全 文 ：中国农业科学 2005,38(7):1300-1305
Scientia Agricultura Sinica

收稿日期：2004-11-05
基金项目：哈尔滨师范大学留学回国人员科研启动项目（041102）、日本文部科学省生物高技术推进计划项目和黑龙江省教育厅海外学人科研资助项
目（1055HQ024）资助
作者简介： 郭长虹（1968-），女，黑龙江哈尔滨人，教授，博士，主要从事植物分子遗传学研究。Tel: 0451-86323437; E-mail: kaku3008@yahoo.com.cn


普通小麦与山羊草叶绿体基因组长度热点突变区
的核苷酸序列分析
郭长虹 1 ，寺地徹 2
（1哈尔滨师范大学生物系，哈尔滨 150080；2京都产业大学工学部生物工学科，日本 京都 603-8055）

摘要：检测了 Ae. speltoides 和 Ae. ovata 叶绿体基因组的一个长度热点突变区的核苷酸序列，并与普通
小麦、四倍体 Ae. crassa 以及 Ae. squarrosa 的相应序列进行了比较分析。从 rbcL 基因的终止密码子到 cemA
基因内的 HindIII 位点，Ae. speltoides 和 Ae. ovata 的核苷酸序列长度分别为 2 808 和 2 810bp。与四倍体
Ae. crassa 的序列相比，在普通小麦和 Ae. speltoides 中各有一个 791 bp 的大片段缺失，在 Ae. ovata 中存在
一个 793 bp 的大片段缺失。Ae. ovata 的缺失片段比普通小麦和 Ae. speltoides 的长 2个碱基，推测 Ae. ovata
的大片段缺失在进化上是独立发生的。Ae. speltoides 的大片段缺失与普通小麦的完全相同，支持 Ae. speltoides
是普通小麦叶绿体基因组供体的假说。除了大片段缺失外，在这个区域还检测到了 7 个插入/缺失和 15 个碱基替
换突变。研究结果表明，这个长度热点突变区的核苷酸序列分析是研究小麦与山羊草叶绿体基因组之间遗传变异
关系的一个非常有效的途径。
关键词：普通小麦; 山羊草; 叶绿体 DNA; 热点突变区; 长度变异

Sequence Analysis of a Hotspot Region in the Chloroplast
Genome of T. aestivum and Aegilops Species
GUO Chang-hong1, Toru Terachi2
(1Department of Biology, Harbin Normal University, Harbin 150080; 2Department of Biotechnology, Faculty of Engineering, Kyoto
Sangyo University, Kyoto 603-8055, Japan)

Abstract: The nucleotide sequences of the hotspot region in the chloroplast genomes were determined in Ae. speltoides and Ae.
ovata, and compared with the corresponding sequences in T. aestivum, Ae. crassa 4× and Ae. squarrosa. The total number of
nucleotides between a stop codon of rbcL gene and a HindIII site in cemA gene were 2 808 and 2 810 bp in Ae. speltoides and Ae.
ovata. Compared with the Ae. crassa 4x, a 791 bp deletion in both of Ae. speltoides and T. aestivum, and a 793 bp deletion in Ae.
ovata were identified, respectively. The deleted segment in Ae. ovata is 2 base (TT) longer than that of T. aestivum and Ae. speltoides.
This result suggests that the deletion in Ae. ovata occurred independently with that of T. aestivum and Ae. Speltoides. The size and
position of a large deletion in Ae. speltoides is identical to that of T. aestivum, this strongly supports the previous conclusion that Ae.
speltoides is a donor species of a chloroplast genome to common wheat. In addition to the large segment deletions, a total of 7
insertion/deletion and 15 substitution mutations were observed in the hotspot region. The results indicate that the sequence analysis
of the hotspot region is a very powerful tool to investigate genetic variations of chloroplast genome in Triticum and Aegilops.
Key words: T. aestivum; Aegilops; Chloroplast DNA; Hotspot region; Length variation

