全 文 ：2012 第十四卷 第一期 ★Vol.14 No.1
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
收稿日期：2012-01-13
修回日期：2012-02-13
＊ 北京市科技计划项目（D08080203640901）：羌活、石斛药材质量评价和分子生物学鉴定示范研究，负责人：陈士林。
＊＊ 通讯作者：何顺志，研究员，硕士生导师，主要研究方向：药用植物系统学研究，E-mail：hesz8899@126.com；姚辉，博士，副研究员，硕士生导
师，主要研究方向：中药资源可持续利用，Tel：010-57833194，E-mail：scauyaoh@sina.com；陈士林，本刊编委，教授，博士，中国医学科学院
北京协和医学院药用植物研究所所长，主要研究方向：中药资源学，E-mail：slchen@implad.ac.cn。
摘 要：通过比较各分子标记的 PCR扩增成功率、测序效率、种内与种间变异和鉴定成功率等指
标，考察 6 个分子标记（rbcL、matK、psbA-trnH、psbK-psbI、核 ITS 和 ITS2）及其组合对蜘蛛抱蛋属药
用植物的鉴定结果，评价不同标记在蜘蛛抱蛋属药用植物中的鉴定能力，确定适合该属鉴定的 DNA
分子标记。结果显示，对蜘蛛抱蛋属 11个种 20个样本进行分析，rbcL、matK、psbA-trnH、psbK-psbI序
列获得率较高，matK鉴定成功率在获得的单一序列中最高（85%），多序列组合在鉴定效率方面比单
一序列有所提高，其中 matK+psbK-psbI的鉴定成功率为 100%。因此，matK+psbK-psbI可用于蜘蛛抱
蛋属药用植物的鉴定。
关键词：DNA分子标记 蜘蛛抱蛋属 鉴定 matK+psbK-psbI
doi: 10.3969/j.issn.1674-3849.2012.01.005
蜘蛛抱蛋属 Aspidistra 隶属广义百合科 Lili－
aceae，主要产于亚洲东部的热带和亚热带地区，有着
较高的园林观赏价值，在民间多做药用，具有活血散
瘀、泄热利尿、续伤接骨、祛风止痛及清热止咳等功
效[1]。 目前全世界该属植物约 93种，其中中国有 67
余种，主要分布于我国长江流域以南各省区。广西产
的种数名列前茅，约 44 种，贵州分布的蜘蛛抱蛋植
物居第二，种数达 18种[2~6]。自 20世纪 80年代以来，
该属药用植物的研究备受我国植物学工作者的重
视，并对该属药用植物进行了形态分类学、细胞学、
孢粉学、分子生药学、植物地理学和群落学等系列卓
有成就的研究[7~10]。蜘蛛抱蛋属药用植物的花小，生长
于地表面，很不显眼，易被它物掩盖，且在同一居群
中开花的植株较少，花期短，带花标本采集困难，因
此在许多标本馆中多数无花，由于该属药用植物的
种间鉴别都依赖于花，而花的难以采集以及该属药
用植物营养器官和繁殖器官（花）变异较大，给分类
研究工作带来了很多困难，因此，至今为止对于该属
药用植物并没有较为系统的分类，虽然现在多辅以
细胞分类学、微形态研究和孢粉学进行鉴定，但效果
并不理想。陈士林等[11]提出构建中药资源可持续发展
体系之一就是要建立中药资源生物多样性保护研究
蜘蛛抱蛋属药用植物分子鉴定研究＊
□刘安莉 何顺志＊＊ （贵阳中医学院药学院 贵阳 550002）
姚 辉＊＊ 陈士林 宋经元
中国医学科学院
北京协和医学院
（ 药用植物研究所/濒危药材繁育国家工程实验室 北京 100193）
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世界科学技术—中医药现代化★专题讨论之一：中药资源可持续利用的技术研究
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平台，利用形态描述和分子标记分析相结合的方法
对保护物种进行遗传多样性评价，并对其进行有效
保护。而该属药用植物中巨型蜘蛛抱蛋 A. longiloba被
收入《中国植物红皮书》（第二册），划为易危植物[12]；何
