研究只提供
最大简约法提供的树形，并将 Bayes 分析的后选概
率值标注于最大简约树上。单独的 ITS 和叶绿体区
段分析得到的系统发育树分辨率和支持率都很低
(图 1、2) ，尤其在树的近根部。非一致性长度检测
(ILD)结果 P = 0. 01，表明 ITS 与叶绿体区段直接
15第 5 期 穆 琳等:槭叶铁线莲的系统位置初探———来自 ITS 和叶绿体 DNA 序列片段的分析
表 2 用于分析的 DNA 区段统计参数
Tab． 2 Statistics from phylogenetic analyses of individual and combined data sets
核 DNA
ITS
叶绿体 DNA
atpB-rbcL rpoB-trnC trnQ-psbA 叶绿体联合数据
联合数据
排序后长度 726 883 1 399 647 2 929 3 655
缺失数据百分比 /% 0 0 0 2. 6 0. 58 0. 47
删除的无法排序区段长度 53 0 0 0 0 53
编码插入缺失数量 40 83 46 78 207 247
变异位点数 227 201 247 225 673 900
信息位点数与百分比 121(17. 0%) 88(10. 0%) 79(5. 6%) 76(11. 7%) 243(7. 7%) 364(9. 5%)
最大简约树数量 89 567 12
简约树步长 448 935 1423
一致性指数 (CI) 0. 63 0. 76 0. 70
保持性指数 (RI) 0. 63 0. 64 0. 59
分子进化模型 GTR + I + G K81uf + I + G TVM + I + G GTR + I + G TVM + I + G GTR + I + G
图 1 基于 ITS 序列采用最大简约法获得的 50%多数一致树
Fig． 1 Fifty percent majority rule consensus tree of the maximum parsimony analysis on the ITS sequences
注:靴带分析支持率(%)标于分支下方，Bayes 后选概率值标于分支上方，支持率不足 50 的用“—”表示。亚属名称缩写:Cam．
Campanella、Fla． Flammula、Vio． Viorna、Cle． Clematis;组 名 称 缩 写:Cle． Clematis、Tub． Tubulosae、Las． Lasiantha、Beb． Bebaeanthera、
Che． Cheiropsis、Pse． Pseudanemone、Cam． Campanella、Nar． Naraveliopsis、Mec． Meclatis、Fla． Flammula、Pte． Pterocapa、Vit． Viticella、
Asp． Aspidanthera、Atr． Atragene。Subgen．亚属;Outgroups．外群体。下同。
25 北 京 林 业 大 学 学 报 第 33 卷
图 2 基于 3 个叶绿体(atpB-rbcL，psbA-trnQ，rpoB-trnC)序列采用最大简约法获得的 50%多数一致树
Fig． 2 Fifty percent majority rule consensus tree of the maximum parsimony analysis on three plastid sequences
(atpB-rbcL，psbA-trnQ，and rpoB-trnC)
存在一定的冲突。然而通过树形比较，两棵树中具
有强支持率的分支并不矛盾，因此仍然对它们进行
了合并分析。
ITS 分析中，槭叶铁线莲的系统位置并没有得
到统计分析支持，而绣球藤组的滑叶藤 (Clematis
fasciculiflora)则最早从属中分化出来(图 1)。叶绿
体区段分析表明，槭叶铁线莲和黄花铁线莲组
(Sect． Meclatis )的 种 类 (C． serratifolia、C．