小麦是世界上重要的粮食作物之一，它与近缘属
山羊草之间的遗传变异关系得到了广泛的研究[1~8]。
Ogihara等通过 RFLP分析发现，在二者的叶绿体基因
组中存在着一个长度突变的热点区域（hotspot），即
BamHI 的第二大片段(以下简称为 B2)。它位于 rbcL
与 petA基因之间，在小麦与山羊草的不同种中表现为
7期 郭长虹等：普通小麦与山羊草叶绿体基因组长度热点突变区的核苷酸序列分析 1301
B2l（10.5kb），B2m（10.2kb），B2（9.6kb）和 B2s（9.4kb）
等４种不同的长度类型[4,5]。大多数二倍体山羊草与四
倍体 Ae. crassa 一样拥有最长的 B2l类型，其中包括
Ae. mutica, Ae. sharonensis, 和 Ae. comosa 等。Ae.
caudata和 Ae. squarrosa分别拥有 B2m和 B2s 类型。
值得注意的是，普通小麦与二倍体的 Ae. speltoides以
及四倍体的 Ae. ovata拥有相同的 B2类型[4]。迄今为
止的细胞遗传学及分子遗传学的研究表明，Ae.
speltoides 是普通小麦的细胞质和 B 基因组的最可能
的供体[6,7,9,10~ 13]。所以，Ae. speltoides的 B2片段与普
通小麦的 B2 片段的产生过程是否相同，值得研究。
另一方面，核基因组为 UM0，属于 Polyeides组的 Ae.
ovata 是四倍体种，它为何与普通小麦以及属于
Sitopsis组、核基因组为 S的 Ae. speltoides拥有相同的
B2类型，也是一个有待深入研究的问题。
Ogihara等对 Ae. crassa（B2l），T. aestivum（B2），
和 Ae. squarrosa（B2s）叶绿体基因组的 B2长度热点
突变区进行了序列比较分析，并提出了叶绿体基因组
的大片段缺失产生于由短的正向重复序列中介的分子
内重组的假说[14,15]。但是，对于 Ae. speltoides 和 Ae.
ovata叶绿体基因组 B2片段类型的产生过程却未见报
道。为了进一步弄清普通小麦与山羊草属叶绿体基因
组之间长度变异的分子基础，笔者对 Ae. speltoides和
Ae. ovata的长度突变热点区域（从 rbcL基因的终止密
码到 cemA 基因内 Hind III 位点）进行了测序，并与
T. aestivum（B2）、四倍体 Ae. crassa (B2l)和 Ae.
squarrosa (B2s)叶绿体基因组的相应序列进行了比较
分析[14~16]。为了确证种内是否固定存在这些大片段长
度变异，进而用多个野生山羊草材料对该长度变异进
行了检测。
1 材料与方法
1.1 植物材料
普通小麦中国春（T. aestivum cv. Chinese Spring，
2n=6×）及 4个普通小麦异细胞质系 (speltoides)-CS、
(ovata)-CS、(crassa)-CS和 (squarrosa )-CS被用来调
查种间变异。6个 Ae. speltoides（2n=2×）和 5个 Ae.
ovata（2n=4×）野生山羊草材料被用来调查种内变异
（表 1）。
1.2 DNA 处理和测序分析
用常规方法分离普通小麦异细胞质系的叶绿体
DNA[4]，经 BamH I处理后，回收第二大片段（B2）
并克隆到 pUC119 载体中。进一步将克隆的 B2 片段
用 HindIII/PstI处理后，亚克隆到 pUC119的相关酶切
位点。对每一个被克隆的片段的双链进行测序。用试
剂盒 DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）提取野生山羊草
材料的总 DNA，设计引物 B2/F(5′-TGAGTGTCTACG
TGGTGGAC-3′）和 B2/R（5′-CAAGCGAAGGAGATA

