全 文 ：第 18 卷　第 1 期　　　　　　　　　　　内蒙古民族大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　Vol.18　No.1
2003年 2月　　　　　　　　　　Journal of Inner Mongolia University for Nationalities　　　　　　　　　　Feb.2003
盐胁迫短芒大麦甜菜碱醛脱氢酶
基因片段的克隆与序列分析
白杰英1 ,陆一鸣1 ,庞晓斌2 ,李彦舫1
(1.中国人民解放军军需大学植物基因工程研究中心 ,吉林长春　130062;2.内蒙古民族大学农学院 ,内蒙古 通辽　028042)
摘　要:以 2%NaCl诱导 3～ 6 天的短芒大麦叶片为材料 ,用 TRIzo l试剂提取总 RNA后 ,反转录合成 cDNA ,
用 PCR扩增得到约 600bp 片段 ,将所得序列与GenBank 上已登录的序列进行同源性比较 , 发现它与大麦等作
物的 BADH 基因同源性很高 ,并存在醛脱氢酶的保守十肽区 , 从而证明短芒大麦的耐盐性与小分子渗透物质
的积累有关.
关键词:短芒大麦;盐胁迫;BADH(甜菜碱醛脱氢酶)
中图分类号:Q781　　文献标识码:A　　文章编号:1671-0185(2003)01-0038-04
Cloning and Sequence Analyzing of BADH Gene
in Hordeum brevisubulatum
BAI Jie-ying1 , LU Yi-ming1 ,PANG Xiao-bin2 , LI Yan-fang1
(1.The Research Center of Plant Gene Engineering of Quartermaster University of PLA ,
Changchun 130062 , China;
2.Agriculture College , Inner Mongolia University fo r Nationalities , Tongliao 028042 , China)
Abstract:Total RNA was isolated w ith T RIzol reagent f rom leaves of Hordeum brevisubulatum ,
which was treated wi th 2%NaCl for 3 ～ 6 days.After cDNA synthesized by reverse transcrip-
tion , a f ragment of 600bp was obtained through PCR.Comparison of the nucleotide was perfo rmed
with those repo rted in Genbank , The results showed that it has high homology of the nucleotide
with that of Barley , and there w as a ten peptides conservative region of aldehyde dehydrogenase in
this sequence.All the results suggested that the highly salt-tolerance of Hordeum brevisubulatum is cor-
relative w ith osmotic materials.
Key words:Hordeum brev isubulatum ;Salt-st ress;BADH(betaine aldehyde dehydrogenase)
短芒大麦(Hordeum brev isubulatum)是禾本科大麦属的一种多年生牧草 ,俗称野大麦 ,在我国东北 、
内蒙 、青海 、甘肃及新疆等地有广泛分布.它具有较好的抗寒 、抗旱 、耐盐碱能力 ,而且草质柔软 ,茎叶丰富 ,
营养成份含量高 ,产量较高 ,牲畜喜食 ,除用于放牧 、调制干草外 ,还可在低湿地上种植 ,建立人工草地 ,具
有良好的生产性能及较高的经济价值.笔者从 90年代初就对野大麦进行了一系列的研究 ,通过组织培养
的方法获得了野大麦耐盐突变系〔1〕;利用60Co 物理诱变及化学诱变剂 EMS(甲基磺酸乙酯)处理等方法 ,
通过组织培养和细胞培养筛选出一些耐盐碱的新品系 ,其耐盐能力达到 1.2%〔2〕;在野大麦根尖 、嫩茎 、幼
叶 、幼穗以及原生质体培养方面已有一套成形的技术〔3～ 5〕;另外 ,在分子生物学方面也开展了部分研究并
且相关实验正在进行中〔6〕.在此基础上需对短芒大麦的耐盐碱机理作进一步的探索 ,从而为培养优良的
栽培作物品种提供良好的基因资源.
收稿日期:2002-12-10
作者简介:白杰英(1977-),男 ,山东省德州人 ,在读硕士研究生 ,主要从事植物分子生物学方面的研究.