顺志等 [5]发现的新种平塘蜘蛛抱蛋 A.Pingtangensis，
根据国际自然与自然资源保护联合会红色名录标准
（2001版）暂将其分划为濒危。
Hebert 等 [13]通过对 11 个门 13320 个物种的 COI
基因序列进行分析，认为 COI基因适合作为动物界
鉴定的标准基因。随后的研究发现 COI基因在植物
中的进化速率远比在动物中要慢，无法作为大多数
植物的鉴定基因，近年来许多学者对适合植物分子
鉴定的基因序列进行了积极的探索。2009年国际条
形码协会（Consortium for the Barcode of Life, CBOL）
植物工作组推荐 rbcL+matK 组合作为整个植物界鉴
定的通用序列[14]。同年 11月，在第三届国际 DNA条
形码会议上，ITS 和 psbA-trnH 序列也得到了专家们
的重视和认可。Kress等[15]和 Fazekas等[16]通过对多个
片段的分析，表明 psbA-trnH在扩增成功率和物种识
别率方面表现最好。陈士林课题组通过对药用植物
及近缘种的 4800个物种 6600个样本进行研究，发现
ITS2 序列在物种水平的鉴定成功率超过
90%，提出 ITS2 可作为通用序列用于药
用植物的鉴定 [17~19]。大量实验证明，在植
物界中很难找到像 COI 一样的一段序列
来区分所有物种，所以许多学者提出了多
序列组合的方式，如 rpoC1、matK 和 ps－
bA-trnH；psbA-trnH 和 rbcL；matK、atpF -
atpH 和 psbA-trnH 或 matK、atpF-atpH 和
psbK-psbI等[15，20，21]。
本研究以蜘蛛抱蛋属药用植物的 11
种 20 个样品为实验对象，考察 6 个 DNA
分子标记 rbcL、matK、psbA -trnH、psbK -
psbI、核 ITS 和 ITS2 的鉴定效果，探讨适
合该属药用植物鉴定的 DNA 分子标记，
为建立蜘蛛抱蛋属药用植物鉴定的新方
法提供依据，并为该属药用植物资源的可
持续发展奠定基础。
一、材料与方法
1. 材 料
研究材料涉及百合科蜘蛛抱蛋属 11
种 20个样品，实验材料采集地点见表 1。采集样本经
贵阳中医学院何顺志研究员鉴定，凭证标本保存于
贵阳中医学院标本馆，活体材料栽种于贵阳药用植
物园。
2． 方 法
（1）样品 DNA的提取、PCR扩增和测序。
选取硅胶干燥植物叶片约 20 mg，用 DNA提取研
磨仪（Retsch MM 400,Germany）研磨 2 min（30 r·s -1）
后，使用植物 DNA 提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，
China）提取总 DNA。PCR反应体积为 25 μL，体系包含
PCR buffer 2.5 μL（10×）、MgCl2 2.0 μL（25 mmol·L-1）、
dNTP 2.0 μL（2.5 mmol·L-1）、引物各 1.0 μL（2.5
μmol·L-1）、Taq聚合酶 1.0 U、总 DNA1.0 μL（约 30 ng），
加灭菌水补足 25 μL。各个标记的扩增引物及扩增程
序见表 2。扩增产物经纯化后，使用 ABI3730XL测序
仪（Applied Biosystems Co.,USA）测序。
（2）数据分析。
测序峰图采用序列拼接软件 CodonCode Aligner
V 2.06（CodonCode Co.，USA）校对拼接，去除低质量
序列及引物区，所得各序列经 ClustalX V 2.0（Higgins
D.G.）进行多序列比对并查错；采用 PCR扩增效率和
表 1 实验材料信息表
序号 中文名 拉丁名 采集地 凭证标本
1 平塘蜘蛛抱蛋 A. pingtangensis 贵州贵定 071002
2 赤水蜘蛛抱蛋 A. chishuiensis 贵州贵定 0307045
3 伞柱蜘蛛抱蛋 A. fungilliformis 贵州荔波 100920
4 贵州蜘蛛抱蛋 A. guizhouensis 贵州关岭 110602