表 1 本研究所使用的植物材料
Table 1 The plant materials used in this study
异细胞质系 Alloplasmic lines
细胞质供体
Cytoplasm donor
材料编号
Code
B2 片段类型
B2 fragment type
细胞核供体
Nuclear donor
缩写
Abbr.
Ae. speltoides（2n=2×） C17 B2 T. aestivum cv. Chinese Spring Spl
Ae. ovata（2n=4×） C31 B2 T. aestivum cv. Chinese Spring Ovt
Ae. crassa（2n=4×） C35 B2L T. aestivum cv. Chinese Spring Crs
Ae. squarrosa（2n=2×） C04 B2s T. aestivum cv. Chinese Spring Sqr
同细胞质系 Euplasmic lines
种
Species
材料编号 1)
Code
原产地
Origin
缩写
Abbr.
Ae. Speltoides (2n=2×) 2228B Turkey Spl1
2229A Turkey Spl2
2231C Turkey Spl3
2238 Turkey Spl4
2239 Turkey Spl5
2241B Turkey Spl6
Ae. ovata（2n=4×） 6006 Jordan Ovt1
6014 Syria Ovt2
6031 Turkey Ovt3
6067 Greece Ovt4
6070 Italy Ovt5
Triticum aestivum（2n=6×） CS China CS
1) 材料编号为 KU编号，更多的信息参考小麦数据库。Hptt://www.shigen.nig.ac.jp/wheat/sheatja.ktml
1) For the accessions with KU number, more information is available at the data base Komugi. hptt://www.shigen.nig.ac.jp/wheat/sheatja.ktml
1302 中 国 农 业 科 学 38卷
GACGG-3′），用 PCR的方法扩增包含从 rbcL基因到
cemA 基因的叶绿体基因组片段。PCR 扩增的条件如
下：94℃变性 1 min，60℃复性 1 min，72℃延长 3 min。
30个循环后，72℃度延长 10 min。PCR反应所使用的
Taq酶和仪器分别为ExTaq DNA polymerase （Takara）
和 system 2400 programmable incubator （ PE
biosystems）。 PCR 产物经 Suprec-02 filter（Takara
Shuzo）精制浓缩后，用于直接测序。测序分析所用的
引物依据普通小麦中国春和 Ae. crassa 4×的序列
（DDBJ accession nos. X62117 和 X62118）设计。测
序分析所使用的试剂盒与仪器分别为 Thermo
sequenase kit(Amersham)与 ALF express autosequencer
或 Quick start kit（Beckman Coulter) 与 CEQ2000
autosequencer。序列分析使用的软件为 GeneWorks和
MacVector（Oxford Molecular Group）。
2 结果与分析
2.1 B2 长度热点突变区的总体结构
使用克隆的叶绿体 DNA 片段，测定了 Ae.
speltoides和 Ae. ovata叶绿体基因组 BamHI第二大片
段（B2）长度热点突变区的核苷酸序列。这些序列登
录在 DDBJ/EMBL/GenBank 数据库中，登录号码为
AB180296和AB180297。从 rbcL基因终止密码到cemA
基因内HindIII位点的核苷酸长度分别为 2 808和 2 810
bp。与普通小麦（DDBJ accession no.AB042230
coordinate 56344～59150）同样，在这一区域存在着
psaI、 ycf4和 cemA等 3个基因，以及一个拟基因 Ψ
rpl23。Ae. speltoides和 Ae. ovata在该区域总体的 A+T
含量为 67.7%，明显高于普通小麦全叶绿体基因组的
A+T 含量（61.7%）。而且，非编码区的 A+T 含量
明显高于编码区的 A+T 含量（表 2）。

表 2 普通小麦和山羊草属植物叶绿体基因组热点突变区的 A+T 含量及变异情况
Table 2 The A+T content and the mutations in the hotspot region of cpDNA observed in the Triticum and Aegilops species
插入/缺失 Insertion/deletion 替换 Substitution 区域
Region
A+T 含量 2)
A+T content
(%)
编号
Code
位置 3）
Position
编号 位置
Code Position
类型 4)
Type
Ψrpl23 62.95 - #1 距开始密码 175 bp 175 bp from start codon Ts
psaI 67.57 - -
ycf4 60.22 距开始密码 264 bp 264 bp from start codon Tv