DOI :10.14045/j.cnki.15-1220.2003.01.011
迄今为止 ,对于植物受非生物胁迫(如干旱 、盐碱等)研究最多的当属小分子物质的积累 ,其中甜菜碱
的研究是最详细的.而甜菜碱合成中的关键酶 BADH(甜菜碱醛脱氢酶)已从山菠菜 、甜菜 、大麦 、水稻 、小
麦等多种作物中得到克隆和鉴定〔7〕 ,不同生物中 BADH 有较高的同源性.笔者根据 BADH 的同源保守区
设计引物 ,从盐胁迫处理的短芒大麦中分离到一个 cDNA 片段 ,并对该基因片段序列进行了分析和比较.
1　材料与方法
1.1　试剂来源
反转录试剂盒购自 Promega 公司.PMD18-T 载体 、各种酶及 DNA 快速纯化试剂盒等均购自鼎国生
物公司.DH5α菌种为本室保存.其它试剂均为国产分析纯.
1.2　植物材料
短芒大麦种子采自吉林省前郭县草原.种子用 0.1%HgCl2 消毒 8 min ,再用蒸馏水冲洗数次 ,室温浸
种 24 h后于 27 ℃暗培养至根长约 2 cm ,转移至光下在 Hoagland营养液中培养.长至两叶一心时 ,用2.0%
NaCl(用 Hoagland营养液配制)进行胁迫处理 ,处理 3 ～ 7 d ,每日剪取叶片 ,用液氮速冻后贮存在-80 ℃
备用.
1.3　总 RNA的提取
取冻存的植物叶片 1 g ,夜氮研磨成粉末 ,加入 10 ml Trizol ,混匀 ,4 ℃12 000 g 离心 10 min ,将上清
移入新管中.室温孵育5 min ,加入2 ml氯仿 ,剧烈震荡 15 s ,室温孵育 2 ～ 3 min ,4 ℃9 000 g 离心 15 min ,
将上层水相转移到一新管中.加入 5 ml异丙醇以沉淀 RNA.室温孵育 10 min.4 ℃10 000 g 离心 10 min.
弃上清 ,用 10 ml 75%乙醇洗沉淀.涡旋震荡混合样品 , 4 ℃7 500 g 离心 5 min.弃上清 ,室温简单干燥
RNA 沉淀 ,溶于 DEPC 处理水中 , 55 ～ 60 ℃温育 10 min.-80 ℃保存备用.
1.4　RT -PCR扩增目的片段
以所提取的总 RNA为模板 ,按 Promega反转录试剂盒说明合成单链 cDNA.根据已发表的几种植物
的 BADH cDNA的同源保守区设计一对引物.
P1:5 , -cctgacgcaggtgctccaatagcttc-3 ,
P2:5 , -ccaagccatag tgcgtatcat t-3 ,
取反转录产物作为 DNA 模板 ,在 50 μl体系中加入下列成分:DNA template 1 μl , 10×PCR buf fer
(Mg2+plug)5μl , dNTP(10 mM)2μl ,P1 1μl ,P2 1μl , Taq酶0.5μl ,ddH2O 39.5μl.扩增条件为:94 ℃45
s , 58 ℃45 s ,72 ℃1 min ,30个循环后 ,72 ℃延伸 10 min.
1.5　目的片段的克隆
取30μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳 ,于长波紫外灯下切下目的片段.用 DNA回收试剂盒回收
该片段.取 5 μl回收产物加入 10 μl连接反应体系中 ,与 pMD18-T Vecto r在 16 ℃连接过夜.于 LB-
Amp
+平板上进行阳性克隆的筛选.将阳性重组子培养后快速提取质粒 ,并用 EcoR I与 Hind Ⅲ双酶切鉴
定.然后将样品送上海基康生物公司测序.
1.6　序列分析与比较
采用 Dnaman软件将获得的 BADH基因进行核苷酸序列分析 ,并与 GenBank 中的数据进行同源性比
较.
2　结果与讨论
2.1　BADH 基因片段的扩增
经过 30个循环后 ,扩增出了目的基因片段 ,PCR产物的电泳结果如图 1.从图 1可以看出 ,扩增出的
片段长度与预计的长度相符 ,约为 600bp.
2.2　重组质粒的酶切鉴定
将重组质粒 DNA用 EcoR I 和Hind Ⅲ酶切 ,酶切图谱如图 2.从图 2可以看出 2条电泳带 ,其中一条
39第 1期　　　　　白杰英等:盐胁迫短芒大麦甜菜碱醛脱氢酶基因片段的克隆与序列分析　　　　　
分子量大的电泳带与载体 pMD18-T 位置相同 ,另一条分子量小的电泳带则位于 Marker的 600bp处 ,且
与 BADH 基因的 PCR产物位置相同.