tangutica、C． orientalis)聚为一支，但是支持率非常
低。在叶绿体区段分析中槭叶铁线莲仍不与绣球
藤组的滑叶藤聚在一起。联合数据分析表明(图
3) ，虽然在树的根部仍然没有很强的支持率，但是
联合分析所得系统树分辨率与支持率明显高于单
独分析。联合分析表明槭叶铁线莲仍不与绣球藤
组的滑叶藤聚为一支，而是与黄花铁线莲组和长瓣
铁线莲组(Sect． Atragene)的种类聚在一起，只是支
持率仍然不高。
3 讨 论
3. 1 铁线莲属系统发育
本研究在 Miikeda 等研究基础上加入槭叶铁线
莲进行分析，所得到的系统发育树总体上与以前的
研究结果一致［9］。本研究结果表明，以前承认的一
些属如互叶铁线莲属 (Archiclematis)、锡兰莲属
(Naravelia)等聚入铁线莲属内部，这与前人研究结
果相吻合。
本研究结果显示，ITS 变异水平高于叶绿体区
段，但无论是对 ITS 和叶绿体区段的单独分析还是
35第 5 期 穆 琳等:槭叶铁线莲的系统位置初探———来自 ITS 和叶绿体 DNA 序列片段的分析
图 3 基于联合数据采用最大简约法获得的 50%多数一致树
Fig． 3 Fifty percent majority rule consensus tree of the maximum parsimony analysis on the combined data set
对联合数据的分析都没有很好地解决铁线莲属属
下种间关系问题。另外，分子系统学结果与形态分
类有很大的矛盾。这些都与 Miikeda 等的研究结果
吻合。同时，无论是 ITS 还是叶绿体区段变异水平
都总体偏低，这也支持了铁线莲属物种经历了短时
间内快速分化的假说［9］。
3. 2 槭叶铁线莲系统位置初探
槭叶铁线莲在传统分类上根据其花叶簇生这
一性状被置于绣球藤组［3
--4］。然而，该种植物其他
性状与绣球藤组植物非常不同。槭叶铁线莲为矮
小灌木，单叶掌状裂，萼片常多于 4 枚。这些性状在
整个铁线莲属中都是非常特殊的。其生长环境在
属中更是独一无二。槭叶铁线莲多见于北京西南
部低山地区的峭壁上，俗称“岩花”。从地理分布区
上看，分布于中国的绣球藤组植物全部见于我国西
南至中西部地区，槭叶铁线莲的分布区远离绣球藤
组其他种类。这些都表明槭叶铁线莲也许与绣球
藤组其他植物并不具有很近的亲缘关系。
另外，铁线莲属种类众多，形态变异极端复杂。
花序类型与着生位置在整个属中虽被应用为重要
分组性状［3］，但是这一性状在属中也存在着许多平
行演化和趋同演化现象。例如，除了绣球藤组植
物，在合柄铁线莲组 (Sect． Viorna)中也有一些植
物存在花序簇生与老枝叶腋的种类。可见，单凭花
序形态性状忽略其他形态性状和地理分布等信息
将槭叶铁线莲置于绣球藤组中也许并不适宜。
联合数据的系统发育分析表明，槭叶铁线莲并
不与绣球藤组其他种类 (滑叶藤 C． fasciculiflora)
具有很近的亲缘关系 (图 3)。其系统位置似与黄
花铁线莲组和长瓣铁线莲组植物更为相近，但是本
研究所得到的系统树的支持率并不高。从形态学
角度看，槭叶铁线莲与这两组植物区别明显。黄花
铁线莲组和长瓣铁线莲组植物雄蕊花丝有毛，萼片
斜展或直立，而槭叶铁线莲萼片平展，花丝无毛。
45 北 京 林 业 大 学 学 报 第 33 卷
这说明槭叶铁线莲也许在属中具有十分孤立的系
统位置。从槭叶铁线莲独特的形态特征、适生环境
和地理分布以及分子系统学位置来看，将该种植物
解释为铁线莲属中分布于北温带古老类群的孑遗
种似乎更为合适。槭叶铁线莲在属中位置的确定，
还需要增加更多的实验材料和 DNA 序列片段做更
进一步的研究。
参 考 文 献
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(责任编辑 冯秀兰)
55第 5 期 穆 琳等:槭叶铁线莲的系统位置初探———来自 ITS 和叶绿体 DNA 序列片段的分析