- #1
#2 距开始密码 478 bp 478 bp from start codon Tv
编码区
Coding region

cemA 66.74 - -
NCR-11) 77.88 #1 rbcL下游 13 bp 13 bp downstream rbcL #1 rbcL下游 62 bp 62 bp downstream rbcL Tv
#2 rbcL下游 230 bp230 bp downstream rbcL
#3 rbcL下游 264 bp264 bp downstream rbcL
#4 rbcL下游 292 bp 292 bp downstream rbcL
#5 rbcL下游 293bp 293 bp downstream rbcL
NCR-2 66.17 #1 rpl23下游 198 bp 198 bp downstream rpl23 #1 psaI下游 237 bp237 bp downstream psaI Tv
#2 rpl23下游 112 bp112 bp downstream rpl23
NCR-3 68.89 - -

NCR-4 69.62 #1 ycf4下游 169 bp169 bp downstream ycf4 #1 ycf4下游 18 bp 18 bp downstream ycf4 Ts
#2 ycf4下游 229 bp229 bp downstream ycf4 #2 ycf4下游 55 bp 55 bp downstream ycf4 Ts
#3 ycf4下游 132 bp 132 bp downstream ycf4 Ts
#4 ycf4下游 212 bp 212 bp downstream ycf4 Ts
#5 cemA上游 172 bp 172 bp upstream cemA Tv
#6 cemA上游 170bp 170 bp upstream cemA Tv
#7 cemA上游 126 bp 126 bp upstream cemA Ts
#8 cemA上游 122bp122 bp upstream cemA Tv
非编码区
Non coding
region

#9 cemA上游 9 bp 9 bp upstream cemA Ts
1) NCR-1指从 rbcL基因的终止密码到 rpl23 基因的起始密码之间的区域。 NCR-2、NCR-3和 NCR-4 分别指 rpl23、psaI和 ycf4基因的终止密码与
psaI、ycf4和 cemA基因的起始密码之间的区域。2) 数值为普通小麦与 4个山羊草叶绿体基因组长度热点突变区的平均值。3) 数据以普通小麦中国
春的核苷酸序列为基准。4) 替换突变的类型是转换(Ts)和颠换(Tv)
1) NCR-1 corresponds to the region between the stop and start codon of rbcL and rpl23 gene. NCR-2, NCR-3, and NCR-4 correspond to the region between the
stop and start codon of rpl23 and psaI, psaI and ycf4, and ycf4 and cemA gene, respectively. 2) Average values of seven cpDNAs of Triticum and Aegilops
species. 3) Numbers correspond to the nucleotide sequence of Triticum aestivum cv. Chinese Spring. 4) The type of substitution is transition (Ts) and
transversion (Tv)
7期 郭长虹等：普通小麦与山羊草叶绿体基因组长度热点突变区的核苷酸序列分析 1303
笔者将所测得的 Ae. speltoides和 Ae. ovata的 B2
长度热点变异区的序列，与普通小麦、四倍体 Ae.
Crassa、Ae. squarrosa 的相应序列进行了比较分析。
发现除了 psaI 和 cemA 基因以及非编码区 psaI～ycf4
以外，在其它编码和非编码区都存在着不同程度的变
异，比如碱基替换、插入／缺失以及小倒位等（表 3）。
2.2 B2 长度热点突变区的长度变异
与最长的 Ae. crassa B2l 片段相比，在 Ae.
speltoides和 Ae. ovata中分别存在 791 bp 和 793 bp的
大片段长度缺失。该缺失所发生的位点与普通小麦的
大片段缺失完全相同，位于Ψrpl23 ～psaI区，缺失片
段 的 两 端 存 在 着 一 对 短 的 正 向 重 复 序 列
“CATTTTTTT”。值得注意的是，Ae. ovata 的缺失
片段比 Ae. speltoides和普通小麦的长 2个碱基（TT），
所以，Ae. ovata在这一位点所保留的片段（CATTTT
TTT）比Ae. speltoides和普通小麦的（CATTTTTTTTT）
短 2个碱基。
除了大片段长度缺失外，在这一区域也检测到 7
个小的（1～8 base）插入／缺失突变（表 3）。其中 5
个是 5～8 bp的多核甘酸插入／缺失，在它们的两边
都存在正向或反向的重复序列。而且，所有的 5～8 bp
的多核甘酸插入／缺失均位于富含 A+T 的区域，如:
rbcL～Ψrpl23 和Ψrpl23～psaI 。
2.3 B2 长度热点突变区的碱基替换突变
在这个区域共检测到有 15个碱基替换突变。其中
在拟基因Ψrpl23 和基因 ycf4各有 2 个，在非编码区
rbcL～Ψrpl23 和Ψrpl23～psaI各有 1个,在非编码区
ycf4～cemA还有 9个。15个碱基替换突变中有 10个
位于非编码区（表 4）。
尽管总体上这个区域的碱基替换突变类型表现为
转换(transition)多于颠换(transversion)（9/6），但在
A+T 含量较高的非编码区 rbcL～Ψ rpl23 和Ψ
rpl23～psaI，碱基替换的类型均为颠换型。而在拟基
因Ψrpl23中检测到的两个碱基替换均为转换型。这说
明高的 A+T含量易于产生颠换型碱基替换，也说明拟
基因Ψrpl23的确保留着某些基因的特性。