5 荔波蜘蛛抱蛋 A. liboensis 贵州荔波 090307
6 四川蜘蛛抱蛋 A. sichuanensis 贵州蛤蚌河 活体材料
7 贵州道真 100523
8 贵州开阳紫江地缝 活体材料
9 贵州施秉 100520
10 贵州开阳高寨 活体材料
11 贵州榕江 活体材料
12 贵州沿河 活体材料
13 贵州安龙 活体材料
14 贵州赤水 活体材料
15 丛生蜘蛛抱蛋 A. caespitosa 贵州贵阳 活体材料
16 重庆植物园引种 活体材料
17 带叶蜘蛛抱蛋 A. fasciaria 重庆植物园引种 活体材料
18 广西蜘蛛抱蛋 A. retusa 广西植物园引种 活体材料
19 线叶蜘蛛抱蛋 A. linearifolia 广西植物园引种 活体材料
20 蜡黄蜘蛛抱蛋 A. cerina 广西植物园引种 活体材料
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测定成功率评价各个分子标记的扩增情况；利用
Song等[22]的方法，使用 MEGA 4.0软件计算 K2P距离
值，比较不同标记在种间、种内变异的大小；最后采
用 Ross 等 [23]比对法（即相似性搜索算法 BLAST1）和
最近距离法（Nearest distance）考察标记的鉴定成功
率。
二、结 果
1. PCR扩增和测序效率
PCR 扩增成功率和测序成功率是评价 DNA 分
子标记的一个重要指标。各分子标记序列的 PCR扩
增成功率，以 ITS和 ITS2 最低，为 0，其次是 rbcL，为
95%，matK、psbA -trnH、ps－
bK-psbI 均为 100%；rbcL、
matK、psbA -trnH 和 psbK -
psbI 的测序成功率均为
100%。
2． 序列长度、种内和种
间变异分析
序列长度比较发现，
psbK -psbI 最短，为 394 ~
398 bp，matK 序列最长，为
849~855 bp。通过分析单一
序列种间、种内变异情况
（表 3 和表 4），结果表明
psbK -psbI 的种间变异最
大 ，matK、psbA -trnH、rbcL
序列种间变异依次递减。种
内变异方面，四川蜘蛛抱蛋
种内变异平均值 psbK-psbI、psbA-trnH 和 matK 均较
大，rbcL最小；丛生蜘蛛抱蛋种内变异以 psbA-trnH
最大，psbK-psbI、matK和 rbcL均无变异。
3. 鉴定效率分析
鉴定效率是评价不同分子标记优劣的标准之
一。本文采用比对法和最小距离法评估各标记的鉴
定效率，结果表明（表 5）：通过比对法分析，单一序列
的鉴定成功率以 matK 最高，为 85%，psbK-psbI 次
之，为 65%，psbA-trnH 和 rbcL 均不足 50%；复合序
列的鉴定成功率均较单一序列高，其中 matK+psbK-
psbI 组合序列的鉴定成功率最高，达到 100%；其次
为 matK+psbA-trnH、rbcL+matK、rbcL+psbA-trnH。通
表 2 PCR扩增引物与扩增程序
分子标记 引物名称 序列碱基（5-3） 扩增程序
psbA-trnH fwd PA
rev TH
GTTATGCATGAACGTAATGCTC
CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
94℃ ，5 min；94℃ ，1 min，
55℃，1 min，72℃，1.5 min，30
个循环；72℃，7 min。
matK KIM_3F
KIM_1R
CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG
ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC
94℃，1 min；94℃，30 s，52℃，
20 s，72℃，50 s，35 个循环；
72℃，5 min。
rbcL 1f724r
GTTTCTGTTTGTGGTGACAT
GCTACTGCAGGTACATGCGA