图 1　PCR扩增产物电泳图
M为 DL2000;1为扩增产物
Figure 1　Idenfication of PCR product by
agarose gel electrophoresis
M:DL2000;1:product of PCR
图 2　质粒酶切电泳图
M为 DL2000;1为酶切结果
Figure 2　Digestion map of recombinant plasmid
with EcoR I and Hind Ⅲ
M:DL2000;1:Result of Digestion with enzyme
2.3　BADH 基因的核苷酸序列分析
测序结果表明 ,该 BADH 基因片段共有 612bp ,其核苷酸与所推导的氨基酸序列如图 3所示.其中存
在一个编码十肽的高度保守序列(VSLELGGKSP),如图中斜黑体部分所示 ,该结构在醛脱氢酶中是十分
保守的 ,因此证明本研究所获得的基因是 BADH 的一部分.与 GenBank上已登录的序列比较 ,其与大麦
BADH 的同源性达到 94%,与其它作物 BADH 的同源性也很高.
1　　　CCTGACGCAGGTGCTCCAATAGCTTCACATCCCCATGTGGA TAAGATTGCTT TTACTGGA
1　　　 P D A G A P I A S H P H V D K I A F T 　G
61 AGTACTGCAACTGGTAAGATGATAATGACCGCTGCTGCCAAATGGTTAAGCCTGTTTCA
21 S T A T G K M I M T A A A Q M V K P V　S
121 TTAGAGCTTGGTGGCAAAAGTCCTCTTGTTATCTTTGATGATGTTGCTGACAT TGACAAA
41 L E L G G K S P L V I F D D V A D I D　K
181 GCTG TTGAATGGGCCATGTT TGGT TGTT TTTTCAATGGCGGTCAAGT TTGCAG TGCAACT
61 A V E W A M F G C F F N G G Q V C S A　T
241 TCTCGTCTACTTCTCCATGAGAAAGTTGCTGCGCGATTTT TAGACAGACTAGTTGAATGG
81 S R L L L H E K V A A R F L D R L V E　W
301 GTAAAAAATA TCAAAATCTCAGACCCACTGGAAGAAGGTTGCAGGCTGGGTTCAGTCATC
101 V K N I K I S D P L E E G C R L G S V　I
361 AGTAAAGGGCAGTATGAGAAGATTAAGAAGTTCATCTCAACAGCAAGGAGTGAAGGTGCT
40　　　　　　　　　　　内　蒙　古　民　族　大　学　学　报 　　　　　　　　　　　2003年
121 S K G Q Y E K I K K F I S T A R S E G　A
421 ACAATTTTGCATA GGGGTGGCCGACCAAAGCATCTTGGAAAAGGGTTCTTCATTGAACCA
141 T I L H R G G R P K H L G K G F F I E　P
481 ACAATTA TAA CAGACGTTAGCACAT CAATGCAAATTTGGAGAGAGGAAGTCTTTGGGCCA
161 T I I T D V S T S M Q I W R E E V F G　P
541 GTCATCTGTGTCAAAGTAT TTAGGACAGAGAGTGAAGCTGTAGAGCTTGCAAATGATACG
181 V I C V K V F R T E S E A V E L A N D　T
601 CACTATGGCTTGG
201 H Y G L
图 3　BADH 基因序列与所推导的氨基酸序列
Figure 3　The sequence of BADH gene and the sequence of
amino acid induced
3　讨论
研究结果表明 ,短芒大麦有较好的盐碱耐受性与细胞内小分子有机物质的积累有关 ,如甜菜碱.这些
分子物质的积累与其生存环境中的盐分浓度有一定的相关性.当环境中的盐浓度增加时 ,催化这些物质形
成的一些酶的活性增加 ,控制这些酶生成的相关基因的表达量也有相当的增长.有文章表明在盐胁迫条件
下 Northern实验证明其 mRNA 转录水平上 BADH 有明显增加〔8〕.笔者的实验初步证实了 BADH 在短芒
大麦中的存在 ,为对其全长进行研究 ,以及对其它植物的转化等相关实验的开展奠定了基础.
参　考　文　献
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〔责任编辑　徐寿军〕
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