表 3 小麦和山羊草叶绿体基因组长度热点突变区的插入/缺失变异
Table 3 Insertion/deletion mutation in the hotspot region of Triticum and Aegilops cpDNAs
rbcL～Ψrpl23 Ψrpl23～psaI ycf4～cemA 种
Species #1 #2 #3 #4 #5 #1 #2 #3 #1 #2
Spl AGAAG - - - 791bp deletion - CAATA - T
Ovt - GTATA - ATGATC 793bp deletion - - T -
CS AGAAG - - - 791bp deletion - CAATA - -
Sqr - - AATAAAA 1053bp deletion - - CAATA - -
Crs - - AATAAAA ATGATC
-
T CAATA 61bp deletion -

表 4 小麦和山羊草叶绿体基因组长度热点突变区的碱基替换突变
Table 4 Base substitutions in the hot-spot region in Triticum and Aegilops cpDNAs
rbcL～Ψrpl23 Ψrpl23 Ψrpl23～psaI ycf4 ycf4～cemA 种
Species #1 #1 #2 #1 #1 #2 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9
Spl
Ovt
CS
Sqr
Crs
A
C
A
C
C
G
G
A
G
G
T
C
C
C
C
-
-
-
T
G
A
G
A
A
A
A
A
A
C
A
G
G
G
A
G
G
A
G
G
G
A
G
G
G
G
C
C
C
T
C
T
A
T
T
T
A
A
A
C
A
T
T
T
C
T
G
T
G
G
G
A
G
A
A
A