95℃ ，2 min；94℃ ，1 min，
55℃，30 s，72℃，1 min，36 个
循环；72℃，7 min。
psbK-psbI PKPI
CTTGCCAAACAAAGGCTAA
ATGCTTACTCTCAAACTCT
94℃ ，5 min；94℃ ，1 min，
55℃，1 min，72℃，1.5 min，30
个循环；72℃，7 min。
ITS ITS5F
ITS4RITS5
aF
ITS4R
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
TCCTCCGCTTATTGATATGCCCTTAT－
CATTTAGAGGAAGGAG
TCCTCCGCTTATT GATATGC
94℃ ，5 min；94℃ ，1 min，
50℃，1 min，72℃，1.5 min +
3sec/循环，30 个循环；72℃，
7 min。
ITS2 ITS2FITS3R
ATGCGATACTTGGTGTGAAT
GACGCTTCTCCAGAC TACAAT
94℃，5 min；94℃，30 s，56℃，
30 s，72℃，45 s，40 个循环；
72℃，10 min。
表 3 实验数据 4个分子标记种间变异情况
属名
（物种数）
matK
获得序列数/变异率（%）
psbA-trnH
获得序列数/变异率（%）
rbcL
获得序列数/变异率（%）
psbK-psbI
获得序列数/变异率（%）
Aspidistra
（11 spp.）
11/0.2，0.2，0.7，0.4，0.2，0.5，
0.1，0.1，0.1，0.5，0.2，0.7，
0.4，0.2，0.5，0.1，0.1，0.1，
0.5，0.7，0.4，0.2，0.5，0.1，
0.1，0.1，0.5，0.4，0.7，0.2，
0.6，0.6，0.6，0.2，0.4，0.1，
0.2，0.2，0.2，0.1，0.5，0.1，
0.1，0.1，0.5，0.4，0.4，0.4，
0.0，0.0，0.0，0.4，0.0，0.4，0.4
11/0.3，0.0，0.0，0.0，0.0，0.0，
0.0，0.3，0.0，0.5，0.3，0.3，
0.3，0.3，0.3，0.3，0.7，0.3，
0.9，0.0，0.0，0.0，0.0，0.0，
0.3，0.0，0.5，0.0，0.0，0.0，
0.0，0.3，0.0，0.5，0.0，0.0，
0.0，0.3，0.0，0.5，0.0，0.0，
0.3，0.0，0.5，0.0，0.3，0.0，
0.5，0.0，0.3，0.5，0.3，0.3，0.5
10/0.0，0.2，0.0，0.0，0.0，0.2，
0.0，0.0，0.0，0.2，0.0，0.0，
0.0，0.2，0.0，0.0，0.0，0.2，
0.2，0.2，0.3，0.2，0.2，0.2，
0.0，0.0，0.2，0.0，0.0，0.0，
0.0，0.2，0.0，0.0，0.0，0.2，
0.0，0.0，0.0，0.2，0.2，0.2，
0.0，0.0，0.0
11/1.6，1.6，1.3，1.3，1.9，1.1，
1.6，1.3，1.6，1.3，1.1，0.8，
0.8，0.3，1.1，1.1，0.8，0.0，
0.8，0.8，0.8，1.3，1.1，0.5，
0.8，1.1，0.8，0.0，1.1，0.3，
0.8，0.0，0.8，0.0，1.1，0.3，
0.8，0.0，0.8，0.0，1.3，1.3，
1.1，0.3，1.1，1.1，0.3，1.1，
0.3，0.8，1.1，0.8，0.8，0.0，0.8
平均值（%） 0.3 0.2 0.1 0.8
长度（bp） 849~855 587 663 394~398
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表 4 实验数据 4个分子标记种内变异情况
物种名
（样本数）
matK
变异率（%）（平均值）
psbA-trnH
变异率（%）（平均值）
rbcL
变异率（%）（平均值）
psbK-psbI
变异率（%）（平均值）
A.
sichuanensis
(9)
0.7,0.8,0.9,0.5,0.8,0.9,1.2,0.7,
0.1,0.2,0.5,0.1,0.2,0.5,0.2,0.1,
0.6,0.0,0.1,0.4,0.1,0.7,0.1,0.0,
0.5,0.2,0.6,0.7,0.9,0.5,0.1,0.4,
0.1,0.5,0.2,0.5 (0.4)
0.3,0.0,0.0,0.2,0.2,0.2,0.2,0.5,
0.3,0.3,0.2,0.5,0.5,0.5,0.9,0.0,
0.2,0.2,0.2,0.2,0.5,0.2,0.2,0.2,
0.2,0.5,0.3,0.3,0.3,0.7,0.0,0.3,
0.7,0.3,0.7,0.7 (0.3)
0.2,0.2,0.2,0.2,0.2,0.2,0.2,0.2,
0.0,0.0,0.0,0.0,0.0,0.0,0.0,0.0,
0.0,0.0,0.0,0.0,0.0,0.0,0.0,0.0,
0.0,0.0,0.0,0.0,0.0,0.0,0.0,0.0,
0.0,0.0,0.0,0.0 (0.0)
0.8,0.8,0.5,0.5,0.5,0.5,0.8,0.8,
1.0,0.3,0.3,0.8,0.3,0.5,1.0,0.8,
0.8,0.3,0.8,0.5,0.5,0.0,0.5,0.0,
0.3,0.8,0.5,0.0,0.3,0.8,0.5,0.8,
0.3,0.3,0.8,1.0 (0.5)
A. caespitosa
(2) 0.0 (0.0) 0.5 (0.5) 0.0 (0.0) 0.0 (0.0)
过最小距离法也得到同样的结论，但各标记的鉴定
成功率均较比对法低。
三、讨 论
本研究考察 6 个分子标记 rbcL、matK、psbA -
trnH、psbK-psbI、ITS 和 ITS2 对蜘蛛抱蛋属药用植物
的鉴定结果，为鉴定该属药用植物奠定基础。核 ITS
序列由 ITS1、ITS2 和 5.8S 共 3 部分组成，各部分序
列变异差别较大，5.8S 最为保守，ITS1 的识别效果
好于 ITS2[24]，ITS1 由于缺乏通用引物在 DNA 条形码
研究中应用较少，ITS 和 ITS2 在前期研究中均有较
好的 PCR 扩增和测序效率，以及序列变异性 [17，25]，但
本研究中 ITS和 ITS2均扩增失败。由于 GenBank 中
未提交蜘蛛抱蛋属物种的 ITS序列，根据本文研究结
果显示当前报道的 ITS和 ITS2通用引物或反应条件
不适用于该属物种，筛选通用引物和探索合适的反
应条件值得进一步深入研究。matK是植物叶绿体基
因中进化速率较快的一条编码序列，但在不同物种
间引物的通用性有一定差异 [17，20]，本研究应用 CBOL
推荐的 KIM_3F/KIM_1R 引物，matK 的扩增与测序效
率均达到 100%，且其鉴定成功率在单一序列中最
高，为 85%。psbA-trnH片段是进化速率最快的叶绿
体间隔区之一，引物通用性较好，扩增率较高 [26]，本研
究中该片段的扩增成功率为 100%，但其鉴定成功率
较低，只为 45%。rbcL序列具有通用性好、易扩增、易
比对的特点，但该序列的变异主要存在于种以上水
平，物种水平通常变异不够大，在本研究中只有一个
样品未扩增成功，其鉴定成功率在单一序列中最低，
仅 21.1%，该结果与其序列特点相符。psbK-psbI曾被
韩国 Ki-Joong Kim 提出作为植物条形码候选序列
[21]，Lahaye等[27]对 18科 31种 101个植物个体进行检
测，发现 psbK-psbI 鉴定成功率为 98%，当采用
matK+psbK-psbI+atpF-atpH组合时，鉴定成功率达到
100%，本研究中 psbK-psbI 片段的序列获得率为
100%，其鉴定成功率仅为 65%。采用多个 DNA分子
标记组合可以增加单片段的识别率，在一定程度上
可以降低种内变异带来的影响，同时减少种内和种
间变异的重叠[28]。由于单一序列鉴定效率较低，本研
究对不同的序列组合对蜘蛛抱蛋属药用植物物种的
鉴定效率。在 rbcL +psbA -trnH、matK +psbA -trnH、
rbcL+ matK、matK+psbK-psbI组合中，鉴定效率均比
单一序列有所提高，其中 matK+psbK-psbI最高，达到
100%，rbcL+psbA-trnH最低，为 52.6%。
DNA条形码（DNA barcoding）技术是利用一个或
少数几个标准的 DNA 片段作为标记对物种进行快
速、准确和自动化的识别和鉴定的一项新技术 [29]，是
近年来生物分类和鉴定的研究热点。本研究结果显
示，matK和 psbK-psbI的引物通用性较好，序列获得
表 5 比对法和最小距离法分析各个分子标记的鉴定效率
分子标记 鉴定方法 样品数
物种水平鉴定
成功率（%）
matK
比对法 20 85.0
最小距离法 20 55.0