2.4 B2 长度热点突变区大片段缺失的种内验证
为了确证在种间检测到的变异（大的长度片段的
缺失）在种内是否固定存在，笔者进一步选择了 6个
Ae. speltoides和 5个 Ae. ovata野生个体，对其长度变
异区进行了测序。结果表明，所有的山羊草个体，其
大的长度片段的缺失无论是缺失位点，还是缺失长度
均完全相同。这说明该大的长度片段缺失在种内是固
定存在的。另外还发现，rbcL基因下游的茎-环结构区
存在着非常大的变异。其中，茎部序列由一对 17bp
的反向重复序列构成，在普通小麦和 5个山羊草种中
完全相同。但环部序列却存在相当大的变异。而且，
该变异不仅存在于种间，也存在于种内（数据未发表）。
3 讨论
限制性片段分析表明，Ae. Ovata、Ae. speltoides
和普通小麦拥有相同的 B2 片段（9.6kb）[4]，由于二
1304 中 国 农 业 科 学 38卷
倍体的 Ae. speltoides属于 Sitopsis组，而四倍体的 Ae.
ovata属于 Polyeides组，所以很难因此把 Ae. speltoides
确定为的 Ae. ovata的母本供体。那么二者的 B2片段
是否真的完全相同？本研究的结果表明，Ae. ovata的
大片段缺失与 Ae. speltoides及普通小麦发生在相同的
位点，但 Ae. ovata 的缺失却长出 2 个碱基。Ogihara
使用异细胞质系材料调查了 Ae. ovata的缺失（Del4）,
他们的结果比我们的要短 2个碱基。为避免试验误差，
笔者进一步选择了 5 个来源于不同地区的野生 Ae.
ovata材料进行验证，结果该大片段缺失在种内完全一
致，即比普通小麦及 Ae. speltoides的长出 2个碱基。
Ogihara和 Tsunewaki用 13种限制性内切酶，将小麦
属和山羊草属的 42 个品系的叶绿体 DNA 分成 17 个
类型。Ae. ovata的叶绿体 DNA的类型为 6，与属于类
型 3的 Ae. umbellulata和属于类型 4的 Ae. mutica亲
缘关系最近[5]。Wang等通过 PCR-SSCP技术对 46个
小麦属和山羊草属品系的 14 kb叶绿体基因组区域和
13.7 kb线粒体基因组区域进行了分析，认为Ae. mutica
是 Ae. ovata最可能的二倍体祖先[7]。由于 Ae. ovata与
Ae. speltoides的亲缘关系较远，与 Ae. mutica的亲缘
关系较近，而 Ae. mutica与四倍体 Ae. crassa一样拥有
最长的 B2l类型。根据本研究的序列分析结果推测，
Ae. ovata的 B2片段与普通小麦及 Ae. speltoides的 B2
片段是分别从比较古老的二倍体山羊草 Ae. mutica进
化而来的。由于这个大片段缺失在种内固定存在，它
也可以作为辨别 Ae. ovata的分子标记。
Ae. speltoides的大片段缺失，无论是位点，还是
长度均与普通小麦完全相同。这一结果也在所有 6个
野生 Ae. speltoides材料得到了验证。表明普通小麦的
B2片段很可能起源于 Ae. speltoides。同时，这一结果
也支持 Ae. speltoides是普通小麦叶绿体基因组的供体
的假说[6,7,12]。
在 ycf4基因内检测到 2个碱基替换，其中在 Ae.
ovata 中(+264)的 A/G 转换是同义突变，但在 Ae.
Squarrosa(+478)中的 A/C颠换则是非同义突变，推测
的氨基酸将由赖氨酸变为谷氨酸。ycf4 是调控光系统
I 复合体的装配和稳定的关键基因之一[18]，该氨基酸
的改变是否会影响其功能，有待于进一步的研究。
一般来说，叶绿体基因组长度突变的主要类型是
单核苷酸插入/缺失[18]，但在该长度热点突变区域，除
了茎-环结构区外，检测到的 9 个插入/缺失突变中仅
有 3个是单核苷酸类型，其余为 5～8碱基的类型或大
片段缺失。值得注意的是，所有的多核苷酸插入/缺失
均发生在富含 A+T 的非编码区，表明多核苷酸插入/
缺失与高的 A+T 含量密切相关[19]。在最长的 Ae.
crassa(B2l)，发生大片段缺失位点的两端存在一对短
的正向重复序列“CATTTTTTT”，支持 Ogihara等提
出的叶绿体基因组的大片段缺失产生于由短的正向重
复序列中介的分子内重组的假说[14,15]。
4 结论
虽然 RFLP 分析是研究普通小麦与近缘属山羊草
之间遗传变异关系的最常用的方法，但这一技术对于
序列比较保守的叶绿体 DNA并不十分有效[7,21,22]。本
研究通过对叶绿体基因组的 B2 长度热点突变区的核
苷酸序列进行直接测定和比较，揭示出：（1）普通小
麦的 B2片段可能起源于 Ae. speltoides；（2）Ae. ovata
的B2片段与普通小麦及 Ae. speltoides的B2片段在起
源上可能是独立发生的；（3）叶绿体基因组的大片段
缺失可能产生于短正向重复序列中介的分子内重组；
（4）特定热点突变区的核苷酸序列比较分析是研究近
缘种属叶绿体基因组遗传变异关系的一个有效途径。

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(责任编辑 王 芳)