psbA-trnH
比对法 20 45.0
最小距离法 20 45.0
rbcL
比对法 19 21.1
最小距离法 19 15.8
psbK-psbI
比对法 20 65.0
最小距离法 20 45.0
rbcL+matK
比对法 19 84.2
最小距离法 19 63.2
matK+psbA-trnH
比对法 20 90.0
最小距离法 20 80.0
matK+psbK-psbI
比对法 20 100.0
最小距离法 20 85.0
rbcL+psbA-trnH
比对法 19 52.6
最小距离法 19 57.9
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2012 第十四卷 第一期 ★Vol.14 No.1
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率均为 100%，种间变异大于种内变异，两序列组合
的鉴定成功率为 100%，matK+psbK-psbI 适合作为蜘
蛛抱蛋属药用植物鉴定的 DNA分子标记。由于采样
条件的限制，本实验中所涉及的物种主要分布在贵
州，而 GenBank 中的数据较少，无法纳入本实验的分
析，所以该属药用植物 DNA 条形码鉴定有待于进一
步深入研究。
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Molecular Identification of Medicinal Plants in Aspidistra
Liu Anli1, He Shunzhi1, Yao Hui2，Chen Shilin2, Song Jingyuan2
(1. Department of Pharmacy, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002 China;
2. National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Institute of Medicinal Plant
Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)
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世界科学技术—中医药现代化★专题讨论之一：中药资源可持续利用的技术研究
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
（责任编辑：李沙沙 张志华，责任译审：王 瑀）
Abstract: To test the DNA molecular markers (rbcL, matK, psbA-trnH, psbK-psbI, nr ITS and ITS2) to identify
medicinal plants in Aspidistra，the efficiency of PCR amplification and sequencing, intraspecific variation and inter-
specific divergence and identification efficiency were used to evaluate these loci. The results showed that through
analysis of 20 samples of 11 species of Aspidistra, rbcL、matK、psbA-trnH and psbK-psbI had high efficiency of
PCR amplification and sequencing and the success identification rate of matK was the highest (85%) in single se-
quence. The discrimination ability of different sequences was shown higher using the sequence combinations, in
which the success identification rate of matK+psbK-psbI was 100%. Therefore, matK+psbK-psbI could be used to
identify the medicinal plants in Aspidistra.
Key words: DNA molecular markers; Aspidistra; identification; matK+psbK-psbI
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